Комплексный анализ метилирования ДНК с использованием метода Methyl-CpG-связывающего домена для захвата у пациентов с хронической лимфоцитарной лейкемией

Summary

В этой работе описывается оптимизированный протокол секвенирования доменов с меченным CpG-связывающим доменом (MBD) и вычислительный конвейер для идентификации дифференцированных метилированных CpG-богатых областей у пациентов с хронической лимфоцитарной лейкемией (CLL).

Abstract

Роль длинных некодирующих РНК (lncRNAs) в раке выходит на первый план из-за растущего интереса к пониманию их механистических функций при развитии рака и его прогрессировании. Несмотря на это, глобальная эпигенетическая регуляция lncRNAs и повторяющихся последовательностей в раке не была хорошо исследована, особенно при хронической лимфоцитарной лейкемии (CLL). В этом исследовании основное внимание уделяется уникальному подходу: взятие иммунопреципитации двухцепочечных метилированных фрагментов ДНК с использованием белков с метиловым связыванием (MBD) с последующим секвенированием следующего поколения (MBD-seq). В этом исследовании использовались образцы пациентов с ХЛЛ, принадлежащие двум прогностическим подгруппам (5 мутантных образцов ИГВХ + 5 безмолекулярных образцов IGVH). Анализ выявил 5800 гиперметилированных и 12 570 гипометилированных CLL-специфических дифференцированных метилированных генов (cllDMG) по сравнению с нормальными здоровыми контролями. Важно отметить, что эти результаты выявили несколько CLL-специфических, дифференцированных метилированных lncRNAs, reМелкие элементы и белок-кодирующие гены с потенциальной прогностической ценностью. В этой работе описывается подробный протокол для трубопровода MBD-seq и биоинформатики, разработанный для всестороннего анализа глобальных профилей метилирования в богатых CpG областях с использованием образцов пациентов CLL. Наконец, ген, кодирующий белок, и lncRNA были проверены с использованием пиросеквенирования, который является высоко количественным методом для анализа уровней метилирования CpG для дальнейшего подтверждения результатов протокола MBD-seq.

Introduction

Использование технологий последующего секвенирования для анализа глобальных профилей метилирования ДНК в последние годы пользуется все большей популярностью. Анализы метилирования в масштабе всего генома, включая методы на основе микрочипов и не микрочипов, были разработаны на основе следующего: бисульфитная конверсия геномной ДНК, чувствительность к метилированию рестрикционных ферментов и иммунопреципитация метилированной ДНК с использованием метил-CpG-специфических антител ,

Метилирование ДНК аберранта является одним из признаков лейкемии и лимфом, включая хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ). Ранее несколько групп, в том числе наши,....

Protocol

Этическое утверждение для сбора образцов ХЛЛ осуществляется с 2007-05-21, со следующим регистрационным номером: EPN Gbg dnr 239/07. Все пациенты с ХЛЛ были диагностированы в соответствии с недавно пересмотренными критериями ⁸ , и образцы были собраны во время диагностики. Пациенты в исследовании были включены из разных отделений гематологии в западной части Швеции после получения письменного согласия. В этом исследовании были отобраны только образцы мононуклеарных клеток CLL периферической крови (PBMC) с процентным содержанием опухолей лейкемических клеток ≥70%.

1. Препараты

1. Выделите РВМС для экстракции ....

Results

MBD-seq недавно был проведен на пациентах с ХЛЛ и соответствовал нормальным здоровым элементам управления, чтобы идентифицировать дифференцированные ХЛЛ дифференциально гипер- и гипометилированные гены. Экспериментальный и биоинформационный трубопровод, используемый для анализа данных, полученных из CLL и нормальных здоровых образцов, показан на рисунках 1A и 1B . Эти анализы выявили несколько специфически дифференцированных CLL-специфичных .......

Discussion

MBD-seq является экономически эффективным методом иммунопреципитации, который может быть использован для изучения образцов метилирования с полным охватом генома. И MeDIP seq (метилированная ДНК-иммунопреципитация с последующим секвенированием), и MBD-seq приводят к обогащению обогащенной CpG-метилированной ДНК. Однако MBD-seq демонстрирует большее сродство к связыванию с богатыми CpG-областями по сравнению с MeDIP seq ¹⁹ . Используя набор для обогащения метиловым связыванием, можно фракционироват.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dneasy Набор для крови и тканей	Qaigen	69504
Lymphoprep solution	A X I S-S H I E L D
Nano drop 2000	Thermo Fischersceintific
TE buffer pH 8	Sigma aldrich	93283
Bioruptor стандартный ультразвуковой аппарат	Diagenode	UCD-200
TPX bioruptor tubes 1.5 mL	Diagenode	C30010010-300
3M Ацетат натрия	Диагенод	C03030002
E-гель iBase безопасный комбо-набор	Thermo Fischersceintific	G6465EU
E-гель 2% Агарозные гели	Thermo Fischersceintific	G441002
Methylminer Набор для обогащения метилированной ДНК	Thermo Fischersceintific	ME10025
Labquake Tube Shakker/Rotators	Thermo Fischersceintific	415110
Dynal MPC-S	Thermo Fischersceintific	A13346
Вихревой смеситель	VWR	12620-848
Абсолютный этанол	Любая компания
70% Этаноол	Любая компания
Вода без ДНКазы	Milli Q
Преципитант ДНК (3М ацетат натрия)	Диагенод	C03030002
Безопасная пломба 1,5 мл пробирки Eppendorf		4036-3204
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fischersceintific	Q32851
Qubit 0,5 мл пробирки	Thermo Fischersceintific	Q32856
Qubit	Thermo Fischersceintific	Q32866
Illumina Hiseq2000 Платформа	Illumina
Water  Bath	Grant
Heat block	grant
Трубчатый вращатель	Labquake