Методическая статья

Протоколы для сборки ДНК ДНК C-Brick с использованием Cpf1

DOI:

10.3791/55775

⸱

15 июня 2017 г.

 ,  , 
1Institute of Plant Physiology and Ecology, Shanghai Insititutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

КРИСПР-ассоциированный протеин Cpf1 может управляться специально разработанной РНК CRISPR (crRNA) для расщепления двухцепочечной ДНК на желаемых участках, создавая липкие концы. Основываясь на этой характеристике, был установлен стандарт сборки ДНК (C-Brick), и здесь описывается протокол, подробно описывающий его использование.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CRISPR-ассоциированный белок Cpf1 расщепляет двухцепочечную ДНК под руководством РНК CRISPR (crRNA), образуя липкие концы. Из-за этой характеристики Cpf1 использовался для установления стандарта сборки ДНК под названием C-Brick, который имеет преимущество в длинных местах распознавания и коротких рубцах. На стандартном векторе C-Brick существует четыре сайта распознавания Cpf1 - префикс (сайты T1 и T2) и суффикс (сайты T3 и T4) - фланкирующие части биологической ДНК. Расщепление сайтов T2 и T3 дает дополнительные липкие концы, которые позволяют собирать части ДНК с участками T2 и T3. Между тем короткий шов «GGATCC» образуется между частями после сборки. Поскольку новообразованная плазмида снова содержит четыре сайта расщепления Cpf1, этот метод позволяет итеративно собирать части ДНК, которые аналогичны тем, что указаны в стандартах BioBrick и BglBrick. Процедура, описывающая использование стандарта C-Brick для сборки частей ДНКОписывается здесь. Стандарт C-Brick может широко использоваться учеными, аспирантами и студентами и даже любителями.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Стандартизация биологических частей ДНК важна для развития синтетической биологии 1 . Разработка процедуры сборки ДНК может заменить специальные экспериментальные проекты и устранить многие неожиданные результаты, возникающие при сборке генетических компонентов в более крупные системы. Стандарт BioBrick (BBF RFC 10) был одним из самых ранних предложенных стандартов сборки ДНК. Он использует префиксную последовательность (содержащую сайты резания EcoRI и XbaI) и последовательность суффикса (содержащую сайты репликации SpeI и PstI) 2 , 3 . Поскольку XbaI и SpeI имеют комплементарные когезионные концы, части ДНК BioBrick, которые разрезаны XbaI и SpeI, могут быть объединены вместе, создавая новый BioBrick для дальнейшей итеративной сборки.

Некоторые дефекты были идентифицированы с использованием стандарта BioBrick 4 . Например, он производит шрам на 8 п.о.Между частями ДНК, что не позволяет создавать белки-слитые. Кроме того, четыре вышеупомянутых типа рестрикционных сайтов с 6 п.о. должны быть удалены из частей ДНК, что очень неудобно. Стандарт BglBrick был создан для решения первой проблемы 5 . Он создает шрам «GGATCT» 6 б.п., продуцирующий Gly-Ser и позволяющий слияние нескольких белков или доменов белка. IBrick был разработан для решения второй проблемы 6 . Он использует самонастраивающиеся эндонуклеазы (HE), которые распознают длинные последовательности ДНК. Поскольку сайты узнавания HE редко существуют в естественных последовательностях ДНК, стандарт iBrick можно использовать для прямой конструирования частей iBrick без изменения их последовательностей ДНК. Тем не менее, стандарт iBrick оставляет шрам 21 п.о. между частями ДНК, что может быть причиной его непопулярности.

В последние годы кластеры регулярно пересекали короткие палиндромные повторы (CRISPR) система быстро развивалась 7,8 . Среди CRISPR-ассоциированных (Cas) белков в настоящее время широко используется эндонуклеаза Cas9 от Streptococcus pyogenes . В основном он вводит двухцепочечные разрывы ДНК (DSB) с тупыми концами 9 .

В 2015 году Чжан и его коллеги впервые описали Cpf1 (CRISPR из Prevotella и Francisella 1). Он относится к системе типа К CRISPR-Cas класса 2 и представляет собой CRISRP-РНК (crRNA) -направленную эндонуклеазу 10 . В отличие от Cas9, Cpf1 вводит DSB с 4 или 5-дюймовым 5-дюймовым выступом 10 . Основываясь на этой характеристике, Cpf1 использовался для разработки стандарта сборки ДНК C-Brick 4 . На стандартном векторе C-Brick четыре целевых сайта Cpf1 с префиксом T1 / T2 и суффикс T3 / T4 фланкируют биологические части; Это похоже на стандарт BioBrick. Поскольку расщепление сайтов T2 и T3 pСтимулирует комплементарные липкие концы, можно выполнить итерационную сборку частей ДНК, образуя шрам «GGATCC» между частями. Примечательно, что стандарт C-Brick имеет два основных преимущества: распознавание длинных последовательностей мишеней и отсутствие коротких шрамов. Шрам 6 гп «GGATCC», вырабатываемый C-Brick, кодирует Gly-Ser, что позволяет создавать гибридные белки. Кроме того, стандарт C-Brick также частично совместим со стандартами BglBrick и BioBrick.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Получение кРНК

  1. Подготовка шаблонов crRNA
    1. Повторно суспендируйте отдельные олигонуклеотиды ( табл. 1 ) в воде, свободной от РНКазы, до концентрации 10 мкМ.
    2. Добавить 22,5 мкл олигонуклеотида с верхней нитью (T7-F в таблице 1 ), 22,5 мкл олигонуклеотида нижней нити ( таблица 1 ) и 5 ​​мкл 10-кратного отжигающего буфера в 0,2 мл ПЦР-пробирку. Убедитесь, что общий объем составляет 50 мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Шесть различных олигонуклеотидов нижней нити показаны в таблице 1 , каждая из которых должна быть индивидуально сопряжена с верхней нитью T7-F. Строчные буквы в таблице 1 представляют последовательность, подлежащую транскрибированию в направляющую последовательность кРНК. Буфер 10K Taq PCR можно использовать вместо 10x буфера отжига.
    3. Поместите ПЦР-трубку в термоциклер.
    4. Запустите программу отжига: начальная денатурация при 95 ° C для5 мин, а затем кулдаун от 95 до 20 ° С с уменьшением на 1 ° С в минуту на термоциклере.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Немедленно используйте образцы для шага 1.2.1.
  2. Транскрипция и очистка кРНК
    1. Добавить 38 мкл свободной от РНКазы воды, 8 мкл матрицы из стадии 1.1.4, 20 мкл 5x T7 транскрипционного буфера, 20 мкл смеси NTP (10 мкМ), 4 мкл рекомбинантного ингибитора РНКазы (RRI) и 10 мкл Мкл РНК-полимеразы Т7 в 1,5 мл микроцентрифужную пробирку. Убедитесь, что общий объем составляет 100 мкл.
    2. Поместите микроцентрифужную пробирку в водяную баню с температурой 37 ° C в течение ночи (около 16 часов).
    3. Используйте набор для очистки и концентрации РНК для очистки транскрибируемой РНК; Следуйте протоколу производителя.
    4. Количественное определение РНК с помощью спектрофотометров UV-Vis и разбавление РНК до концентрации 10 мкМ. Используйте образцы сразу или храните их при -80 ° C.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Последовательность кРНКS приведены в таблице 2 .

2. Построение частей C-кирпича ( то есть введение биологических частей в стандартный вектор C-Brick)

ПРИМЕЧАНИЕ. Этот шаг имеет три подэтапа. Для коротких биологических частей ( например, промоторов и терминаторов) лучше всего использовать прямой метод ПЦР для вставки биологических частей в стандартный вектор C-Brick 4 . Вся векторная последовательность показана в дополнительных данных, а последовательность префикса и суффикса показана на рисунке 1 (шаг 2.1 ниже). Для биологических частей, которые могут быть легко получены с помощью ПЦР ( например, с шаблонами геномной ДНК, плазмид или синтезированных последовательностей ДНК), лучше всего использовать метод бесшовной сборки для вставки биологических частей в стандартный вектор C-Brick (Шаг 2.2 ниже). Для тех частей, которые получены из стандартов BioBrick и BglBrick, ограничениеФермент-опосредованное переваривание и опосредуемое лигазой T4 лигирование могут быть использованы для вставки биологических частей в стандартный вектор C-Brick (шаг 2.3 ниже).

  1. Конструкция посредством прямого ПЦР-амплификации
    1. Дизайн и порядок олигонуклеотидов для амплификации ПЦР.
      ПРИМЕЧАНИЕ. 5'-конец олигонуклеотида содержит последовательность части ДНК, а 3'-конец олигонуклеотида содержит векторную последовательность ( то есть «GGATCCACTAGTCTCTAGCTCG» на 3'-конце прямой цепи и «GGATCCTTTCTCCTCTTTCTAG», В обратной цепи). На 5'-конце олигонуклеотида может быть спроектирован либо свес, либо свес на 20 п.н. Конкретные примеры можно найти в предыдущем исследовании 4 .
    2. Повторно суспендируйте отдельные олигонуклеотиды в ультрачистой воде до концентрации 10 мкМ.
    3. Настройте реакции ПЦР на лед в 0,2 мл ПЦР-пробирке: добавьте 18 мкл ультрачистой воды, 25 мкл 2x PCR-буфер, 1 мкл dNTP (10 мкМ), 2,5 мкл каждого из прямых и обратных праймеров (10 мкМ) со стадии 2.1.2, 0,5 мкл стандартного вектора C-Brick (50 нг) в качестве матрицы и 0,5 мкл Высоконадежной ДНК-полимеразы. Убедитесь, что общий объем составляет 50 мкл.
    4. Поместите трубку непосредственно в термоциклер и запустите программу термоциклера. Используйте образцы немедленно или замораживайте и храните их при -20 ° C.
    5. Программа термоциклера: один цикл в течение 3 мин при 98 ° C; Тридцать циклов в течение 10 с при 98 ° С, 20 с при 55 ° С и 2 мин при 72 ° С; И один цикл в течение 10 мин при 72 ° С. Держите образец при 16 ° C.
    6. Добавить 9 мкл смеси из стадии 2.1.4 в 1,5 мл микроцентрифужную пробирку.
    7. Добавить 1 мкл DpnI и инкубировать в течение 1 часа на 37 ° C водяной бане.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Если праймеры не имеют перекрывающихся последовательностей, добавьте 0,5 мкл T4 полинуклеотид-киназы (PNK) и 0,5 мкл ДНК-лигазы T4 и инкубируйте в22 ° C водяной бане в течение 1 часа. В противном случае, если праймеры содержат перекрывающуюся последовательность ~ 20 нт, непосредственно трансформируйте обработанные DpnI продукты в клетки E. coli (DH10B) -компетентные (этап 2.4). Линеаризованный продукт ПЦР будет циркулировать по системе рекомбинации в хосте.
    8. Немедленно используйте образцы или храните их при -20 ° C.
  2. Строительство через бесшовные сборки
    1. Дизайн и порядок олигонуклеотидов для амплификации ПЦР.
      ПРИМЕЧАНИЕ. 3'-конец олигонуклеотида содержит концевую последовательность части ДНК, а 5'-конец олигонуклеотида содержит конец линеаризованной стандартной векторной последовательности C-Brick ( то есть «CTAGAAAGAGGAGAAAGGATCC» для 5'- -end прямой цепи и «CGAGCTAGAGACTAGTGGATCC» для 5'-конца обратной цепи). Конкретные примеры можно найти в предыдущем исследовании 4 .
    2. Повторно приостановитьОлигонуклеотидов в ультрачистой воде до концентрации 10 мкМ.
    3. Настроить реакции ПЦР на лед в 0,2 мл ПЦР-пробирке: добавить 18 мкл ультрачистой воды, 25 мкл 2x PCR-буфера, 1 мкл dNTP (10 мкМ), 2,5 мкл каждого из прямых и обратных праймеров (10 мкМ ) Из стадии 2.2.2, 0,5 мкл матрицы (20-500 нг) и 0,5 мкл высоконадежной ДНК-полимеразы. Убедитесь, что общий объем составляет 50 мкл.
    4. Поместите трубку непосредственно в термоциклер и запустите программу термоциклера. Используйте образцы немедленно или замораживайте и храните их при -20 ° C.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Задайте программу термоциклера: один цикл в течение 3 мин при 98 ° C; 30 циклов в течение 10 с при 98 ° С, 20 с при 55 ° С (в соответствии с температурой отжига праймера) и 1 мин (по длине биологических частей) при 72 ° С; И один цикл в течение 10 мин при 72 ° С. Держите образец при 16 ° C.
    5. Очистите продукт ПЦР с помощью системы очистки ПЦРНабор тем; Следуйте протоколу производителя.
    6. Дайте дайджест стандартного вектора C-Brick с BamHI: добавьте 34 мкл ультрачистой воды, 10 мкл плазмиды (1 мкг), 5 мкл 10-кратного буфера и 1 мкл BamHI в микроцентрифужную пробирку. Инкубируйте в течение 2 часов при 37 ° C на водяной бане.
    7. Очистите вышеуказанный продукт с помощью набора для очистки геля; Следуйте протоколу производителя.
    8. Добавьте 2 мкл линеаризованного вектора (50 нг) из стадии 2.2.7, 5 мкл фрагмента (200 нг) из стадии 2.2.4, 2 мкл 5х бесшовного сборного буфера и 1 мкл фермента с бесшовным сбором из бесшовного монтажного набора В 1,5-мл микроцентрифужную пробирку. Убедитесь, что общий объем составляет 10 мкл.
    9. Поместите его на водяную баню с температурой 37 ° C в течение 30 минут. Используйте образцы немедленно или замораживайте и храните их при -20 ° C.
  3. Конструирование через рестрикционное фермент-опосредованное переваривание и опосредуемое лигазой T4 лигирование.
    ЗАМЕТКА: Для тех частей, которые получены из стандартов BioBrick (шаг 2.3.4-2.3.7) и BglBrick (шаг 2.3.1-2.3.3), рестрикционное фермент-опосредованное переваривание и опосредуемое лигазой T4 лигирование могут быть использованы для вставки Биологических частей в стандартный вектор C-Brick.
    1. Дайте стандартные части BglBrick с BamHI и BglII: добавьте 34 мкл ультрачистой воды, 10 мкл плазмиды (2 мкг), 5 мкл 10x буфера 3, 0,5 мкл BamHI и 0,5 мкл BglII в микроцентрифужную пробирку. Инкубируйте в течение 2 часов на 37 ° C водяной бане.
    2. Проведите 1% -ный электрофорез в агарозном геле и очистите фрагмент с помощью набора системы очистки геля.
    3. Лигируйте фрагмент и стандартный вектор C-Brick: добавьте 2 мкл линеаризованного вектора (50 нг) из стадии 2.1.12 и 6 мкл фрагмента (200 нг) со стадии 2.3.3 в 1,5 мл микроцентрифужную пробирку. Добавить 1 мкл 10 x T4 ДНК-лигазного буфера и 1 мкл ДНК-лигазы T4. Инкубируйте в течение 2 ч при 22 ° С. Используйте образцы сразу или freezE и хранить их при -20 ° C.
    4. Дайте стандартные части BioBrick с XbaI и SpeI: добавьте 34 мкл ультрачистой воды, 10 мкл плазмиды (2 мкг), 5 мкл 10-бутового буфера, 0,5 мкл XbaI и 0,5 мкл SpeI в микроцентрифужную пробирку. Инкубируйте в течение 2 часов на 37 ° C водяной бане.
    5. Дайте дайджест стандартного вектора C-Brick с XbaI и SpeI: добавьте 34 мкл ультрачистой воды, 10 мкл плазмиды (1 мкг), 5 мкл 10x буфера, 0,5 мкл XbaI и 0,5 мкл SpeI в микроцентрифужную пробирку , Инкубируйте в течение 2 часов на 37 ° C водяной бане.
    6. Проведите 1% -ный электрофорез в агарозном геле и очистите фрагмент с этапа 2.3.4 и линеаризованный вектор со стадии 2.3.5 с помощью набора системы очистки геля; Следуя протоколу производителя.
    7. Лигируйте фрагмент и вектор C-Brick: добавьте 2 мкл линеаризованного вектора (50 нг) со стадии 2.3.5 и 6 мкл фрагмента (200 нг) со стадии 2.3.4 в 1,5 мл микроцентрифужную пробирку. ОбъявлениеD 1 мкл 10x T4 ДНК-лигазного буфера и 1 мкл ДНК-лигазы T4. Инкубируйте в течение 2 ч при 22 ° С. Используйте образцы немедленно или замораживайте и храните их при -20 ° C.
  4. Добавьте 10 мкл продуктов из п. 2.1.8, 2.2.9, 2.3.3 или 2.3.7 для химического превращения в компетентные клетки E. coli (DH10B).
  5. Возьмите несколько клонов в 5 мл жидкой трубки Luria-Bertani (LB) и инкубируйте при 37 ° C на шейкере (220 об / мин) в течение ночи.
  6. Экстрагируют плазмиду с использованием набора для приготовления плазмид; Следуйте протоколу производителя.
  7. Определите правильные клоны с помощью последовательности Sanger 11 .

3. Сборка C-Brick ( Рисунок 2 )

  1. Пищеварение вектора C-Brick с Cpf1
    1. Добавить 22,5 мкл свободной от РНКазы воды, 4 мкл 10x Cpf1 буфера, 10 мкл плазмиды из стадии 2.6 (1 мкг), 0,5 мкл RRI и 1 мкг,# 181; L Cpf1 (5 мкМ) в 1,5-микронную центрифужную пробирку.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Cpf1 можно приобрести коммерчески или очистить по протоколу в предыдущем исследовании 4 .
    2. Чтобы вставить чужеродный фрагмент ДНК в сайты T1 и T2, добавьте 1 мкл crRNA-T2 (10 мкМ) и инкубируйте на водяной бане при 37 ° C в течение 30 минут. Дд 1 мкл crRNA-T1 (10 мкМ) и Cpf1 (5 мкМ) в течение еще 30 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Альтернативно, чтобы вставить чужеродный фрагмент ДНК в сайты T3 и T4, добавить 1 мкл crRNA-T3 (10 мкМ) и инкубировать на водяной бане при 37 ° C в течение 30 минут. Добавьте 1 мкл crRNA-T4 (10 мкМ) еще 30 мин.
    3. Добавьте 1 мкл термочувствительной щелочной фосфатазы и инкубируйте пробирку на водяной бане при 37 ° C еще 1 час.
    4. Проведите электрофорез в агарозном геле и очистите вектор, используя комплект системы очистки геля. Используйте образцы немедленно или замораживайте и храните их при -20 ° C.
  2. Переваривание фрагмента ДНК с помощью Cpf1
    1. Добавить 21,5 мкл свободной от РНКазы воды, 4 мкл 10x Cpf1 буфера, 10 мкл плазмиды из стадии 2.6 (2 мкг), 0,5 мкл RRI и 2 мкл Cpf1 (5 мкМ) в 1,5-микронную центрифужную пробирку.
    2. Чтобы вставить чужеродный фрагмент ДНК в сайты T1 и T2, добавьте 1 мкл crRNA-T1 (10 мкМ) и 1 мкл crRNA-T3 (10 мкМ) и инкубируйте на водяной бане при 37 ° C в течение 2 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ. В качестве альтернативы добавьте 1 мкл crRNA-T2 (10 мкМ) и 1 мкл crRNA-T4 (10 мкМ) и инкубируйте на водяной бане при 37 ° C в течение 2 часов.
    3. Проведите электрофорез в агарозном геле и очистите фрагмент с помощью набора системы очистки геля. Используйте образцы немедленно или замораживайте и храните их при -20 ° C.
  3. Сборка C-Brick и дальнейшая проверка
    1. Лигируйте чужеродный фрагмент ДНК и вектор C-Brick: добавьте 2 мкл линеаризованного вектора (50 нг) со стадии 3.1.4 и 6 мкл фрагмента ДНК (200 нг) со стадии 3.2.3 в 1,5 мл микроцентрифужную пробирку. Добавить 1 мкл 10x T4 ДНК-лигазного буфера и 1 мкл ДНК-лигазы T4. Инкубируйте в течение 2 ч при 22 ° С. Используйте образцы немедленно или замораживайте и храните их при -20 ° C.
    2. Добавьте 10 мкл продуктов лигирования (этап 3.3.1) для химической трансформации в клетки E. coli (DH10B).
    3. Добавьте несколько клонов в 5 мл жидкой трубки LB и инкубируйте в течение ночи на шейкере при 220 об / мин и 37 ° C.
    4. Экстрагируют плазмиду с использованием набора для приготовления плазмид; Следуйте протоколу производителя.
    5. Определение правильных клонов с помощью последовательности Sanger 11 .
  4. Выполните новый раунд сборки C-Brick. Правильные клоны с шага 3.3.4 могут быть использованы в качестве нового вектора C-Brick или части ДНК для дальнейшей итеративной сборки C-Brick по тому же протоколу, что и на этапах 3.1-3.3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: T2 'и T3' sItes разработаны как резервная копия сайтов T2 и T3 ( рис. 1a ). Для плазмид, полученных на этапе 2.3.7, для стандартной сборки C-Brick могут использоваться только T2 'и T3'.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол продемонстрировал сборку трех кассет хромопротеинов (cjBlue (BBa_K592011), eforRed (BBa_K592012) и amilGFP (BBa_K592010)). Во-первых, кодирующие последовательности трех вышеупомянутых генов и терминаторов были индивидуально клонированы в стандартный вектор C-Brick. Короткие части ДНК, промотор и терминатор вводили в вектор C-Brick через ПЦР-амплификацию с использованием праймеров, содержащих короткие части ДНК на 5'-конце. Затем последовал метод самолигирования. Три последо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе описывается процедура для стандартного сборщика ДНК C-Brick. Наиболее важным шагом в этом протоколе является линеаризация стандартного вектора C-Brick; Неполное расщепление вектора может серьезно повлиять на скорость успеха. Кроме того, хотя Cpf1 главным образом расщепляет целевые ДНК-последовательности в схеме расщепления 18-23, было обнаружено неточное расщепление вблизи двух оснований 4 , что может вызвать небольшое количество мутаций после сборки ДНК. Поэтому для проверки соб...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Shanghai Tolo Biotech за техническую помощь во время разработки стандарта C-Brick. Эта работа была поддержана грантами Программы стратегических приоритетных исследований Академии наук Китая (грант № XDB19040200).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Комерциальный олигонуклеотидСангон Биотех
10x Taq ПЦР буфертрансген#J40928
ультра чистая дистиллированная водаInvitrogen10977-015
5x РНК транскрипционный буферThermoScientific K0441
T7 РНК-полимеразаThermo Scientific#EP0111
смесь NTPSangon#ND0056
RRI (ингибитор рекомбинантной РНКазы)Takara2313A
RNA Clean & Концентратор-5Zymo ResearchR1015
УФ-вид спектрометрThermo ScientificNano-Drop 2000c
2x Phanta Max BufferVazymePB505PCR буфер
dNTPsTransgenAD101
Phanta Max Super-Fidelity DNA PolymeraseVazymeP505-d1
Ezmax для одноэтапного клонированияTolobio24303-1Бесшовный монтажный комплект
5x Буфер для Ezmax Одношаговое клонированиеTolobio32006
BamHINEB
BamHI-HFNEB
BglII NEB
XbaINEB
SpeINEB
10x Buffer 3NEB
10x CutSmart BufferNEBB7204S
10x T4 DNA ligaseBuffer Tolobio32002
T4 PNKTolobio32206
T4 DNA лигазаТолобио32210
DpnINEB
SV Гель и ПЦР система очисткиPromegaA9282
Plasmid Mini Kit IOmegaD6943-02набор для подготовки плазмид
термочувствительная щелочная фосфатаза Thermo Scientific#EF0651FastAP
10x Cpf1 буферTolobio32008
Cpf1Tolobio32105FnCpf1
термоамплификаторApplied Biosystemsveriti 96 well
C-Brick стандартный векторTolobio98101
E. coli [DH10B]Invitrogen18297010
Среда Лурия-Бертани (триптон)ОксоидLP0042
Среда Лурия-Бертани (дрожжевой экстракт)ОксоидLP0021
Среда Лурия-Бертани (NaCl)Сангон БиотехB126BA0007
#R0136L #R3136L #R0144L #R0145L #R3133L #B7003S #R01762

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Canton, B., Labno, A., Endy, D. Refinement and standardization of synthetic biological parts and devices. Nat Biotechnol. 26 (7), 787-793 (2008).
  2. Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. J Biol Eng. 2, (2008).
  3. Knight, T. Idempotent Vector Design for Standard Assembly of Biobricks. , MIT Artificial Intelligence Laboratory; MIT Synthetic Biology Working Group. 1-11 (2003).
  4. Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. C-Brick: A New Standard for Assembly of Biological Parts Using Cpf1. ACS Synth Biol. 5 (12), 1383-1388 (2016).
  5. Anderson, J. C., et al. BglBricks: A flexible standard for biological part assembly. J Biol Eng. 4 (1), (2010).
  6. Liu, J. K., Chen, W. H., Ren, S. X., Zhao, G. P., Wang, J. iBrick: a new standard for iterative assembly of biological parts with homing endonucleases. PLoS One. 9 (10), e110852(2014).
  7. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  8. Wright, A. V., Nunez, J. K., Doudna, J. A. Biology and Applications of CRISPR Systems: Harnessing Nature's Toolbox for Genome Engineering. Cell. 164 (1-2), 29-44 (2016).
  9. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  10. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
  11. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  12. Shanghai Tolo Biotechnology Company Limited. , Shanghai 200233, China. Available from: http://www.tolobio.com/ (2017).
  13. Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method. PLoS One. 3 (11), e3647(2008).
  14. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  15. Casini, A., Storch, M., Baldwin, G. S., Ellis, T. Bricks and blueprints: methods and standards for DNA assembly. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (9), 568-576 (2015).
  16. Cameron, D. E., Bashor, C. J., Collins, J. J. A brief history of synthetic biology. Nat Rev Microbiol. 12 (5), 381-390 (2014).
  17. Keasling, J. D. Synthetic biology for synthetic chemistry. ACS Chem Biol. 3 (1), 64-76 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

C Brick StandardCpf1 AssemblyDNA Part AssemblyCRISPR RNASeamless AssemblyVector DigestionChromoprotein CassettesPlasmid PreparationSanger SequencingChemical Transformation

Похожие статьи