Методическая статья

Разработка HiPSC-продуцированных сывороточных свободных эмбриоидных тел для опроса трехмерных культур стволовых клеток с использованием физиологически релевантных анализов

DOI:

10.3791/55799

⸱

20 июля 2017 г.

 ,  , 
1The Hussman Institute for Autism

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы сообщаем протокол о разработке трехмерной (трехмерной) системы из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs), называемых свободным от сыворотки эмбриоидным телом (SFEB). Эта трехмерная модель может быть использована как органотипическая культура срезов для моделирования развития коры человека и физиологического опроса развивающихся нейронных цепей.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хотя ряд моделей in vitro- заболеваний был разработан с использованием hiPSCs, одно из ограничений заключается в том, что эти двумерные (двумерные) системы не могут представлять собой лежащую в основе цитоархитектурную и функциональную сложность затронутых лиц, несущих подозрительные варианты заболевания. Обычные 2-D модели остаются неполными представлениями in vivo- подобных структур и не адекватно фиксируют сложность мозга. Таким образом, появляется потребность в более трехмерных моделях на основе hiPSC, которые могут лучше повторять клеточные взаимодействия и функции, наблюдаемые в системе in vivo .

Здесь мы сообщаем протокол о разработке трехмерной системы из недифференцированных hiPSCs на основе свободного эмбриоидного тела без сыворотки (SFEB). Эта трехмерная модель отражает аспекты развивающегося вентрализованного неокортекса и позволяет изучать функции, неотъемлемые от живых нервных клеток и интактных тканей, таких как миграция, связь, связь и матгурирование. В частности, мы демонстрируем, что SFEB, использующие наш протокол, могут быть опрошены с использованием физиологически релевантных и высокоточных клеточных анализов, таких как изображения с кальцием, и записи с несколькими электродами (MEA) без криосекции. В случае MEA-записей мы демонстрируем, что SFEB увеличивают активность спайков и активность разрыва на сетевом уровне во время долгосрочного культивирования. Этот SFEB-протокол обеспечивает надежную и масштабируемую систему для изучения развития сети в трехмерной модели, которая отражает аспекты раннего развития коры.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ранее мы сообщали о трехмерной модельной системе, полученной из вызванных человеком человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs), которые повторяют некоторые аспекты развития ранней корковой сети 1 . Эта трехмерная модель, не содержащая сыворотки эмбриоидный корпус (SFEB), улучшает предыдущие простые агрегатные модели hiPSC 2 , 3 . Растущий объем работы показывает, что трехмерные структуры, такие как наши SFEB, приблизительные аспекты развития нервной системы, обычно наблюдаемые in vivo и в более ранние моменты времени, чем наблюдаемые в двумерных (двумерных) / монослойных hiPSC-моделях 4 , 5 . Первоначальные исследования были сосредоточены на самоорганизующейся сложности трехмерных тел без демонстрации их физиологической сложности 2 .

Протокол, описанный здесь, был использован на недифференцированных hiPSCs, полученных из фибробластов и Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС). Эти клетки поддерживаются на γ-облученных эмбриональных питателях мыши (MEFs). Эти колонии hiPSC вручную очищают от спонтанно дифференцированных клеток, ферментативно собирают и ресуспендируют в среде, содержащей ингибитор Rho-киназы Y-27632 (ROCKi). Недифференцированные hiPSCs подвергают диссоциации и центрифугированию перед переносом на 96-луночные пластины с низкой адгезией V-bottom. После гальванирования нейронную индукцию инициируют с использованием двойного ингибирования SMAD (SB431542 и LDN193189 вместе с dickkopf 1 (DKK-1)) для приведения фронта переднего фронтального переднего мозгового нейрона-судьбы 6 . Через 14 дней SFEB переносят на вставки клеточной культуры в 6-луночный планшет. После переноса круглые SFEB начинают распространяться и тонкими, сохраняя при этом местные сетевые соединения, как это часто наблюдается в гиппокампальных органотипических средах для культивирования срезов, используя аналогичные вставки 1 культуры клеток ,Ss = "xref"> 7.

Использование трехмерной платформы на основе SFEB в этом формате поддается эффективному производству корковых сетей, которые могут быть опрошены с использованием физиологических анализов на основе клеток, таких как визуализация кальция или электрофизиологические анализы, такие как записи с одной ячейкой или многоэлектродная матрица (MEA ) 1 . Хотя в трехмерных системах имеются маркеры раннего развития коры головного мозга, другие исследования показали, что эти трехмерные тела могут потребовать более длительные периоды инкубации, чтобы обеспечить по своей сути более медленные темпы развития ткани человека 8 . Этот SFEB-протокол успешно генерирует трехмерные SFEB из недифференцированных hiPSC, которые захватывают аспекты раннего развития коры.

Потенциал SFEB для моделирования сетевых аберраций при неврологических расстройствах является сильной стороной этой системы. HiPSCs, полученные из ткани пациента, могут быть выращены в клетки нервной системы, которые подлежат ослаAys, относящихся к клеточной биологии, а также сопутствующей экспрессии генов. Человеческие iPSC используются для определения генетического профиля больших групп людей с различными неврологическими расстройствами с сложными этиологиями, такими как расстройство спектра аутизма (ASD), шизофрения 9 , синдром Ретта 10 и болезнь Альцгеймера 11 , 12 . До недавнего времени iPSC-модели обычно были монослойными препаратами, которые, хотя и умели оценивать молекулярные взаимодействия, были недостаточны в расшифровке сложных клеточных взаимодействий, наблюдаемых in vivo . Модели для животных были заменой по умолчанию для воссоздания платформы всего органа. Эти модели животных страдают от плохого перевода результатов и имеют ограниченную способность копировать генетические профили человека, идентифицированные крупными генетическими скрининговыми исследованиями. Таким образом, разработка трехмерных систем из iPSC добавляет необходимый уровень сложности в человеческийМоделирование заболеваний 13 , 14 . Следующим шагом для 3D-платформ hiPSC является удовлетворение больших требований к высокопроизводительному экранированию с использованием анализа на основе клеток 15 .

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Генерация нейронных клеток-предшественников

  1. Поддержание hiPSCs, полученных из фибробластов и РВМС в 6-луночных планшетах на я-облученном клеточном слое эмбрионального питателя мыши (MEF) в среде iPSC человека, дополненной небольшими молекулами (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ. Ежедневное обслуживание - это модифицированная версия ранее описанных процедур 1 , 16 .
    1. Пластина 6 x 10 5 MEF на каждую лунку 6-луночного планшета для культивирования ткани в рекомендованном средстве 300 мкл / лунку (по протоколу производителя).
    2. Через 48 часов замените среду MEF средой hiPSC на 300 мкл / лунку в течение 1 часа перед добавлением hiPSC.
    3. Быстро оттаивайте hiPSC на водяной бане при 37 ° C и медленно добавляйте по каплям 1 мл hiPSC. Перенесите hiPSCs и среду в 15 мл коническую трубку. Добавьте среду, чтобы довести общий объем до 5 мл. Центрифуга в течение 4 мин при 129 × g, аспирация супернатыNt, осторожно повторно суспендируйте таблетку в 1 мл среды hiPSC с ингибитором ROCK при концентрации 1: 1000.
    4. Нанесите клеточную суспензию (обычно затравленную на 300 000 клеток / лунку) на слой ячейки MEF и инкубируйте при 37 ° С, 5% СО 2 , 95% -ной влажности.
    5. Следите за культурой iPSC с помощью светового микроскопа. Через 48 часов удаляют культуры с неровными краями, которые превращаются в кистозные или выглядят желтовато-коричневыми под световым микроскопом, чтобы свести к минимуму спонтанную дифференциацию.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Через 7 - 10 дней должны образовываться колонии hiPSC. Колонии должны быть круглыми, с четко определенными границами и равномерными плотностями клеток и лишенными свободно упакованных неравномерных клеток.
    6. Вручную выберите круглые колонии hiPSC, чтобы очистить культуру спонтанно дифференцированных клеток. Разверните колонии, разместив их на свежих слоях MEF. Развернуть 1: 3 каждые 7 дней, когда культуры близки к слипанию и замораживаются 1 , 16 .
  2. После расширения и замораживания клеток (для резервного копирования) выращивайте колонии hiPSC на планшетах, пока они не достигнут слияния 50 - 75%.
  3. После семимесячной послеобеденной обработки используют мягкую ферментативную обработку (5-10 минут с 300 мкл раствора фермента) и нежное растирание (2-4 раза с пипеткой объемом 1000 мкл) для сбора и приготовления hiPSC для дифференцировки клеток нейронных предшественников.
  4. Центрифугируют клеточную суспензию при 129 мкг в течение 4 мин, аспирируют супернатант и ресуспендируют гранулу в 5 мл человеческой iPSC-среде. Перенесите клеточную суспензию в 0,1% -ную желатиновую покрытую культуру для культивирования клеток 5 см в течение 1 часа при 37 ° C, чтобы исключить MEF и максимизировать выход hiPSC. Перенесите среду (с неадгезивными клетками) в другую 5-сантиметровую чашку с желатином.
  5. Перенесите неадгезивные клетки в пробирку для центрифуги на 15 мл, используя переносную пипетку. Осторожно промойте планшеты 3 мл среды и добавьте их в пробирку объемом 15 мл.
  6. Центрифугируют клеточную суспензию при 129 мкг в течение 4 мин, аспирируют суперNatant и осторожно ресуспендировать гранулу в среде. Определите количество клеток, используя счетчик автоматических ячеек. Пластину 9000 клеток / лунку в 96-луночном планшете с низкой адгезией V-bottom.
  7. Центрифугируйте пластину при 163 × g в течение 3 мин. Инкубируйте пластину при 37 ° C, влажности 95% и 5% CO 2 . Используя пипетку, каждый день меняйте 50% среды, удаляя половину среды и заменяя ее свежей химически определенной дифференцирующей средой 1 (DM1, рисунок 1 , таблица материалов) в течение 14 дней.

2. Индукция без эмбрионального тела без сыворотки (SFEB) ( рисунок 2 )

  1. Поместите 40 мкм клеточные культуральные вставки в 6-луночные планшеты и добавьте 1 мл среды DM1 по меньшей мере 1 час до добавления агрегатов.
  2. На 14-й день перенесите агрегаты с помощью среды 20 мкл, используя 200 мкл широкого кончика рта на 40 мкм клеточных культуральных вставках и измените среду на DM2.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Вставки для клеточной культуры представляют собой специализированные вставки, которые немного сходят с дна лунки и состоят из мембраны из политетрафторэтилена, подвешенной на пластиковой раме. Эта мембрана биосовместима и может эффективно поддерживать транспортировку питательных веществ и кислорода в SFEB, которые размещаются сверху. Они обычно используются с органотипическими культурами срезов гиппокампа, взятыми из мыши или крысы 7 , 17 , 18 .
    1. Перенесите 4-6 агрегатов в одну вставку культуры клеток и обеспечите достаточное пространство между агрегатами. Удалите как можно больше избыточного раствора, используя тонкий наконечник пипетки ( например, 200 мкл наконечника).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Допустимо кратко помешать SFEB, поскольку они будут перемещаться по вставке культуры клеток в качестве решения, удаляемого из SFEB.
    2. Поддерживать культуры в 1 мл DM2 при 37 ° C, 95% влажности и 5% CO 2 . Используя пипетку, измените 75%Каждый день, удаляя три четверти среды и заменяя три четверти свежей среды. Например, удалите 750 мкл среды и добавьте 750 мкл свежей среды.
  3. Через 14 дней культуры переключитесь на среду DM3 с 75% -ным изменением среды через день и еще на 16 дней.
  4. Чтобы поддерживать SFEB на вставках клеточной культуры за 30 дней, измените среду через день на 60, 90 и 120 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: SFEB будут расти примерно до 1000 мкм в диаметре и, как правило, толщиной 100-150 мкм 1 .

3. Определение состава SFEB

  1. Отделите SFEB от вкладыша осторожно пипетирующей средой с помощью 200 мкл широкого кончика пипетки. Чтобы передать SFEB, используйте широкий наконечник пипетки, чтобы аккуратно всасывать тела в наконечник пипеток. После загрузки SFEB в наконечник пипетки осторожно переносите на 12-луночные планшеты и промывайте 300 мкл фосфатно-солевого раствора(PBS) на лунку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: SFEB будут суспендированы в растворе в 12-луночных планшетах. Это важно для полного проникновения фиксатора, блокирующего раствора и антител. При использовании нескольких SFEB для окрашивания на каждую лунку 12-луночного планшета можно добавить до 10 SFEB. Это позволит сохранить растворы и антитела.
  2. Исправить SFEB с 300 мкл на лунку 4% параформальдегида при комнатной температуре в течение 30-45 мин. Вымойте фиксированные SFEB дважды с помощью 300 мкл PBS, по 3-5 минут каждого мытья.
    Осторожно: При обращении с параформальдегидом используйте соответствующие средства индивидуальной защиты.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Зонд для иммунореактивности к маркерам для определения зрелости, типа клеток и т. Д. Для маркировки нейронов в этом исследовании цыпленок-Tuj1 использовался при 1: 500, для дополнительных маркеров см. Таблицу 2 и ссылки 1 , 16 .
  3. Permeabilize и блок с 0,1% Triton-X100 в PBS и 10% нормальной сыворотке осла (блокирующий раствор, 300 μ, L на лунку) в течение 1 часа при комнатной температуре.
  4. Удалите блокирующий раствор и обработайте SFEB с помощью 300 мкл первичных антител в блокирующем растворе. Инкубируйте при 4 ° С в течение ночи. Вымойте SFEB трижды (3-5 минут на промывку) в 300 мкл PBS, содержащем 0,1% Triton-X.
  5. Подготовьте вторичные антитела 1: 1000 в блокирующем растворе. Инкубируйте SFEB в течение 1 часа при комнатной температуре со вторичными антителами. Вымойте SFEB с 300 мкл PBS, 3 раза по 3-5 минут каждый.
    ПРИМЕЧАНИЕ. На этом этапе SFEB могут быть подготовлены для визуализации.
  6. Для изображения пипетки SFEB на стеклянном слайде с помощью пипетки с широким отверстием. Удалите избыточное решение вокруг SFEB, используя мягкое всасывание.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Для аналогичных условий окрашивания несколько SFEB могут быть размещены на одном стеклянном слайде.
  7. Добавьте каплю монтажной среды на SFEB, поместите покровное стекло и осторожно нажмите, чтобы убедиться, что нет воздушных пузырьков. Позвольте установочной среде затвердеть и приступайте к отображению и количественной оценке (шаг 3.8).
    ПРИМЕЧАНИЕ. После того, как монтажная среда затвердеет, SFEB готовы к визуализации.
  8. Выполните количественную оценку ячеек, взяв несколько областей интереса (ROI) через SFEB и используя z-стек в сочетании с максимальным проекционным изображением через каждый ROI на стандартном конфокальном микроскопе, как описано в ссылках 1 , 16 .
    ПРИМЕЧАНИЕ. Целые SFEB могут быть количественно определены с использованием графического моделирования (подробнее см. Ссылки 1 , 16 ). Так как SFEB тонкие до примерно 100 мкм, в ткани минимальное рассеяние света и, следовательно, нет необходимости в 2-фотонной микроскопии. Раннее использование этого протокола с iPSCs, полученных из фибробластов, вызвало карту судьбы SFEB, которая выявила сложную и разнообразную структуру с субпопуляциями интернейронов с идентификаторами транскрипции, которые были похожи на CGE и передние передние мозги судьбы 1 , 16.

4. Запись активности нейронов в SFEB с использованием MEA

  1. Подготовьте 12-луночные планшеты MEA в соответствии с инструкциями производителя.
  2. Промойте пластины MEA 3 раза в течение 5 минут стерильным H 2 O в асептических условиях для очистки. Промыть в течение 5 минут 75% этанолом, а затем 100% этанолом для стерилизации тарелки.
  3. Выпекайте пластину, перевернутую в духовке в течение 4-5 часов при температуре 50 ° C, чтобы завершить процесс стерилизации.
  4. Добавьте 500 мкл 0,2% раствора полиэтиленимина (PEI) в каждую лунку и инкубируйте 1 ч при комнатной температуре. Аспирируйте PEI и промывайте лунки 4 раза стерильным дистиллированным H 2 O. Воздух высушите в капоте в течение ночи.
  5. Подготовьте 20 мкл / мл раствора ламинина в среде L15 и добавьте 10 мкл ламинина в центр каждой лунки.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Не покрывайте окружающие опорные и заземляющие электроды.
  6. Добавьте стерильные dH 2 O в окружающие резервуары для предотвращения испарения среды или ламинина.Инкубируйте планшет в течение 1 часа при 37 ° C.
  7. Добавьте SFEB (см. Разделы 1 и 2) к пластинам MEA с покрытием ламинином, аккуратно всасывая их в широкий наконечник пипетки и переносите их. Добавьте 200 мкл среды DM2 в каждую лунку и инкубируйте в течение ночи при 37 ° C, влажности 95% и 5% CO 2 .
  8. Добавьте дополнительную среду 200 мкл через 24 часа и дайте ей восстановить в течение 30 минут при 37 ° C, влажности 95%, 5% CO 2 перед чтением пластины.
  9. Поместите пластину MEA в планшет-ридер (предварительно нагретый до 37 ° C) для регистрации активности нейронов. Запишите активность в течение 10 минут с помощью соответствующего программного обеспечения для записи MEA. Подробнее см. Ссылку 19 .
  10. Генерировать необработанные непрерывные данные и растровые графики активности нейронов с использованием программного обеспечения статистического анализа 19 .
    ПРИМЕЧАНИЕ. Записи MEA принимаются за 7 дней после нанесения SFEB. Для этого исследования записи проводили в течение 10 минут для обнаружения активности сетевого всплеска, conТонкий след и растровые графики. SFEB могут поддерживаться на долговременной основе на плитах MEA и могут регистрироваться в течение более длительных периодов времени с использованием экологически контролируемых условий ( рис. 6 ).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SFEB, выращенные с использованием нашей методики, дали ткань с морфологическими характеристиками, которые напоминают раннюю развивающуюся корковую субвентрикулярную зону, изобилующую обширными Tuj1-положительными нейронами, а также нейронными предшественниками ( рис. 3A ). Многочисленные развивающиеся корковые розетки наблюдались во внешних слоях и внутренних слоях SFEB ( рис. 3B ). Внешний край SFEB напоминает развивающуюся кор...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описанный здесь протокол обеспечивает условия для дифференциации источника hiPSC в трехмерную структуру, которая повторяет раннюю стадию развития лобной коры. Эта процедура дает структуры, которые могут быть опрошены для электрофизиологии, а также поддаются микроскопии. Окончательная морфология SFEB напоминает культуру органотипических культур среза мозга и позволяет получить высококачественную конфокальную визуализацию. Этот протокол может успешно генерировать SFEBs как из hiPSC фибробластов, так и из периферической кр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Элизабет Беневидес за корректуру статьи. Мы благодарим доктора. Джон Гуссман и Джин Блатт за их полезные обсуждения и комментарии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильная>SFEB среда для культур клеток нейрональной дифференцировки. Реагентов. Комплектующие  GSTEMdiff
Нейроиндукционная среда (hiPSC Media)STEMCELL Technologies0-5835250 мл
PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media)GlobalStemGSM-2001
NameCompany  Номер в каталоге<strong>Комментарии
DM1 Медиакомпоненты
D-MEM/F-12 (1x), Глутамакс жидкий, 1:1Invitrogen10565018385 мл
нокаутирующей сывороткиInvitrogen1082802820% 100 мл
Pen/StrepInvitrogen151401225 мл
Глутамакс 200 мМинвитрогена350500615 мл
раствора заменимых аминокислот МЕМ 10 мМ (100 шт.), жидкийинвитроген111400505 мл
2-меркаптоэтанол (1 000 мкм), жидкийинвитроген21985023900 мкм; L
NameCompany  Номер в каталогеКомментарии
>DM2 Компоненты среды
D-MEM/F-12 (1x), Glutamax жидкий, 1:1Invitrogen10565018500 мл
Glutamax 200 mMInvitrogen350500615 мл
Pen/StreppingInvitrogen151401225 мл
N-2 добавки (100x), жидкийInvitrogen1750204810 мл
NameCompany  >Номер в каталоге<strong>Комментарии
>DM3 Медиакомпоненты
NEUROBASAL Medium (1x), жидкийInvitrogen21103049500 мл
B-27 Добавка минус витамин А (50x), жидкийInvitrogen1258701010 мл
Glutamax 200 мМInvitrogen350500615 мл
Pen/StrepInvitrogen151401225 мл
NameCompany  Номер в каталоге>Комментарии
Малые молекулы
ThiazovivinStemgent04-00172 μ M
SB431542Stemgent04-0010-101:1,000 (10 μ M)
ДорсоморфинСтемгент04-00241 μ M
LDN-193189Stemgent04-0074-10250 nM
Y27632 (ROCKi)Stemgent04-0012-1010 μ M
NameCompany  Номер в каталоге>Комментарии
Рекомбинантные протиенсы
DKK-1Peprotech120-30200 нг/мл
НазваниеКомпания  >Номер в каталогеКомментарии
>Компоненты/Материалы
Вставки для клеточных культур 0,4; M,МилликлеточныйPICM0RG50
мышиный эмбриональный фибробластGlobalStemGSC-6301G
96 лунок V дно с крышкамиEvergreen222-8031-01V
StemPro Accutase Реагент для диссоциации клетокThermoFisherA1110501
TritonX-100ThermoFisher85111
Фосфат буферизованный (ПБС)ThermoFisher10010023500 мл
нормальной сыворотки для осликовJackson Labs017-000-121
Leibovitz's L-15Medium ThermoFisher11415114500 мл
DRAQ5 (ядерный маркер)ThermoFisher65-0880-96
MEA пластиныAxion BiosystemsM768-GL1-30Pt200
6 лунок с плоским дномFalcon353046
NameCompany  Номер в каталоге<>Комментарии
>Антитела
NestinMilliporeMAB5326
Brn-2Protein tech14596-1-AP
VGLUT1Synaptic Systems135 303
Pax6abcamab5790
Кальретининabcamab702
Кальбиндинabcamab11426
CoupTFIIR& D SystemsPPH714700
Nkx 2.1abcamab12650
Tuj1abcamab41489
ReelinMilliporeMAB5364
Tbr1MilliporeMAB2261
NFHDakoM0762
M, диаметр 30 мм strong

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nestor, M. W., et al. Differentiation of serum-free embryoid bodies from human induced pluripotent stem cells into networks. Stem Cell Res. 10 (3), 454-463 (2013).
  2. Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).
  3. Sasai, Y. Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture. Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).
  4. Song, S., Abbott, L. F. Cortical development and remapping through spike timing-dependent plasticity. Neuron. 3 (2), 339-350 (2001).
  5. Pre, D., et al. A time course analysis of the electrophysiological properties of neurons differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). PLoS One. 9 (7), e103418(2014).
  6. Sproul, A. A., et al. Characterization and molecular profiling of PSEN1 familial Alzheimer's disease iPSC-derived neural progenitors. PLoS One. 9 (1), e84547(2014).
  7. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
  8. Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development. Cell Stem Cell. 12 (5), 573-586 (2013).
  9. Cukier, H. N., et al. Exome sequencing of extended families with autism reveals genes shared across neurodevelopmental and neuropsychiatric disorders. Mol Autism. 5 (1), (2014).
  10. Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
  11. Choi, S. H., Tanzi, R. E. iPSCs to the rescue in Alzheimer's research. Cell Stem Cell. 10 (3), 235-236 (2012).
  12. Yagi, T., et al. Modeling familial Alzheimer's disease with induced pluripotent stem cells. Hum Mol Genet. 20 (23), 4530-4539 (2011).
  13. Mariani, J., et al. Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (31), 12770-12775 (2012).
  14. Quadrato, G., Brown, J., Arlotta, P. The promises and challenges of human brain organoids as models of neuropsychiatric disease. Nat Med. 22 (11), 1220-1228 (2016).
  15. Nestor, M. W., et al. Human Inducible Pluripotent Stem Cells and Autism Spectrum Disorder: Emerging Technologies. Autism Res. 9 (5), 513-535 (2016).
  16. Nestor, M. W., et al. Characterization of a subpopulation of developing cortical interneurons from human iPSCs within serum-free embryoid bodies. Am J Physiol Cell Physiol. 308 (3), C209-C219 (2015).
  17. Nestor, M. W., Hoffman, D. A. Differential cycling rates of Kv4.2 channels in proximal and distal dendrites of hippocampal CA1 pyramidal neurons. Hippocampus. 22 (5), 969-980 (2012).
  18. Nestor, M. W., Mok, L. P., Tulapurkar, M. E., Thompson, S. M. Plasticity of neuron-glial interactions mediated by astrocytic EphARs. J Neurosci. 27 (47), 12817-12828 (2007).
  19. Woodard, C. M., Campos, B. A., Kuo, S. H., Nirenberg, M. J., Nestor, M. W., Zimmer, M., Mosharov, E. V., Sulzer, D., Zhou, H., Paull, D., Clark, L., Schadt, E. E., Sardi, S. P., Rubin, L., Eggan, K., Brock, M., Lipnick, S., Rao, M., Chang, S., Li, A., Noggle, S. A. iPSC-Derived Dopamine Neurons Reveal Differences Between Monozygotic Twins Discordant for Parkinson's Disease. Cell Rep. 9 (4), 1173-1182 (2014).
  20. Huang, S. M., et al. Tankyrase inhibition stabilizes axin and antagonizes Wnt signalling. Nature. 461 (7264), 614-620 (2009).
  21. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
  22. Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
  23. Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).
  24. Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
  25. Yan, X., et al. iPS cells reprogrammed from human mesenchymal-like stem/progenitor cells of dental tissue origin. Stem Cells Dev. 19 (4), 469-480 (2010).
  26. Wang, J., et al. Generation of clinical-grade human induced pluripotent stem cells in Xeno-free conditions. Stem Cell Res Ther. 6, 223(2015).
  27. Kwon, J., et al. Neuronal Differentiation of a Human Induced Pluripotent Stem Cell Line (FS-1) Derived from Newborn Foreskin Fibroblasts. Int J Stem Cells. 5 (2), 140-145 (2012).
  28. Li, X. J., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).
  29. Sheridan, S. D., Surampudi, V., Rao, R. R. Analysis of embryoid bodies derived from human induced pluripotent stem cells as a means to assess pluripotency. Stem Cells Int. , 738910(2012).
  30. Smith, Q., Stukalin, E., Kusuma, S., Gerecht, S., Sun, S. X. Stochasticity and Spatial Interaction Govern Stem Cell Differentiation Dynamics. Sci Rep. 5, 12617(2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

3D

Похожие статьи