Method Article

Анализ белково-белковых взаимодействий и ко-локализация между компонентами разрывов, затянутых и адгезивных соединений в молочных железах мышей

DOI:

10.3791/55772

⸱

May 30th, 2017

 , 
1INRS, Institut Armand-Frappier, 2Biomed, UQAM

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Межклеточные соединения являются реквизитами для специфических функций и развития молочной железы. В этой рукописи содержится подробный протокол изучения белково-белковых взаимодействий (ИЦП) и совместной локализации с использованием мышиных молочных желез. Эти методы позволяют исследовать динамику физической связи между межклеточными переходами на разных стадиях развития.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клеточные клетки играют ключевую роль в сохранении целостности тканей и барьера между различными отделениями молочной железы. Эти взаимодействия обеспечивают взаимодействующие белки, которые образуют нексусы между соседними клетками. Неправильная локализация белка и снижение физических ассоциаций с их партнерами по связыванию могут привести к потере функции и, следовательно, к дисфункции органов. Таким образом, идентификация локализации белка и белково-белковых взаимодействий (ИЦП) в нормальных и связанных с заболеванием тканях имеет важное значение для поиска новых доказательств и механизмов, ведущих к прогрессированию заболеваний или изменений в статусе развития. Эта рукопись представляет собой двухэтапный метод оценки ИПП в мышечных молочных железах. В разделе 1 протокола описывается способ проведения совместной иммунофлуоресценции (co-IF) с использованием антител, выращенных против представляющих интерес белков, с последующими вторичными антителами, меченными флуорохромами. Хотя со-IF всеДля демонстрации близости белков, это позволяет изучать их физические взаимодействия. Поэтому подробный протокол для совместного иммунопреципитации (со-IP) предоставляется в разделе 2 протокола. Этот метод используется для определения физических взаимодействий между белками, не подтверждая, являются ли эти взаимодействия прямыми или косвенными. В последние несколько лет методы совместного ИФ и со-IP продемонстрировали, что некоторые компоненты межклеточных соединений совместно локализуются и взаимодействуют друг с другом, создавая сценические взаимосвязи, которые изменяются в процессе развития молочной железы.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рост и развитие молочной железы происходит в основном после рождения. Этот орган постоянно реконструируется в течение всей репродуктивной жизни млекопитающего 1 . Эпителий молочной железы взрослых состоит из внутреннего слоя эпителиальных клеток просвета и внешнего слоя базальных клеток, в основном состоящих из миоэпителиальных клеток, окруженных подвальной мембраной 2 . Для хорошего обзора структуры и развития молочной железы читатель может обратиться к Sternlicht 1 . Для нормального развития и функции железы 1 , 3 , 4 , 5 , 6 необходимы клеточные взаимодействия через щелевые (GJ), тесные (TJ) и адгезивные (AJ) переходы. Основными компонентами этих соединений в мышечной молочной железе являются Cx26, Cx30, Cx32 и Cx43 (GJ); Claudin-1, -3, -4 и -7 иZO-1 (TJ); И E-кадгерин, P-кадгерин и β-катенин (AJ) 7,8 . Уровни экспрессии этих различных белков-мишеней изменяются в зависимости от стадии в процессе развития молочной железы, что предполагает дифференциальное взаимодействие клеток с клетками 9 . GJ, TJ и AJ связаны структурно и функционально и связывают другие структурные или регуляторные белки с соседними сайтами соседних клеток, создавая, таким образом, функциональную связь 10 . Состав соединительной связи может влиять на мостик с основным цитоскелетом, а также на проницаемость и стабильность связи и может, следовательно, влиять на функцию железы 8 , 9 , 10 , 11 . Компоненты межклеточных соединений, находящихся в узловых связях или взаимодействующих друг с другом при разныхНедавно были проанализированы первые стадии развития развития молочной железы с использованием совместной иммунофлуоресценции (co-IF) и совместного иммунопреципитации (со-IP) 9 . В то время как другие методы позволяют оценить функциональную связь между белками, эти методы не представлены в этой рукописи.

Поскольку белки действуют только один, чтобы работать, изучение белково-белковых взаимодействий (ИЦП), таких как трансдукция сигналов и биохимические каскады, важно для многих исследователей и может предоставить значительную информацию о функции белков. Co-IF и микроскопический анализ помогают оценить несколько белков, которые разделяют одно и то же субклеточное пространство. Однако количество мишеней ограничено антителами, которые должны быть выращены у разных животных, а также доступом к конфокальному микроскопу, оснащенному различными лазерными волнами длины и спектральным детектором для мультиплексирования. Co-IP подтверждает или показывает физическое взаимодействие с высоким сродством betwEen два или более белка, находящихся в белковом комплексе. Несмотря на разработку новых методов, таких как флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) 12 и анализ лигирования близости (PLA) 13 , который может одновременно обнаруживать локализацию и взаимодействие белков, со-IP остается подходящим и доступным методом для изучения взаимодействий между Эндогенных белков.

Пошаговый метод, описанный в этой рукописи, облегчит изучение локализации белка и ИЦП и укажет на ловушки, чтобы избежать изучения эндогенных ИЦП в молочных железах. Методология начинается с представления различных процедур консервации тканей, необходимых для каждого метода. В части 1 показано, как изучать совместную локализацию белка в три этапа: i) секционирование молочных желез, ii) двойную или тройную маркировку различных белков с использованием метода co-IF, и iii) визуализациюЛокализация белка. В части 2 показано, как осадить эндогенный белок и идентифицировать его взаимодействующие белки в три этапа: i) препарат лизата, ii) иммунопреципитацию непрямого белка и iii) идентификацию связывающего партнера с помощью SDS-PAGE и Вестерн-блоттинга. Каждый шаг этого протокола оптимизирован для тканей молочной железы грызунов и генерирует высококачественные, специфичные и воспроизводимые результаты. Этот протокол также может быть использован в качестве отправной точки для исследований PPI в других тканях или клеточных линиях.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все протоколы животных, используемые в этом исследовании, были одобрены Комитетом по уходу за животными в университете (INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, Canada).

1. Идентификация ко-локализации белка

  1. От ткани до микроскопических слайдов
    ПРИМЕЧАНИЕ. Ткани и секции следует обрабатывать на сухом льду.
    1. Акцизируйте молочные железы у животного (полное описание этой процедуры см. Plante et al. ). 14 .
    2. Вставьте вырезанную ткань в морозильную / крепежную среду на сухом льду. Добавьте достаточно среды, чтобы покрыть железу. Когда среда затвердевает, переносите ткани в морозильную камеру при -80 ° C для последующего использования. 9 .
    3. Используя криомикротома, установленную при ≤ -35 ​​° C, разрежьте ткани в секции толщиной 7-10 мкм и поместите их на слайды микроскопа.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Если возможно, поместите две секции на каждый слайд; Левая часть будет использоваться какНапример, для проверки специфичности антител и аутофлуоресценции ткани, тогда как правая сторона будет мечены антителами.
    4. Держите секции при -80 ° C для последующего использования.
  2. Краска Co-IF
    1. Извлеките подходящие микроскопические слайды из морозильника и сразу же зафиксируйте секции, погрузив их в формальдегид 4% в течение 15 мин при комнатной температуре (RT).
    2. Затем погрузите слайды в забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) при комнатной температуре. Оставьте слайды в PBS при RT до перехода к следующему шагу.
    3. Обведите кружочком каждую секцию слайда, используя коммерчески доступный гидрофобный барьер или водоотталкивающее лабораторное перо (см. Таблицу материалов ). Будьте осторожны, чтобы не коснуться ткани. Сразу же добавьте капли PBS в ткань и поместите слайд во влажную гистологическую камеру на оставшуюся часть процедуры.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Секции тканей должны оставаться увлажненными. альтернативаИспользуйте коробку с крышкой и поместите влажные бумажные полотенца на дно.
    4. Заблокируйте каждую секцию ткани 100-200 мкл 3% -ного буфера для сывороточного альбумина (BSA) -Tris-забуференного (TBS) -0,1% полисорбата 20 (см. Таблицу материалов ) в течение 30 минут при комнатной температуре . В то время как образцы блокируют, подготавливают первичные и вторичные растворы антител путем разбавления антител в TBS-0,1% полисорбате 20.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Требуемая концентрация для антитела предоставляется изготовителем; См. Таблицу материалов и рисунки 1 и 2 для примеров, а также Dianati et al. 9 . Хотя нет необходимости работать в темноте при использовании большинства конъюгированных с флуорофором антител, избегайте подвергать растворы антител или окрашенные ткани интенсивному яркому свету.
    5. Удалите блокирующий раствор путем аспирации и инкубируйте секции в 100-200 мкл разбавленного первичного антитела в течение 60 мин при комнатной температуре. AlternativelY, инкубируют с первичным антителом в течение ночи при 4 ° C.
    6. Удалите исходный раствор антитела путем аспирации и промойте секции 250-500 мкл TBS-0,1% полисорбата 20 в течение 5 мин. Удалите промывочный раствор путем аспирации и дважды повторите промывку.
    7. Удалите промывочный раствор путем аспирации и инкубируйте секции со 100-200 мкл подходящего вторичного антитела, конъюгированного с флуорофором, в течение 60 мин при комнатной температуре.
    8. Удалите раствор вторичного антитела путем аспирации и промойте секции 250-500 мкл TBS-0,1% полисорбата 20 в течение 5 мин. Удалите промывочный раствор и повторите дважды.
    9. Повторите шаг 2.5-2.8 с использованием соответствующей комбинации первичных и вторичных антител для последующего белка (ов), представляющих интерес.
    10. Удаляют промывочный раствор путем аспирации и проводят окрашивание ядер путем инкубации секции с 100-200 мкл 4 мг, 4-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) 1 мг / мл в TBS-0,1% полисорбате 20 в течение 5 мин приRT.
    11. Удалите раствор DAPI путем аспирации и смонтируйте слайды с использованием водорастворимой, не флуоресцирующей монтажной среды (см. Таблицу материалов ) и покровных. Выполните одно слайд за раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Инкубация пятна ядра более 5 мин не изменит интенсивность окрашивания. Альтернативно, удалите раствор DAPI на всех слайдах и инкубируйте ткани в PBS при установке слайдов.
    12. Поместите слайды в холодильник с температурой 4 ° C не менее 8 часов. Перейдите к флуоресцентной микроскопической визуализации (см. Рисунки 1 и 2 ).
  3. Микроскопическое изображение
    1. Визуализируйте вторичные антитела, конъюгированные с флуорофорами, с использованием конфокального микроскопа, оборудованного различными лазерами, необходимыми для возбуждения флуорофоров на их конкретных длинах волн.
      Примечание. Чтобы иметь возможность визуализировать каналы и альвеолы, предлагается объектив 40X с числовой апертурой 0,95. ПримерE конкретных настроек приведена на рисунке 1 .
    2. Проверьте локализацию каждого белка индивидуально, сканируя изображение на одну длину волны в то время.
      Примечание. На этом этапе важно критически проанализировать локализацию соединительных белков. Чтобы иметь возможность образовывать узловые связи, эти белки должны локализоваться на плазматической мембране.
    3. Определите совместную локализацию белков путем слияния изображений, отсканированных с лазерами на разных длинах волн.
      Примечание. Совместная локализация белка может быть визуализирована путем изменения цвета в результате выброса двух или более флуорофоров в одном месте и может быть измерена с использованием соответствующего программного обеспечения ( рис. 1 и 2, а также см. Ссылку 9).

2. Изучение ИЦП

ПРИМЕЧАНИЕ. Брюшные молочные железы должны использоваться для изучения ИЦП, поскольку грудные железы находятся в тесной связи с грудныммышцы. Акцизируйте молочные железы (для полного описания этой процедуры, см. Plante et al .) 14 и держите их при -80 ° C для последующего использования.

  1. Подготовка лизата
    1. Поместите взвешивающую бумагу и 2 мл микроцентрифужные пробирки на сухой лед, чтобы предварительно охладить их, прежде чем приступать к следующим шагам.
    2. Возьмите ткань молочной железы с -80 ° C и держите их на сухом льду.
    3. Взвесьте ткани на предварительно охлажденную взвешивающую бумагу, а затем перенесите ткань в 2 мл микроцентрифужные пробирки (ручка на сухом льду). Используйте от 50 до 100 мг ткани на образец. Держите ткань на сухом льду до стадии 2.1.5.
    4. Подготовьте необходимое количество тройного моющего лизисного буфера, дополненного NaF, NaVO 3 и ингибитором протеазы / фосфатазы, как указано в таблице материалов , с использованием следующих формул. Мыши: требуемый буфер (мкл) = масса мышиной массы (мг) х 3; Крыса: требуетсяБуфер (мкл) = масса ткани крысы (мг) х 5.
    5. Добавьте необходимое количество ледяного буфера для лизиса (рассчитанное на этапе 2.1.4) в пробирку объемом 2 мл, содержащую ткань.
      ПРИМЕЧАНИЕ. На этапах 2.1.5-2.1.6 приступайте к одной пробирке за раз.
    6. Гомогенизируйте ткань в течение 30-40 с, используя непрерывную гомогенизацию на тканевой мельнице; Всегда держите трубку на льду. Настройте гомогенизатор ткани на среднюю скорость и осторожно перемещайте мясорубку вверх и вниз внутри трубки.
    7. Повторите шаги 1.6 и 1.7 с другими пробирками.
    8. Инкубируйте лизаты на льду в течение 10-30 мин.
    9. Центрифугируйте пробирки при 170 × g в течение 10 мин при 4 ° C.
    10. Между тем, идентифицируйте 6-10 микроцентрифужных пробирок (0,6 мл) для каждого образца и держите их на льду.
    11. После центрифугирования проверьте трубы. Убедитесь, что они содержат верхний слой жировых, прозрачных, желто-розовых лизатов (в зависимости от стадии разработки) и гранулы.
    12. Создайте отверстие в липидном слоеИспользуя наконечник пипетки 200 мкл для доступа к жидкой фазе. Измените наконечник и собирайте лизат, не нарушая осадок или не аспирируя липидный слой. Выровняйте лизат в предварительно меченых пробирках на льду (шаг 2.1.11) и храните их при -80 ° C.
    13. Используйте аликвоту для количественной оценки концентрации белка с использованием соответствующего коммерчески доступного набора (см. Таблицу материалов ).
  2. Косвенная иммунопреципитация
    1. На льду оттаивают две аликвоты общего лизата молочной железы, приготовленные ранее.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Одна аликвота будет использоваться для IP целевого белка, тогда как другая будет служить отрицательным контролем.
    2. Соберите 500-1000 мкг лизата и разбавьте его в PBS, чтобы достичь конечного объема 200 мкл в каждой пробирке 1,5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Количество используемого лизата зависит от обилия интересующего белка и эффективности антитела (см . Рисунок 3 дляN пример, а также таблица материалов ). Для оптимизации каждой мишени следует использовать различные количества лизата ( то есть 500, 750 и 1000 мкг) и антитела ( то есть 5, 10 и 20 мкг). Выполните следующие шаги (2.2.3-2.3.7.4).
    3. Добавьте антитело против интересующего антигена к первой трубке лизата и держите его на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Требуемая сумма обычно предлагается в инструкциях каждой компании (см . Таблицу ).
    4. Во второй трубке подготавливают отрицательный контроль, добавляя ту же концентрацию изотипа IgG в качестве антитела, используемого на этапе 2.2.3.
    5. Инкубируйте трубки в течение ночи при 4 ° С на трубчатом роликовом смесителе с низкой скоростью.
    6. На следующий день добавьте 50 мкл магнитных шариков в новые 1,5 мл пробирки для предварительной стирки.
      1. Выбирайте магнитные бусины Protein A или Protein G на основе относительной аффинности к антителу.
      2. Важно избегать использования агрегированных гранул; Осторожно смешайте суспензию шариков, пока она не будет равномерно перемотана перед добавлением ее в пробирки.
    7. Поместите трубки, содержащие шарики, на магнитную подставку и позвольте гранулам мигрировать к магниту. Удалите буфер хранения из бусинок с помощью пипетки 200 мкл.
    8. Вымойте гранулы, добавив 500 мкл PBS-0,1% полисорбата 20 и энергично встряхивайте пробирки в течение 10 с.
    9. Поместите трубки обратно на магнитную подставку и позвольте шарикам мигрировать к магниту.
    10. Удалите избыточный промывочный буфер пипетированием пипеткой 200 мкл.
    11. Добавьте реакционный комплекс (лизат-антитело) из стадии 2.2.5 к гранулам и инкубируйте в течение 90 мин при комнатной температуре на роликовом смесителе.
    12. Поместите трубки на магнитную подставку и позвольте шарикам мигрировать к магниту. Используя пипетку 200 мкл, аспирируйте и отбросьте лизат и поместите трубки на лед.
    13. Вымойте шарикС добавлением 500 мкл PBS, помещения труб на магнитную подставку и удаления жидкости с использованием пипетки 200 мкл. Повторите эту операцию стирки. Во время стирки избегайте завихрения и держите образцы на льду.
    14. Вымойте гранулы один раз с помощью полисорбата 20 PBS-0,1% без завихрения и отбросьте последний промывочный буфер, используя наконечник пипетки 200 мкл.
    15. Для элюирования добавьте 20 мкл 0,2 М кислого глицина (pH = 2,5) в пробирки и встряхните их в течение 7 минут на роликовом смесителе.
    16. Центрифуга на высокой скорости в течение нескольких секунд (быстрое вращение) и собирать супернатант в свежей ледяной пробирке.
    17. Повторите шаги 2.2.14 и 2.2.15 для каждой трубки.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Конечный объем будет составлять 40 мкл.
    18. Добавить 10 мкл 4x буфера Laemmli в 40-литровый элюированный образец с этапа 2.2.16.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Цвет станет желтым из-за кислотного рН.
    19. Сразу же добавьте 1 М Трис (pH = 8), по одной капле за раз, к элюированному образцу с этапа 2.2.18 до его цветаСтановится синим. Перейдите к следующим пробиркам.
    20. Кипятите образцы с этапа 2.2.18 при 70-90 ° С в течение 10 мин. Немедленно приступить к гелевому электрофорезу. В качестве альтернативы, перенесите образцы в морозильную камеру при -80 ° C до загрузки.
  3. Нижеследующее применение: гель-электрофорез, затем вестерн-блот
    1. Подготовьте отделение и укладку акриламидных гелей SDS-PAGE (толщина 1,5 мм) в соответствии со стандартными процедурами 15 .
      ПРИМЕЧАНИЕ. Выбор геля (8-15% акриламида, градиент: см. Таблицу материалов ) должен определяться на основе молекулярного размера осаждаемого белка и анализируемых потенциальных партнеров связывания. Эти белки должны быть разрешены друг от друга, чтобы обеспечить надлежащее иммунодетекцию.
    2. Оттепель образцов с иммунопреципитацией (IP) (шаг 2.2.20) на льду.
    3. Подготовьте белковые лизаты из одних и тех же образцов (используется для процедуры IP выше). Использовать 50Мкг общего лизата и добавить буфер образца образца 4X Laemmli. Кипятите образцы при 70-90 ° С в течение 5 мин и поместите на лед до загрузки.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Эти образцы будут загружены рядом с элюированным образцом IP, чтобы продемонстрировать присутствие осажденных белков в общем лизате.
    4. Загрузите подготовленные лизаты из стадии 2.3.3 и осажденные образцы из стадии 2.2.20 бок о бок в акриламидном геле и запустите их в бегущем буфере (10-бетонный буфер: 30,3 г Триса, 144,1 г глицина и 10 Г SDS в 1 л дистиллированной воды) при 100 В в течение приблизительно 95 мин или до тех пор, пока край мигрирующих белков не достигнет дна геля.
    5. Перенесите гели на нитроцеллюлозу или мембрану PVDF, используя стандартный протокол 9 , 15 .
    6. Заблокируйте мембрану в течение 1 часа на качалке на низкой скорости в 5% сухого молока TTBS (20 мМ Трис, 500 мМ NaCl и 0,05% полисорбата 20).
    7. Определите, было ли достигнуто осадковплодотворный.
      1. Пробейте мембрану, используя первое антитело против осажденного белка, разведенного в 5% сухого молока TTBS в концентрации, рекомендованной производителем, в течение ночи при 4 ° C на качающейся платформе с медленным перемешиванием.
        ПРИМЕЧАНИЕ. См. Таблицу материалов для рекомендаций.
      2. На следующий день промыть мембрану 3 раза в течение 5 минут каждый с помощью TTBS на качающейся платформе с высоким перемешиванием.
      3. Инкубируйте мембрану в соответствующем вторичном антителе, конъюгированном с пероксидазой хрена (HRP), разбавленной в TTBS, в течение 1 часа при комнатной температуре на качающейся платформе с медленным перемешиванием.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Альтернативно, вторичное антитело, конъюгированное с флуорохромом, можно использовать, если доступно соответствующее устройство для обнаружения сигнала.
      4. Выполните от 3 до 6 промывок, каждый в течение 5 минут, с TTBS на качающейся платформе с высоким перемешиванием. Проанализируйте сигнал вторичного антитела путем инкубации мембраны с помощью(См. Таблицу материалов ) и следуйте инструкциям производителя. Обнаружение сигнала с использованием системы хемилюминесцентной визуализации (см. Таблицу материалов ).
        ПРИМЕЧАНИЕ. Подробный протокол анализа вестерн-блоттинга см. В ссылке 16.
    8. Чтобы идентифицировать взаимодействующие белки, выполните шаги 2.3.7.1-2.3.7.4 с использованием соответствующих антител на одном и том же блоте.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Если белки взаимодействуют, партнеры по связыванию будут совместно иммунопреципитированы целевым белком и, таким образом, будут детектироваться с помощью Вестерн-блоттинга. Шаг 2.3.8 можно повторить с большим количеством антител, чтобы определить, находятся ли другие белки в одном и том же комплексе белков, если молекулярные массы белков достаточно различны, чтобы быть хорошо разделенными на геле и мембране.
    9. Чтобы подтвердить, что идентифицированные связывающие партнеры не являются артефактами, должен выполняться обратный IP.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Это выполняется путем повторенияШаги 2.2.1-2.2.20 с тем же самым лизатом, но осаждающие один из партнеров по связыванию, определенных на этапе 3.8. Затем шаги 3.1-3.8 повторяют с использованием первичного антитела против первого представляющего интерес белка.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы определить, могут ли компоненты GJ, AJ и TJ взаимодействовать друг с другом в молочной железе, сначала выполнялись анализы ко-IF. Cx26, белок GJ и β-катенин, белок AJ, зондировали специфическими антителами и выявляли с использованием флуорофороконъюгированных антител мыши-647 (зеленый, псевдоколор) и козы-568 (красный) соответственно ( фиг.1В и С ) , Данные показали, что они локализуются на клеточной мембране эпителиальных клеток у мышей молочной ж...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клеточные клетки взаимодействий через соединения необходимы для правильной функции и развития многих органов, таких как молочная железа. Исследования показали, что функциональные белки могут регулировать функцию и стабильность друг друга и активировать передачу сигнала путем соединения друг с другом в клеточной мембране 10 . Протоколы, представленные в настоящей рукописи, предоставили интересные данные о дифференцированной экспрессии, локализации и взаимодействии функциональных белков в ходе разв...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего объявлять.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ИС финансируется Советом по научным исследованиям в области естественных наук и инженерных исследований Канады (NSERC # 418233-2012); Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQS), карьера в области рака молочной железы в Квебеке и грант Лидера на получение гранта Канадского фонда поддержки инноваций. ED получил стипендию от Universidire Fandation Armand-Frappier.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Мышиная линия и стадияSt. Constant, Квебек, КанадаC57BL/6 Femals; 18-й день беременности (P18) и 14-й день лактации (L14), Charles River Canada 
PBS 10x (стоковый)1) Растворить 80 г NaCl (вес: 58,44), 2 г KCl (вес. 74,55), 26,8 г Na2HPO4· 7H2O (F.W. 268.07) и 2,4 г KH2PO4 (F.W.: 136.09) в дистиллированной воде объемом 800 мл;
2) Отрегулируйте PH до 7,4;
3) Добавьте воды до конечного объема 1 л.
TBS 10x (стоковый)1) Растворить 60,5 г TRIS, 87,6 г NaCl в 800 мл дистиллированной воды;
2) Отрегулируйте pH до 7,5;
3) Добавьте воды до конечного объема 1 л.
Part 1: Иммунофлюоресценция
Замораживающая средаVWR International, Ville Mont-Royal, QC, Канада95067-840VMR замороженные секции состав 
MicrotomeMississauga, ON, Canada956640Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115 В 60 Гц
ЛопастиC.L. Sturkey, Inc. Les Produits  Научные науки  ESBE  Сен-Лоран, Квебек, КанадаBLM1001CВысокопрофильные лезвия с золотым покрытием
Пап-ручкаCedarlane, Берлингтон, Онтарио, Канада8899Super PAP Pen, Thermo fisher научные
микроскопические слайдыFisher Scientific, Берлингтон, Онтарио, Канада12-550-15Fisherbrand  Superfrost Plus Предметные стекла
для микроскопа ФормальдегидBioShop Canada Inc, Берлингтон, Онтарио,Канада ДЛЯ201.1Форлмадегид
Бычья сыворотка альбумин (BSA)Santa Cruz Biotechnology, Inc, Калифорния, США
Блокирующий раствор3% BSA в
раствореTBS-Tween 20 0,1%
Полисорбат 20Оквилл, Онтарио, CanadaP 9416Tween 20, Sigma-Aldrich
Mounting mediaCedarlane, Burlington, ON17984-25(EM)Fluoromount-G
First & secondary антителаCell Signaling, Беверли, МассачусетсСША Смотрите комментарииE-Cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling 
Первичные и вторичные антитела Life Technologies, Уолтем, Массачусетс, США и Cell Signaling, Беверли, Массачусетс, СШАсм. комментарииClaudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) с антикроличьей IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling) 
Первичные и вторичные антитела Santa Cruz Biotechnology, Inc, Калифорния, США; Fischer Scientific, Берлингтон, Онтарио, Канада Смотрите комментарииβ-Антитела к катенину (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) с антикозьим IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), молекулярный зонд (Fisher Scientific)
Первые и вторичные антитела Life Technologies, Уолтем, Массачусетс, США и Cell Signaling, Беверли, Массачусетс, СШАСмотрите комментарииConnexin26  (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) с антимышиным IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s) 
Окрашивание ядерFisher Scientific, Берлингтон, Онтарио, КанадаD1306DAPI (4',6-Диамидино-2-фенилиндол, дигидрохлорид) 1/1,000 в
PBS Флуоресцентный микроскопNikon Canada, Mississauga, On, Canada Конфокальныймикроскопический лазер Nikon A1R+ оснащен спектральным детектором 
Программное обеспечение для анализа изображений ПЧNikon Canada, Mississauga, On, CanadaNIS-elements software (version 4)
Part 2: Immunoprecipitation
Triple-detergent Lysis buffer (100  мл) рН=8,01) Смесь 50 мМ ТРИС (вес.: 121,14), 150  mM NaCl (F.W.: 58,44), 0,02% азида натрия, 0,1% SDS, 1% NONIdET P40, 0,5% дезоксихолата натрия в 80 мл дистиллированного H2O.
2) Отрегулируйте pH до 8,0 с помощью HCl 6  N (~0.5  mL).
3) Отрегулируйте громкость до 100  mL. Храните его в холодильнике.
В день экстракции белка используйте 1/100 NaVo3, 1/100 ингибитора протеазы/фосфатазы и 1/25 NAF в расчетном количестве буфера для лизиса тройного моющего средства:
раствор фторида натрия (стоковый) 1,25  М (О.В.: 41.98), Ортованадат натрия (стоковый) Раствор 1  M (F.W.: 183.9)
Ингибитор протеазы/фосфатазыFisher Scientific, Берлингтон, ON78441Коктейль из ингибитора протеазы и фосфатазы, без ЭДТА (100x)
Дозировка белкаThermo Scientific, Рокфорд, Иллинойс, США23225Набор для анализа белка BCA Пирса 
Измельчитель тканейFisher Scientific, Burlington, ONFTH-115Power 125, Model FTH-115
Магнитные бусины и подставкаMillipore, Etobicoke, ON, CanadaPureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02)
Промывочный раствор для IPPBS или PBS-Tween20 0,1% в зависимости от этапа
Первичные антитела для иммунопреципитацииCell Signaling, Beverly, MA, СШАСмотрите комментарииIgG Кролик (кролик (DA1E) mAb IgG контроль изотипа (#3900s) (клеточная сигнализация) 0,5 &; L/200 и микро; L
Первичные антитела для иммунопреципитацииCell Signaling, Beverly, MA, СШАсм. комментарииIgG Мышь мышь (G3A1) mAb IgG контроль изотипа (#5415s) (клеточная сигнализация) 0,5 &; L/200 и микро; L
Первичные антитела для иммунопреципитацииSigma-Aldrich, Oakville, ON, Canadaсм. комментарииConnexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4  &микро; L/200  &микро; L
Первичные антитела для иммунопреципитацииCell Signaling, Beverly, MA, СШАсм. комментарииE-cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) (Cell Signaling) 1 µ L/200 и микро; L
Laemmli buffer BIO-RAD, Миссиссога, Онтарио, Канада16107474x буфер для образцов Laemmli (добавьте &бета;-меркаптоэтанол в соответствии с рекомендацией производителя)
Кислый глицин Fisher Scientific, Burlington, ONPB381-50,2 М глицин; отрегулируйте pH=2,5 с HCl 
Трис Fisher Scientific, Burlington, ONBP152-11 M (pH=8) 
Акриламидные гели SDS-PAGE BIO-RAD, Миссиссога, Онтарио, Канада1610180 -5Беспятнистые акриламидные растворы FastCast TGX (7,8%, 10%, 12%)
Рабочий буфер 10x BIO-RAD, Миссиссога, Онтарио, Канада1704272Tris 30.3  г/глицин 144,1  g /SDS 10  g в 1 л дистиллированной воды
МембраныBIO-RAD, Миссиссога, Онтарио, Канада1704272Мембраны PVDF, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit
Методпереноса BIO-RAD, Миссиссога, Онтарио, Канада1704155Trans-Blot Turbo Transfer System
Сухое молокоSmucker Food of Canada Co, Markham, ON, КанадаОбезжиренное сухое обезжиренное молоко
раствор для блокировки гвоздики блоттинг5% сухого молока в TBS-Tween 20 0,1%
Моющие растворы при блотахTBS-Tween 20 0,1%
Первичные и вторичные антитела к блоттингу (10  mL)Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario & КомментарииConnexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2,500 с HRP-конъюгированным Veriblot для вторичного антитела IP (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Торонто, Онтарио, Канада)
Первичные и вторичные антитела для блоттинга (10  mL)Cell Signaling, Беверли, Массачусетс, США и Abcam, Торонто, Онтарио, КанадаСмотрите комментарииE-cadherin (24E10) rabbit mAb 1/1,000 (#3195s) (Cell Signaling) 1/1,000 с HRP-конъюгированным Veriblot для вторичного антитела IP (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Торонто, Онтарио, Канада)
Первичные и вторичные антитела к блоттингу (10  mL)Life technologies, Уолтем, Массачусетс, США и КомментарииClaudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1,000 с HRP-конъюгированным Veriblot для вторичных антител IP (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Торонто, Онтарио, Канада)
Первичные и вторичные антитела для блоттинга (10  mL)Life technologies, Уолтем, Массачусетс, США и Abcam, Торонто, Онтарио, КанадаСмотрите комментарииClaudin3 (#34-1700) (Life technologies) 1/1,000 с HRP-конъюгированным Veriblot для вторичного антитела IP (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Торонто, Онтарио, Канада)
Люминол раствор для детектирования сигнала на блотахBIO-RAD, Миссиссога, Онтарио, Канада1705061Clarity Western ECL Blotting Substrate
Imaging blotsBIO-RAD, Миссиссога, Онтарио, Канада1708280ChemiDoc MP imaging система
Анализ блоттингаBIO-RAD, Mississauga, ON, КанадаImageLab 5.2 программное обеспечение 
TBS Wash , ,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sternlicht, M. D. Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis. Breast Cancer Res. 8 (1), 201(2006).
  2. Oakes, S. R., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8 (2), 207(2006).
  3. Stein, T., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8 (2), 207(2006).
  4. El-Sabban, M. E., Abi-Mosleh, L. F., Talhouk, R. S. Developmental regulation of gap junctions and their role in mammary epithelial cell differentiation. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 8 (4), 463-473 (2003).
  5. Hennighausen, L., Robinson, G. W. Information networks in the mammary gland. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (9), 715-725 (2005).
  6. Gudjonsson, T., Adriance, M. C., Sternlicht, M. D., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Myoepithelial cells: their origin and function in breast morphogenesis and neoplasia. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 10 (3), 261-272 (2005).
  7. Nguyen, D. A., Neville, M. C. Tight junction regulation in the mammary gland. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 3 (3), 233-246 (1998).
  8. Stewart, M. K., Simek, J., Laird, D. W. Insights into the role of connexins in mammary gland morphogenesis and function. Reproduction. 149 (6), R279-R290 (2015).
  9. Dianati, E., Poiraud, J., Weber-Ouellette, A., Connexins Plante, I., E-cadherin, Claudin-7 and beta-catenin transiently form junctional nexuses during the post-natal mammary gland development. Dev Biol. 416 (1), 52-68 (2016).
  10. Derangeon, M., Spray, D. C., Bourmeyster, N., Sarrouilhe, D., Herve, J. C. Reciprocal influence of connexins and apical junction proteins on their expressions and functions. Biochim Biophys Acta. 1788 (4), 768-778 (2009).
  11. Hernandez-Blazquez, F. J., Joazeiro, P. P., Omori, Y., Yamasaki, H. Control of intracellular movement of connexins by E-cadherin in murine skin papilloma cells. Exp Cell Res. 270 (2), 235-247 (2001).
  12. Kiyokawa, E., Hara, S., Nakamura, T., Matsuda, M. Fluorescence (Forster) resonance energy transfer imaging of oncogene activity in living cells. Cancer Sci. 97 (1), 8-15 (2006).
  13. Gustafsdottir, S. M., et al. Proximity ligation assays for sensitive and specific protein analyses. Anal Biochem. 345 (1), 2-9 (2005).
  14. Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of mammary gland development and function in mouse models. J Vis Exp. (53), (2011).
  15. Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  16. Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of Western blot data. Mol Biotechnol. 55 (3), 217-226 (2013).
  17. Oxford, E. M., et al. Molecular composition of the intercalated disc in a spontaneous canine animal model of arrhythmogenic right ventricular dysplasia/cardiomyopathy. Heart Rhythm. 4 (9), 1196-1205 (2007).
  18. Wang, X., Li, S. Protein mislocalization: mechanisms, functions and clinical applications in cancer. Biochim Biophys Acta. 1846 (1), 13-25 (2014).
  19. Bertocchi, C., et al. Nanoscale architecture of cadherin-based cell adhesions. Nat Cell Biol. 19 (1), 28-37 (2017).
  20. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors (Basel). 16 (9), (2016).
  21. Fredriksson, K., et al. Proteomic analysis of proteins surrounding occludin and claudin-4 reveals their proximity to signaling and trafficking networks. PLoS One. 10 (3), e0117074(2015).
  22. Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Rev Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).
  23. Malovannaya, A., et al. Streamlined analysis schema for high-throughput identification of endogenous protein complexes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (6), 2431-2436 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein protein InteractionsCo immunofluorescenceCo immunoprecipitationGap JunctionsTight JunctionsAdherens JunctionsMammary GlandsFluorescence MicroscopyWestern BlotMagnetic Beads

Related Articles