КРИСПР-ассоциированный протеин Cpf1 может управляться специально разработанной РНК CRISPR (crRNA) для расщепления двухцепочечной ДНК на желаемых участках, создавая липкие концы. Основываясь на этой характеристике, был установлен стандарт сборки ДНК (C-Brick), и здесь описывается протокол, подробно описывающий его использование.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Протоколы для сборки ДНК ДНК C-Brick с использованием Cpf1
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
CRISPR-ассоциированный белок Cpf1 расщепляет двухцепочечную ДНК под руководством РНК CRISPR (crRNA), образуя липкие концы. Из-за этой характеристики Cpf1 использовался для установления стандарта сборки ДНК под названием C-Brick, который имеет преимущество в длинных местах распознавания и коротких рубцах. На стандартном векторе C-Brick существует четыре сайта распознавания Cpf1 - префикс (сайты T1 и T2) и суффикс (сайты T3 и T4) - фланкирующие части биологической ДНК. Расщепление сайтов T2 и T3 дает дополнительные липкие концы, которые позволяют собирать части ДНК с участками T2 и T3. Между тем короткий шов «GGATCC» образуется между частями после сборки. Поскольку новообразованная плазмида снова содержит четыре сайта расщепления Cpf1, этот метод позволяет итеративно собирать части ДНК, которые аналогичны тем, что указаны в стандартах BioBrick и BglBrick. Процедура, описывающая использование стандарта C-Brick для сборки частей ДНКОписывается здесь. Стандарт C-Brick может широко использоваться учеными, аспирантами и студентами и даже любителями.
Введение
Стандартизация биологических частей ДНК важна для развития синтетической биологии 1 . Разработка процедуры сборки ДНК может заменить специальные экспериментальные проекты и устранить многие неожиданные результаты, возникающие при сборке генетических компонентов в более крупные системы. Стандарт BioBrick (BBF RFC 10) был одним из самых ранних предложенных стандартов сборки ДНК. Он использует префиксную последовательность (содержащую сайты резания EcoRI и XbaI) и последовательность суффикса (содержащую сайты репликации SpeI и PstI) 2 , 3 . Поскольку XbaI и SpeI имеют комплементарные коге....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Получение кРНК
- Подготовка шаблонов crRNA
- Повторно суспендируйте отдельные олигонуклеотиды ( табл. 1 ) в воде, свободной от РНКазы, до концентрации 10 мкМ.
- Добавить 22,5 мкл олигонуклеотида с верхней нитью (T7-F в таблице 1 ), 22,5 мкл олигонуклеотида нижней нити ( таблица 1 ) и 5 мкл 10-кратного отжигающего буфера в 0,2 мл ПЦР-пробирку. Убедитесь, что общий объем составляет 50 мкл.
ПРИМЕЧАНИЕ. Шесть различных олигонуклеотидов нижней нити показаны в таблице 1 , каждая из которых должна быть индивидуально сопряжена с верхней нитью T7-F. Строчны....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Этот протокол продемонстрировал сборку трех кассет хромопротеинов (cjBlue (BBa_K592011), eforRed (BBa_K592012) и amilGFP (BBa_K592010)). Во-первых, кодирующие последовательности трех вышеупомянутых генов и терминаторов были индивидуально клонированы в стандартный вектор C-Brick. Короткие части ДНК, промотор и терминатор вводили в вектор C-Brick через ПЦР-амплификацию с использованием праймеров, содержащих короткие части ДНК на 5'-конце. Затем последовал метод самолигирования. Т.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этом протоколе описывается процедура для стандартного сборщика ДНК C-Brick. Наиболее важным шагом в этом протоколе является линеаризация стандартного вектора C-Brick; Неполное расщепление вектора может серьезно повлиять на скорость успеха. Кроме того, хотя Cpf1 главным образом расщепляет целевые ДНК-последовательности в схеме расщепления 18-23, было обнаружено неточное расщепление вблизи двух оснований 4 , что может вызвать небольшое количество мутаций после сборки ДНК. Поэтому для проверки соб.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы благодарим Shanghai Tolo Biotech за техническую помощь во время разработки стандарта C-Brick. Эта работа была поддержана грантами Программы стратегических приоритетных исследований Академии наук Китая (грант № XDB19040200).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Комерциальный олигонуклеотид | Сангон Биотех | ||
| 10x Taq ПЦР буфер | трансген | #J40928 | |
| ультра чистая дистиллированная вода | Invitrogen | 10977-015 | |
| 5x РНК транскрипционный буфер | Thermo | Scientific K0441 | |
| T7 РНК-полимераза | Thermo Scientific | #EP0111 | |
| смесь NTP | Sangon | #ND0056 | |
| RRI (ингибитор рекомбинантной РНКазы) | Takara | 2313A | |
| RNA Clean & Концентратор-5 | Zymo Research | R1015 | |
| УФ-вид спектрометр | Thermo Scientific | Nano-Drop 2000c | |
| 2x Phanta Max Buffer | Vazyme | PB505 | PCR буфер |
| dNTPs | Transgen | AD101 | |
| Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase | Vazyme | P505-d1 | |
| Ezmax для одноэтапного клонирования | Tolobio | 24303-1 | Бесшовный монтажный комплект |
| 5x Буфер для Ezmax Одношаговое клонирование | Tolobio | 32006 | |
| BamHI | NEB | ||
| BamHI-HF | NEB | ||
| BglII | NEB | ||
| XbaI | NEB | ||
| SpeI | NEB | ||
| 10x Buffer 3 | NEB | ||
| 10x CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| 10x T4 DNA ligase | Buffer Tolobio | 32002 | |
| T4 PNK | Tolobio | 32206 | |
| T4 DNA лигаза | Толобио | 32210 | |
| DpnI | NEB | ||
| SV Гель и ПЦР система очистки | Promega | A9282 | |
| Plasmid Mini Kit I | Omega | D6943-02 | набор для подготовки плазмид |
| термочувствительная щелочная фосфатаза | Thermo Scientific | #EF0651 | FastAP |
| 10x Cpf1 буфер | Tolobio | 32008 | |
| Cpf1 | Tolobio | 32105 | FnCpf1 |
| термоамплификатор | Applied Biosystems | veriti 96 well | |
| C-Brick стандартный вектор | Tolobio | 98101 | |
| E. coli [DH10B] | Invitrogen | 18297010 | |
| Среда Лурия-Бертани (триптон) | Оксоид | LP0042 | |
| Среда Лурия-Бертани (дрожжевой экстракт) | Оксоид | LP0021 | |
| Среда Лурия-Бертани (NaCl) | Сангон Биотех | B126BA0007 |
Ссылки
- Canton, B., Labno, A., Endy, D. Refinement and standardization of synthetic biological parts and devices. Nat Biotechnol. 26 (7), 787-793 (2008).
- Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. J Biol Eng. 2, (2008).
- ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
