Микроинъекция ооцитов мыши обычно используется как для классического трансгенеза ( т. Е. Для случайной интеграции трансгенов), так и для CRISPR-опосредованного гена. В этом протоколе рассматриваются последние разработки в области микроинъекции с особым акцентом на стратегии контроля качества и генотипирования.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Генерация генетически модифицированных мышей посредством микроинъекции ооцитов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Использование генетически модифицированных мышей значительно способствовало исследованиям как физиологических, так и патологических процессов in vivo . Пронуклеарная инъекция конструкций экспрессии ДНК в оплодотворенные ооциты остается наиболее часто используемым методом для генерации трансгенных мышей для сверхэкспрессии. С внедрением технологии CRISPR для нацеливания генов пронуклеарная инъекция в оплодотворенные ооциты была распространена на генерацию мышей с нокаутом и нокаутом. В этой работе описывается подготовка ДНК для инъекций и подготовка руководств CRISPR для ориентации генов с особым акцентом на контроль качества. Процедуры генотипирования, необходимые для идентификации потенциальных основателей, имеют решающее значение. Здесь представлены инновационные стратегии генотипирования, которые используют преимущества «мультиплексирования» CRISPR. Также описаны хирургические процедуры. Вместе этапы протокола позволят генерировать генерациюЭтически модифицированных мышей и для последующего создания колоний мыши для множества областей исследований, включая иммунологию, нейронауку, рак, физиологию, развитие и другие.
Введение
Модели животных, как у позвоночных, так и у беспозвоночных, сыграли важную роль в изучении патофизиологии состояний человека, таких как болезнь Альцгеймера 1 , 2 . Они также являются бесценными инструментами для поиска модификаторов болезни и в конечном итоге разрабатывают новые стратегии лечения в надежде на лечение. Хотя каждая модель имеет внутренние ограничения, использование животных как целых системных моделей жизненно важно для биомедицинских исследований. Это связано с тем, что метаболическая и сложная физиологическая среда не может быть полностью смоделирована в культуре тканей.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры были одобрены Комитетом по уходу за животными и этикой Университета Нового Южного Уэльса.
1. Получение трансгена (случайная интеграция)
- Аналитический агарозный гель-электрофорез.
- Дайджест плазмиды для извлечения трансгена с использованием соответствующих ферментов (инкубация 1 ч) или ферментов с быстрым перевариванием (инкубация с 15-30 мин) в термоциклере в соответствии с рекомендациями производителя (см . Рисунок 2А и его легенда).
- Вливают 1% агарозный гель трис-ацетат-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (ТЭА), окрашенный 0,5-1,0 мкг / мл эти....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Ниже описаны рабочие процессы для микроинъекции в случае случайного интегрирования и нацеливания на CRISPR-ген ( Рисунок 1 ).
Рисунок 1: Типичный рабочий процесс для генерации генетически модифицированных мышей. Для случайного интегрирования очищенный трансген вводится в пронуклеус оплодотво.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Критические шаги в протоколе
Известно, что генерация генетически модифицированных мышей технически сложна. Однако представленный здесь протокол представляет собой оптимизированный и упрощенный метод, позволяющий осваивать и устранять эту технику в рекордные сроки. Для успешного завершения методики необходимо выполнить два шага. Во-первых, синтез линейных шаблонов ДНК (для синтеза sgRNAs) может быть достигнут без хлорида магния (MgCl 2 ). Тем не менее, настоятельно рекомендуется систе.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы предоставляют услуги академического трансгенеза у мышей через аналитический центр Университета Нового Южного Уэльса Марк Уэйнрайт.
Благодарности
Авторы выражают благодарность персоналу животного объекта (BRC) за их постоянную поддержку. Эта работа финансировалась Национальным советом по здравоохранению и медицинским исследованиям и Австралийским исследовательским советом.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Микропипетка 0,1-2,5 мкм; L | Eppendorf | 4920000016 | |
| Микропипетка 2 - 20 шт; L | Eppendorf | 4920000040 | |
| Микропипетка 20 - 200 μ L | Eppendorf | 4920000067 | |
| Micropipette 100 - 1 000 L | Eppendorf | 4920000083 | |
| Маркер молекулярной массы | Bioline | BIO-33025 | HyperLadder 1 kb |
| Маркер молекулярной массы | Bioline | BIO-33056 | HyperLadder 100 bp |
| Agarose | Bioline | BIO-41025 | |
| EDTA буфер | Sigma-Aldrich | 93296 | 10x - Разбавить до 1x |
| Бромид этида | Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| SYBR Safe гель морилка | Invitrogen | S33102 | |
| Набор для экстракции геля | Qiagen | 28706 | |
| Набор для очистки ПЦР (Qiaquick) | Qiagen | 28106 | |
| Вакуумная система (коллектор) | Promega | A7231 | |
| Буфер для микроинъекций без нуклеазы | Millipore | MR-095-10F | |
| Ultrafree-MC | Millipore | UFC30GV00 | |
| мРНК Cas9 | Sigma-Aldrich | CAS9MRNA | |
| CRISPR экспрессирующая плазмида (px330) | Addgene | 42230 | |
| Нуклеаза свободная вода | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Phusion полимераза | New England Biolabs | M0530L | |
| T7 Quick High Yield RNA kit | New England Biolabs | E2050S | |
| Спин-колонки для очистки РНК (NucAway) | Thermo Fisher Scientific | AM10070 | |
| ssOligos | Sigma-Aldrich | OLIGO STANDARD | |
| Донорская плазмида | Thermo Fisher Scientific | GeneArt | |
| Гиалуронидаза | Sigma-Aldrich | H3884 | |
| KSOMaa среда для культивирования эмбрионов | Zenith Biotech | ЗЭКС-100 | |
| Минеральное масло | Zenith Biotech | ZSCO-100 | |
| M2 Medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Цитохалазин B | Sigma-Aldrich | C6762 | |
| Мундштук | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| Стеклянные микрокапилляры | Sutter Instrument | BF100-78-10 | |
| Протеиназа K | Апплименем | A3830.0100 | |
| Dumont #5 щипцы | Инструменты для изобразительной науки | 91150-20 | |
| Ножницы для ирисов | Инструменты для тонкой науки | 91460-11 | |
| Хомут для сосудов | Fine Science Tools | 18374-43 | |
| Зажимы для ран | Инструменты для изобразительной науки | 12040-01 | |
| Аппликатор зажимов | Инструменты для изобразительной науки | 12018-12 | |
| Микроножницы | Инструменты для изобразительной науки | 15000-03 | |
| Прижигатель | тонких научных инструментов | 18000-00 | |
| Нерассасывающиеся хирургические шовные материалы (Ethilon 3-0) | Ethicon | 1691H | |
| 5% CO2 инкубатор | MG Scientific | Galaxy 14S | |
| Спектрофотометр | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000c | |
| Термоциклер | Eppendorf | 6321 000.515 | |
| Установка для электрофореза | BioRad | 1640300 | |
| УФ-трансиллюминатор | BioRad | 1708110EDU | |
| Термоамплификатор | Eppendorf | 6334000069 | |
| Стереоскопический микроскоп | Olympus | SZX7 | |
| Инвертированный микроскоп | Olympus | IX71 | |
| 2x Микроманипуляторы | Eppendorf | 5188000.012 | |
| Ооциты манипулятор | Eppendorf | 5176000.025 | |
| Микроинъектор (Фемтоджет) | Eppendorf | 5247000.013 | |
| Мыши C57BL/6J штамм | Australian BioResources | C57BL/6JAusb |
Ссылки
- Ittner, L. M. Dendritic function of tau mediates amyloid-beta toxicity in Alzheimer's disease mouse models. Cell. 142 (3), 387-397 (2010).
- Ittner, A. Site-specific phosphorylation of tau inhibits amyloid-beta toxicity in Alzheimer's mice. ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
