Интеграция миниатюрной твердофазной экстракции и LC-MS / MS Обнаружение 3-нитротирозина в моче человека для клинических применений

Summary

Для измерения свободного 3-нитротирозина был разработан метод селективной и чувствительной жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (LC-MS / MS), связанный с эффективной твердофазной экстракцией на 96-луночном микропланшетном катионообменном (MCX) смешанном режиме (MCX) 3-NT) в моче человека с высокой пропускной способностью, которая подходит для клинических применений.

Abstract

Свободный 3-нитротирозин (3-NT) широко использовался в качестве возможного биомаркера для окислительного стресса. Сообщалось о повышении уровня 3-NT в самых разнообразных патологических состояниях. Однако существующие методы не обладают достаточной чувствительностью и / или специфичностью, необходимой для надежного измерения уровня эндогенного уровня 3-NT и слишком громоздки для клинических применений. Следовательно, срочно необходимо аналитическое улучшение для точного количественного определения уровней 3-NT и проверки роли 3-NT в патологических условиях. Этот протокол представляет собой разработку новой спектроскопии тандемной масс-спектрометрии (LC-MS / MS) в жидкой хроматографии в сочетании с миниатюризированной твердофазной экстракцией (SPE) для быстрого и точного измерения 3-NT в человеческой моче как неинвазивный биомаркер Для окислительного стресса. SPE с использованием 96-луночного планшета заметно упрощает процесс путем объединения очистки образца и обогащения аналита без утомительной дериватизации и стадии испарения, Снижение потребления растворителя, удаление отходов, риск загрязнения и общее время обработки. Применение 25 мМ ацетата аммония (NH ₄ OAc) при рН 9 в качестве раствора элюирования SPE существенно повысило селективность. Реакция сигнала масс-спектрометрии была улучшена путем регулирования переходов с множественным контролем реакции (MRM). Использование 0,01% HCOOH в качестве добавки на колонке пентафторфенила (PFP) (150 мм x 2,1 мм, 3 мкм) улучшало реакцию сигнала еще в 2,5 раза и сокращало общее время работы до 7 мин. Был достигнут нижний предел количественного определения (LLOQ) 10 пг / мл (0,044 нМ), что представляет собой значительное улучшение чувствительности по сравнению с указанными анализами. Этот упрощенный, быстрый, выборочный и чувствительный метод позволяет обрабатывать две пластины мочи (n = 192) в течение 24-часового периода времени. Учитывая значительно улучшенные аналитические характеристики и неинвазивный и недорогой выборки мочи, предлагаемый анализ полезен для доклинических и клиническихисследования.

Introduction

В последние годы воздействие окислительного стресса на клиническое проявление было выдвинуто на первый план ¹ . Один из исследованных биомаркеров представляет собой 3-нитротирозин (3-NT), конечный стабильный продукт, образующийся при взаимодействии реакционноспособных видов азота (RNS) с тирозином, предшественником нейротрансмиттера катехоламина. Хотя 3-NT может иметь клиническое значение в качестве биомаркера для RNS in vivo, существенные изменения свойств и функций тирозина могут неблагоприятно влиять на соответствующие белки и клеточные функции ^{1 , 2} . Новые исследования по....

Protocol

Все исследования с использованием образцов мочи человека проводились в соответствии с процедурой, утвержденной Советом по институциональному обзору Pharmasan / Neuroscience (IRB).

1. Сбор образцов мочи и определение креатинина (Cr)

1. Соберите 5 мл образцов мочи следующего дня после ок. 10 ч на ночь в транспортной трубке объемом 5 мл А, содержащей 250 мкл 3 н. HCl в качестве консерванта и хранить при -20 ° С до использования.
2. Оттепель и вихрь 5 мл транспортной мочи. Пробирку и центрифугу в центрифуге ( например, Сорваль) (2297 × 10 мин).
3. Аликвоту 1 мл мочи дважды из 5 мл транспортной трубки А.

Results

На рисунке 1 показано, что 3-NT полностью хроматографически отделена от других аналогично аналогичных аналогов тирозина при оптимизированном состоянии ЖК, что устраняет сопутствующие помехи из-за этих значительно избыточных соединений и, следовательно, повышает степень селективности анализа. Кроме того, градиентное элюирование 0,01% HCOOH в качестве добавки в МА и метаноле при скорости потока 0,45 мл / мин позволяет быстро элюировать 3-НТ ( т. Е. 3 .......

Discussion

Существенные изменения концентраций, ранее описанные в литературе для эндогенного свободного 3-НТ в образцах мочи человека, выявили методологические проблемы, связанные с доступными анализами ^{8 , 9 , 10 , 11} . Точное определение низкого базального уровня 3-NT в моче человека остается сложной задачей, требующей специальных мер предосторожности для подготовки проб и анализа LC-MS / MS. Этот прот.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Нитро-L-тирозин	Sigma	N7389-5г
3-Нитро-L-тирозин-13C9	Sigma	652296-5.0mg
Mass Spec Gold Urine	Golden West Biologicals	MSG 5000-1L Oasis
MCX 96-well µ Элюирующая пластина	Waters	186001830BA
2 мл 96 луночная пластина для сбора	Phenomenex	AH0-7194
96 положительный процессор	Waters
LC-MS Ultra CHROMASOLV метанол	Sigma	14262-2L
LC-MS Ultra CHROMASOLV вода	Sigma	14263-2L
Муравьиная кислота для масс-спектрометрии	Sigma	94318-50ML-F Раствор
гидроксида аммония	Sigma	338818-1L
Ultra PFP пропиловые колонки	Restek	9179362
5500 Triple quad	AB Sciex	/	Свяжитесь с производителем для получения более подробной информации
UFLC-XR	Shimadzu	/	Свяжитесь с производителем для получения более подробной информации
Integra 400 Plus	Roche	/	Urinary Креатинин Jaffé Метод Gen 2
LCMS сертифицированный флакон 12 x 32 мм с винтовым горлышком	Воды	600000751CV
LCGC сертифицированный 12 x 32 мм флакон с винтовым горлышком для полного восстановления	Воды	186000384C
5 мл транспортировочная трубка	Phenix	TT-3205
50 мл Центрифуга	Crystalgen	23-2263
15 мл Центрифужная пробирка	Crystalgen	23-2266
Электронный дозатор eLine	Sartorius	730391
центрифуга Microfuge	Весы Beckman Coulter	A46474
OHAUS	Кеннеди Скейлз, инк.	735
Вихревой смеситель	Бернстед Термолин	M16715