Мы разработали метод для успешного удаления, обработки, разделения и окрашивания, для гистопатологической оценки, ткани молочной железы, которая первоначально была закреплена на слайдах в качестве целого. Этот метод может способствовать сбору и оценке целых гормонов молочной железы в исследованиях репродуктивного и развивающего тестирования.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Разделение молочных желез всех мест для идентификации поражения
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Нормальное развитие молочной железы может быть изменено путем воздействия токсинов окружающей среды и фармацевтических продуктов, чрезмерного воздействия гормонов и генетических изменений. Универсальные скопления молочной железы - это недорогой метод для фиксации изменений морфологических изменений, которые могут возникнуть после воздействия. Однако в более поздней жизни, когда аномалии более склонны к развитию, единственная зависимость от этого метода может не всегда обеспечивать достаточную информацию, чтобы сделать правильный диагноз аномалии. Исторически, в исследованиях по химическим испытаниям, единичная молочная железа удаляется при вскрытии и готовится в виде участка, подверженного гематоксилину и эозину (H & E). Внедрение коллекции и анализа контралатеральной молочной железы для всего тела уменьшает вероятность ложноотрицательной оценки. Оценка всего гора ограничена наличием одной или двух целых молочных желез на слайде, а в некоторых случаях нарушения, наблюдаемые во всем кресле, не являютсяT, равномерно представленный в разделе H & E. Цель этого исследования заключалась в разработке протокола для преобразования покрытых оболочкой масок общего назначения в окрашенные H & E участки, чтобы можно было выявить поражения, которые в противном случае были бы упущены или которые трудно диагностировать. Здесь мы подробно остановимся на способе получения высококачественной, вложенной в парафин секции H & E из молочной железы, которая была первоначально приготовлена в виде всего гора. По сравнению с тканью, которая была специально подготовлена для секреции H & E, для всего крепления требуется дополнительная подготовка к удалению и обработке тканей. Однако этот метод считается недорогим, так как он требует общих лабораторных реактивов и небольшого дополнительного времени. В результате этот метод может предоставить бесценную информацию о том, как химические и экологические воздействия изменяют нормальное развитие молочных желез, а также демонстрируют изменения, которые происходят из-за генетических модификаций.
Введение
Основа для молочных желез - полезный и недорогой метод, реализованный во многих исследованиях крыс и мышей, чтобы понять как нормальное, так и химически вызванное ненормальное развитие. В целом, молочная железа, собранная на разных стадиях развития грызунов ( т. Е. Отрочество, половое созревание, от середины до позднего срока беременности и фаза инволюции), проявит морфологические изменения в тканевой и клеточной архитектуре под влиянием паракринного, эндокринного и аутокринного факторов 1 . У стареющей крысы эпителиальная и стромальная части железы становятся все более плотными, что затрудняет измерение морфологических параметров в целом. Таким образом, общепринятой практикой является сбор железы для гистологической оценки для выявления изменений на микроскопическом уровне. Оба процесса особенно полезны в исследованиях, связанных с воздействием химических веществ ( например, на окружающую среду или фармацевтические препараты) или на изучение морфологических изменений, сопровождающихся генетическим изменениемations.
Методы и возможности для использования молочной железы в оценке риска продолжают развиваться. Несмотря на то, что подготовка на всех этапах является обычной и стандартизированной, изменения в разрезе продолжаются 2 , 3 . Многие исследовательские группы из разных слоев общества ( например, академии, правительства и промышленности) адаптировали корональные / продольные отделы ткани молочной железы в качестве предпочтительного метода, в то время как в некоторых лабораториях все еще используются поперечные срезы через кожу 4 . Последний метод приводит к чрезмерному представлению эпидермиса (кожи), а не к интересующей ткани: эпителий молочной железы 2 . Корональные или продольные секции более полезны для характеристики нормальной ткани 5 и значительно улучшают обнаружение аномалий и поражений из-за увеличенной площади поверхности и количества присутствующих структур. В целом, этоНе подходящий метод сравнительной гистопатологической оценки молочной железы 1 , 2 . Рекомендуется ли использовать мышь или крысу, поиск и сохранение 4- й и 5- й паховых желез, для сравнения всего монтирования с контралатеральной секцией H & E.
При использовании в комбинации секция H & E и целая гора обеспечивают точный учет клеточных и морфологических изменений, вызванных воздействием окружающей среды. Это особенно верно в отношении некоторых штаммов грызунов, в которых модель обладает низкой восприимчивостью к образованию опухолей или опухоль не является чрезвычайно заметной. В некоторых случаях получение требуемой ткани не всегда возможно с использованием обеих методик ( т. Е. Недостаточного количества ткани, ресурсов или неожиданных результатов эксперимента). В нашем случае аномалии наблюдались в молочной железе, а гистопатоЛогические выводы в контралатеральной H & E железы были в основном нормальными. Подавляющее несоответствие между контралатеральными железами привело нас к разработке экономичной и эффективной процедуры для выявления аномалий во всех горах. Используя модифицированную процедуру обработки и встраивания, высококачественные участки, окрашенные H & E, были получены из встроенных в парафинов креплений. Мы предполагаем, что этот протокол станет мощным средством обнаружения химических эффектов воздействия, что улучшает межлабораторные сравнения.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все использование животных и процедуры для этого исследования были одобрены Лабораторией NIEHS
Комитета по уходу и использованию и проведенных в Ассоциации по оценке и аккредитации
Лабораторная лаборатория, аккредитованная на животных.
1. Подготовка молочной железы для всего тела 2 , 3 , 6 , 7
- Удалите паховые молочные железы с одной стороны небеременной женской мыши CD-1, как описано в ссылке 3 , и поместите их на электростатически заряженный слайд.
- Накройте железу антипригарной бумагой или пленкой и поместите еще один слайд сверху. Добавьте давление ( т. Е. Водные веса) к ползуну, чтобы выложить сальник плоской, чтобы сальник прилип к ползуну для фиксации.
- Погрузите слайды в фиксирующие ( например, 100% этанол, хлороформ и ледяную уксусную кислоту в соотношении 6: 3: 1)Ночь при комнатной температуре.
- Удалите железы из фиксатора и промойте в этаноле в течение 15-30 мин. После 30-минутной стирки постепенно переходите на воду, выливая 1/3 этанола и добавляя воду. Дайте мыть сидеть около 5 минут каждый раз и повторите с добавлением воды 3 раза.
- Пятно ( например, раствор карминового квасца) в течение 12-24 часов.
ПРИМЕЧАНИЕ. Более толстые ткани потребуют более длительного времени окрашивания. См. Ссылку 3 для окрашивания деталей. - Вылейте пятно после отведенного времени и промойте слайды водой в течение 30 с. Обезвоживают ткани путем промывки слайдов в 70% этаноле в течение 15 мин с последующим промыванием в течение 15 минут в 95% этаноле и окончательной промывкой в 100% этаноле в течение 20 мин.
- Очистите жир от тканей, поместив их в ксилоле как минимум на 24 часа или дольше, если ткань будет толстой, чтобы удалить непрозрачные или белые области.
- Удалите ткань из ксилола и быстро добавьте mOunting среды до слайда, чтобы избежать обезвоживания тканей; Поместите покровное сверху. Дайте слайду высохнуть не менее 48 часов.
- Оцените полностью смонтированную ткань для аномалий, как описано в 2 .
ПРИМЕЧАНИЕ. При обнаружении повреждений во всех установках и разделении необходимо установить их идентификатор, необходимо выполнить следующие шаги.
2. Удаление молочной железы со всего стекла из стекла
- Удалите покровное и крепежное вещество, погрузив ползунок для всего малыша в стеклянную баню для окрашивания, заполненную ксилолом в течение ночи.
ПРИМЕЧАНИЕ. Более толстые ткани и слайды с чрезмерным монтажным раствором могут потребовать дополнительного времени для снятия покровного стекла. - После первоначального ночного вымачивания поместите слайды в свежий ксилол и промойте в течение 6 часов. Выполните одно окончательное замораживание в свежем ксилоле в течение ночи.
ПРИМЕЧАНИЕ. Покровное покрытие легко упадет со слайда после последнего выдерживания. - С agЛюбимую руку, удерживайте слайд и аккуратно снимите покровное стекло с помощью двух пинцетов, чтобы убедиться, что он удален в один кусок.
ПРИМЕЧАНИЕ. В том случае, если покровное стекло все еще прикреплено к стеклянному слайду, продолжайте вымачивать, пока его не удалите с минимальными усилиями. - После удаления покровного стекла удерживайте слайд перпендикулярно стеклянной чашке Петри, содержащей ксилол, осторожно возьмите острый одноразовый бритвенный лезвие и сдвиньте лезвие одним движением вниз по предмету слайда.
- Как только ткань удаляется, быстро погрузите молочную прокладку в наполненную ксилолом стеклянную чашку Петри, чтобы гарантировать, что ткань не высохнет на воздухе.
ПРИМЕЧАНИЕ. Будьте осторожны с этим шагом. Вся гора тонкая (≤ 1 мм) и хрупкая от обработки ксилолом. Любые впечатления или слезы могут изменить морфологию ткани и осложнить последующие оценки.
3. Обработка тканей
- Как только ткань находится в чашке Петри, осторожно перенесите ееВ маркированную гистологическую кассету. Возьмите край жировой прокладки с тупыми ножами с зубчатыми наконечниками, чтобы минимизировать повреждение тканей.
- Используя бритву, порежьте более крупные ткани (особенно для крыс) пополам и поместите их в две отдельные маркированные кассеты, которые будут соответствовать размеру ткани. Поместите ткань правой стороной вверх (используйте лимфатический узел в качестве ссылки). Убедитесь, что ткань без лимфатического узла остается в том же вертикальном положении, когда она переносится на кассету.
- Поместите кассету в контейнер ксилола в течение 2 часов, прежде чем поместить его в обработчик ткани.
ПРИМЕЧАНИЕ. Рекомендуется обрабатывать образцы в тот же день, когда они помещаются в кассету. Расширенная пропитка в ксилоле не была протестирована. - Загрузите максимальное количество кассет в процессор ткани вручную.
- Перед началом программирования запрограммируйте все реагенты, которые будут использоваться для этого процесса, в список реагентов процессора. Автоматизация движенияС одной станции на другую, используйте параметры меню и создайте новую программу. Когда все шаги будут выполнены, выберите «ОК», чтобы продолжить.
ПРИМЕЧАНИЕ. Перед началом работы процессор позволит просмотреть все данные станции.- Автоматизируйте процессор, чтобы впитать кассеты в ксилоле в течение 30 минут при 37 ° C, а затем вторую выдержку в свежий ксилол при тех же условиях. Автоматизируйте процессор для удаления кассет из раствора ксилола и переноса тканей на следующую станцию, содержащую смесь 1: 1 ксилола: расплавленного парафина, установленную при 60 ° C, в течение 30 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ. Затем процессор передает кассеты в новую камеру, содержащую расплавленный парафин в течение 1 часа. Через 1 час образцы будут автоматически перенесены в новую камеру свежего расплавленного парафина и будут обработаны еще 2 часа. Оба этапа выполняются при 60 ° C. - Затем процессор передает кассеты на станцию, содержащую расплавленный параграфFfin в течение 1 часа. Затем образцы автоматически переносятся на конечную станцию свежего расплавленного парафина и обрабатывают еще 2 часа. Оба этапа выполняются при 60 ° C.
- Автоматизируйте процессор, чтобы впитать кассеты в ксилоле в течение 30 минут при 37 ° C, а затем вторую выдержку в свежий ксилол при тех же условиях. Автоматизируйте процессор для удаления кассет из раствора ксилола и переноса тканей на следующую станцию, содержащую смесь 1: 1 ксилола: расплавленного парафина, установленную при 60 ° C, в течение 30 минут.
4. Внедрение обработанной ткани молочной железы
- Поместите кассеты в резервуар для хранения парафинов на 58 ° C в помещении для встраивания до готовности для вставки ткани в пресс-форму.
- Снимите крышку кассеты, чтобы определить лучший размер пресс-формы для ткани. Удостоверьтесь, что плесень является достаточно большой, чтобы разместить ткань, и оставляйте достаточно места, чтобы иметь свободную от ткани границу парафина по периметру.
- Добавьте 3-4 мм расплавленного парафина в форму и сориентируйте поверхность целиком молочной железы, которая примыкает к нижней части стекла и нижней части кассеты, обращенной вверх в пресс-форме.
- Перенесите пресс-форму на охлаждающую пластину и быстро отрегулируйте ткань по мере необходимости так, чтобы она была параллельна пресс-форме bottom.
ПРИМЕЧАНИЕ. Как только парафин затвердеет, ткань будет защищена на месте. - Используя теплые щипцы, поместите помеченную нижнюю половину кассеты поверх формы; Плотно прижмите щипцы.
- Добавьте дополнительный расплавленный парафин в форму в непрерывном движении, чтобы покрыть всю кассету. Переместите пресс-форму с теплой плиты на холодную плиту, чтобы завершить затвердевание блока.
- Удалите блок из формы, когда парафин полностью затвердевает, чтобы избежать трещин или пузырьков воздуха.
ПРИМЕЧАНИЕ. Храните вложенные в парафин ткани при комнатной температуре до готовности к разделению.
5. Разделение ткани молочной железы с парафином на микротоме
- Перед секционированием инкубируйте парафиновые блоки при -20 ° C в течение 1 часа.
ПРИМЕЧАНИЕ. В блоке будет остаточная монтажная среда от оригинальной ткани с полным покрытием. Охлаждение блока улучшает секционирование блока и ленту. - Подготовьте микрофонRotome, включив водяную баню, содержащую свежую дистиллированную воду, и отрегулируйте температуру до 42-45 ° C. Поместите свежее низкопрофильное лезвие на микротом и установите его на 4 мкм.
ПРИМЕЧАНИЕ. Качество отделки уменьшается с помощью разрезов толщиной более 4 мкм из-за наличия остаточной монтажной среды в ткани. - Вставьте блок в микротом с помощью воска, обращенного к лезвию, и выровняйте его с вертикальной плоскостью. Затем смочите участок марлевой подушки в холодной воде и поместите его на блок в течение нескольких минут.
- Разделите блок, повернув большое колесо по часовой стрелке, в сочетании с грубым продвинутым колесом, пока не будет получена полная грань или репрезентативная часть блока.
ПРИМЕЧАНИЕ. Ткань тонкая из-за очистки ксилола во время процесса полного монтажа. Правильно выровняйте блок с помощью лезвия, чтобы минимизировать количество разрезов при получении репрезентативной секции. - Выберите лентуВручную, аккуратно поплавьте ленту в теплой (45 ° C) водяной бане (подготовленной заранее), позвольте тканевым морщинам рассеиваться и аккуратно поплавать секцию на чистый стеклянный предмет.
- Поместите слайды вертикально на сушильную стойку, чтобы удалить лишнюю воду. Инкубируйте слайды в слегка открытом слайде в течение ночи при 37 ° C.
6. Автоматическое и ручное окрашивание H & E секционных молочных тканей
- Перед окрашиванием слайды хранятся при комнатной температуре.
- Для автоматического окрашивания выберите H & E из параметров окрашивания в главном меню. Депарафинизация, окрашивание и обезвоживание завершаются автоматическим окрашиванием. Используйте монтажный материал и покровное стекло для крепления секций.
- Если вручную окрасить слайды, депарафинизировать секции, погружая слайды в ксилоле в течение 5 мин. Перенесите в свежий ксилол и повторите в течение 5 мин.
- Пересушите слайды, погрузивДважды в 100% этаноле в течение 3 мин каждый, затем два повторения в свежем 95% этаноле и две отдельные промывки в 1х промывочном буфере по 5 мин каждый.
- Промойте слайды в дистиллированной воде.
- Добавьте слайды в гематоксилин в течение 1-2 мин. Удалите слайды и промойте их проточной водой в течение 5 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ. Перед каждым использованием фильтруйте гематоксилин. - Поместите слайды в 1% ледяной уксусной кислоты в течение 30 с, чтобы способствовать дифференциации цвета, а затем промыть проточной водой в течение 1 минуты.
- Добавьте слайды в 1X PBS в течение 30 с - 1 мин до синих участков ткани, затем промойте 5 минут промыть в водопроводной воде, а затем в 95% спирте в течение 15-20 с.
- Противоположный раствор эозина в течение 30 с - 1 мин. После этого обезвоживают слайды дважды в свежем 95% этаноле, а затем два свежих повторения в 100% этаноле. Выполните каждую стирку в течение 5 мин.
- Очистите слайды в ксилоле с двумя изменениями в ксилоле в течение 5 минут каждый.
- покровное стеклоСекцию ткани с установочной средой и сухую плоскую ночь при комнатной температуре.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Этот метод эффективен при оказании помощи при диагностике, которая иначе могла быть пропущена, если исходная контралатеральная секция H & E грудной клетки не показала гистологических изменений. Тем не менее, результат будет полезен только в том случае, если будет предпринята осторожность во время первоначальной подготовки целиком, а также при подготовке ткани к гистологической оценке. Вставка парафина обеспечит защиту и поможет сохранить ткань для будущего секционирования.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Общая гормональная железа - это мощный инструмент, который может быть использован для иллюстрации нормального развития молочной железы и морфологических изменений, которые могут возникать и сохраняться после воздействия химических веществ, включая эндокринные разрушители. Когда целая гора и участок H & E от одного и того же животного оцениваются вместе, они могут обеспечить точный визуальный снимок ранних изменений, которые могут перерасти в более больное состояние.
Способность получить ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет противоречивых интересов для объявления в отношении исследований, авторства и / или публикации этой статьи.
Благодарности
Авторы хотели бы признать Pam Ovwigho, Tenette Jones и Наташу Клейтон, NIEHS, за их технический опыт и поддержку в этом проекте.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Permount | Thermo Fisher Scientific | SP15-100 | монтажный материал для скольжения целых креплений и H& E секции |
| Leica автоматизированный процессор | Leica Biosystems | Модель # ST5020 | |
| HM 355S Автоматический микротом | Thermo Fisher Scientific | 905200 | |
| Парафин | Leica Biosystems | EM-400 | |
| Superfrost плюс предметные стекла для микроскопа | Thermo Fisher Scientific | 4951PLUS-001 | электростатически заряженный |
| Fisher Finest 24x60x1 | Thermo Fisher Scientific | 12-548-5P | покровные стекла |
| Varistain Gemini ES Автоматический морилка для предметных стекол | Thermo Fisher Scientific | A78000014 | |
| Sta-On | Leica Biosystems | 3803107 | жидкий клей; используется в водяной бане при секционировании |
| Модифицированный гематоксилин Harris 72711 | Richard-Allan Scientific (входит в состав Thermo Scientific) | 72711 | |
| Эозин | Leica Biosystems | 3801600 | |
| Карбонат лития | SkyTech Laboratories | LCQ500 | |
| Ледяная уксусная кислота | Thermo Fisher Scientific | A38-500 | требуется фиксатор Carnoy |
| хлороформ | Macron Fine Chemicals | 4440-04 | требуется фиксатор Carnoy |
| 100% этанол | Warner Graham Company | 6505001050000 | требуется фиксатор и моющие стекла Carnoy |
| 95% этанол | Warner Graham Company 6505011137320190 | ||
| квасцы | CarmineSigma-Aldrich | C1022-25G | |
| Додекагидрат сульфата алюминия калия, Sigma Ultra | Sigma-Aldrich | A7210-500G | |
| Буфер для промывки автоматики, 20X | Biocare Medical | TWB945 |
Ссылки
- Rudel, R. A., Fenton, S. E., Ackerman, J. M., Euling, S. Y., Makris, S. L. Environmental exposures and mammary gland development: State of the science, public health, implications, and research recommendations. Environ Health Perspect. 119 (8), 1053-1061 (2011).
- Keenan, K. P., Wallig, M. A., Hascheck, W. M. Nature via Nurture: Effect of Diet on Health, Obesity, and Safety Assessment. Toxicol Pathol. 41 (2), 190-209 (2013).
- Stanko, J. P., Fenton, S. E. Quantifying branching density in rat mammary gland whole mounts using the Sholl analysis method. J Vis Exp. , In press (2017).
- Toxicology Program, N. ational Specifications for the conduct of studies to evaluate the toxic and carcinogenic potential of chemical, biological, and physical agents in laboratory animals for the national toxicology program (NTP). National Toxicology Program, National Institutes of Environmental Health Sciences. , Research Triangle Park, NC. Available from: http://ntp.niehs.nih.gov/ntp/test_info/finalntp_toxcarspecsjan2011.pdf (2011).
- Toxicology Program, N. ational Specifications for the conduct of studies to evaluate the reproductive and developmental toxicity of chemical, biological, and physical agents in laboratory animals for the National Toxicology Program (NTP). National Toxicology Program, National Institutes of Environmental Health Sciences. , Research Triangle Park, NC. Available from: http://ntp.niehs.nih.gov/ntp/test_info/finalntp_reprospecsmay2011_508.pdf (2011).
- Mammary gland whole mount processing and staining. , Available from: http://www.cpl.colostate.edu/pathology/protocols/wm.htm (2016).
- Whole mount preparations. , Available from: http://www.protocol-online.org/cgi-bin/prot/view_cache.cgi?ID=2149 (2016).
- Filgo, A. J., et al. Mammary gland evaluation in juvenile toxicity studies: Temporal developmental patterns in the male and female Harlan Sprague Dawley Rat. Toxicol Pathol. 44 (7), 1034-1058 (2016).
- Tucker, D. K., Foley, J. K., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Preparation of high-quality hematoxylin and eosin-stained sections from rodent mammary gland whole mounts for histopathologic review. Toxicol Pathol. 44 (7), 1059-1064 (2016).
- Hvid, H., Thorup, O., Oleksiewicz, M. B., Sjogren, I., Jensen, H. E. An alternative method for preparation of tissue sections from the rat mammary gland. Exp Toxicol Path. 63 (4), 317-324 (2011).
- Munoz-de-Toro, M., et al. Perinatal exposure to bisphenol-A alters peripubertal mammary gland development in mice. Endocrinology. 146 (9), 4138-4147 (2005).
- Padilla-Banks, E., Jefferson, W. N., Newbold, R. Neonatal exposure to the phytoestrogen genistein alters mammary gland growth and developmental programming of hormone receptor levels. Endocrinology. 147 (10), 4871-4882 (2006).
- Nikaido, Y., et al. Effects of maternal xenotestrogen exposure on development of the reproductive tract and mammary gland in female CD-1 mouse offspring. Reprod Toxicol. 18 (6), 803-811 (2004).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
