В этом документе описываются два новых плагина ImageJ для анализа изображений «Clock Scan». Эти плагины расширяют функциональность исходной визуальной базовой программы 6 и, самое главное, делают эту программу доступной для большого исследовательского сообщества, объединив ее с программным пакетом для анализа изображений ImageJ.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Протокол сканирования часов для анализа изображений: плагины ImageJ
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Протокол сканирования часов для анализа изображений является эффективным инструментом для количественной оценки средней интенсивности пикселей внутри, на границе и вне (фоном) замкнутой или сегментированной области выпуклой формы, что приводит к генерации усредненного интегрального радиального пиксельно- Профиль интенсивности. Этот протокол был первоначально разработан в 2006 году как визуальный базовый сценарий 6, но как таковой он имел ограниченное распространение. Чтобы решить эту проблему и присоединиться к аналогичным недавним усилиям других, мы преобразовали исходный код протокола сканирования часов в два плагина на основе Java, совместимых с NIH-спонсируемыми и свободно доступными программами анализа изображений, такими как ImageJ или Fiji ImageJ. Кроме того, у этих плагинов есть несколько новых функций, которые расширяют возможности оригинального протокола, такие как анализ нескольких областей интересов и стеков изображений. Последняя особенность программы особенно полезна в приложениях, в которых важно определить изменения, связанные сВремени и местоположения. Таким образом, анализ сканирования часов стеков биологических изображений может потенциально применяться для распространения Na + или Ca ++ в пределах одной клетки, а также для анализа активности распространения ( например , волн Ca ++ ) в популяциях синаптически Соединенных или связанных щелевыми ячейками. Здесь мы описываем эти новые плагины сканирования часов и показываем некоторые примеры своих приложений при анализе изображений.
Введение
Цель этой работы - представить протокол сканирования часов, который не требует платформы и свободно доступен любому исследователю, заинтересованному в этом типе анализа изображений. Протокол часового сканирования был первоначально разработан в 2006 году 1 , с целью улучшения существующих методов количественной оценки интенсивности пикселей в интересующих областях с выпуклой формой (ROI), метод, который обладает лучшей интегративной способностью и улучшенным пространственным разрешением. Во время сбора данных протокол последовательно собирает несколько профилей интенсивности радиального пикселя, отсканированных от центра ROI до его границы или до заданного расстояния вне ROI для измерения интенсивности «фонового» пикселя. Протокол масштабирует эти профили в соответствии с радиусом ячейки, измеренным в направлении сканирования. Таким образом, расстояние от центра до границы ROI каждого отдельного радиального сканирования всегда составляет 100% от шкалы X. Наконец, программа усредняет эти индивидуумыAl профилей в один интегральный профиль интенсивности радиального пикселя. Из-за масштабирования средний профиль интенсивности пикселя, создаваемый протоколом «Сканирование часов», не зависит ни от размера ROI, ни от допустимых пределов от формы ROI. Этот метод позволяет прямое сравнение или, при необходимости, усреднение или вычитание профилей разных ROI. Протокол также позволяет корректировать интегральные профили интенсивности пикселей любого объекта для фонового шума простым вычитанием средней интенсивности пикселей, расположенных вне объекта. Несмотря на то, что он был протестирован только в биологических образцах, наш протокол обеспечивает ценное дополнение к другим существующим инструментам анализа изображений, используемым при исследованиях изображений физических или химических процессов, расположенных вокруг точки происхождения (таких как диффузия веществ из точечного источника ) 1 .
Однако основным ограничением исходного метода анализа изображений было то, что протокол был devБыл исключен как Visual Basic 6 (VB6) (и, следовательно, он зависел от платформы и был трудно распространяться (требуя VB6). Чтобы решить эту проблему и присоединиться к аналогичным недавним усилиям других исследователей 2 , мы преобразовали VB6 Clock Scan Программный код на два плагина на основе Java, совместимый с NIH-спонсируемыми и свободно доступными программами анализа изображений с открытым исходным кодом и платформой, ImageJ 3 и Fiji ImageJ 4. Кроме того, у этих плагинов есть несколько новых функций, расширяющих возможности Первоначального протокола для обработки нескольких ROI и стеков изображений. Многие приложения для анализа изображений не являются удобными для пользователя в отношении выполнения статистического анализа нескольких объектов, и поэтому часто отображаются только репрезентативные данные. С плагином Multi Clock Scan ImageJ, Можно упростить анализ нескольких объектов одновременно. Прочная статистическая оценка данных микроскопии,В отношении распределения интенсивности сигнала в отдельных ячейках / объектах, теперь возможно с этим расширением плагина. Здесь мы описываем плагины Clock Scan и показываем примеры их приложений при анализе изображений.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Установка программного обеспечения
- Установите последнюю версию Java и ImageJ или Fiji ImageJ, как рекомендовано на соответствующих сайтах (см. Таблицу материалов для ссылок на соответствующие веб-сайты). В приведенном ниже тексте обе программы называются «ImageJ».
- Скопируйте файлы «Clock_Scan-1.0.1. Jar» и «Multi_Clock_Scan-1.0.1.jar» с помощью ссылки, приведенной в таблице материалов, и вставьте их в каталог плагина ImageJ. В качестве альтернативы, используйте опцию «Plugins | Install plugin» для установки этих файлов после их сохранения на жестком диске компьютера.
2. Анализ сканирования часов
- Стандартный плагин сканирования часов ( рисунок 1 ):
- Используйте команду меню ImageJ «Файл | Открыть», чтобы открыть изображение, представляющее интерес.
- Нажмите на инструмент «многоугольник» или «сегментированный выбор линии»И затем нарисуйте изображение, чтобы наметить весь ROI или сегмент этого региона. См . Рисунок 1 A для примера выбора многоугольника (внутренний пунктирный контур).
ПРИМЕЧАНИЕ. Также могут использоваться другие инструменты выбора, доступные в программном обеспечении (прямоугольная, овальная и свободная линия). - Выберите «Plugins | Clock Scan» в меню, чтобы открыть стандартное окно всплывающего окна протокола сканирования часов. Обратите внимание, что эта команда также откроет окно ROI Manager с автоматически добавленным контуром.
- Используйте окно опции плагина, чтобы сделать следующее.
- Просмотрите и измените координаты X и Y центра ROI (автоматически рассчитываются как координаты физического центра масс), используя полосы прокрутки или изменяя значения в соответствующих коробках ввода. См . Рис. 1 B.
- В зависимости от того, какая область фона вне объекта shoUld будет покрываться сканированием, отрегулируйте пределы сканирования, используя полосу прокрутки «предел сканирования». См . Рисунок 1 A.
ПРИМЕЧАНИЕ. Предел сканирования - это дробное число, показывающее, как далеко сканирование должно проходить за пределы границы объекта в любом заданном направлении; Значение по умолчанию равно 1,20, что указывает на то, что длина сканирования будет на 20% длиннее радиуса объекта в направлении сканирования; См . Рисунок 1 A , внешняя пунктирная линия). - Измените выход плагина, используя «реальный радиус», «вычесть фон», «полярное преобразование» и / или «график со стандартным отклонением».
- Нажмите «ОК», чтобы запустить плагин. См . Рисунок 1 C-H .
ПРИМЕЧАНИЕ. Примеры вывода протокола с «графикой со стандартным отклонением» и «полярным преобразованием» или «реальным радиусом» и «полярным трансфоном»Orm "показаны на рис. 1 C и 1D и на рисунке 1 E и 1F соответственно. Обратите внимание, что вычисленные значения стандартного отклонения (SD) представляют собой изменение между отдельными сканированием интенсивности радиального пикселя объекта. Также обратите внимание на выбор« ROI » Length "в окне плагина, в котором отображается информация о длине контура ROI, измеренная в пикселях.
- В сгенерированном «окне профиля сканирования часов» используйте команду «Список» для отображения значений, отображаемых в двух, X и Y столбцах данных для изображений с серой шкалой, а также в X и четырех столбцах Y для данных RGB, из которых Y0, Колонки Y1, Y2 и Y3 будут заполнены целыми и индивидуальными (красные, зеленые и синие) значения интенсивности пикселя цветного канала.
- Множественный плагин сканирования часов ROI - работа с несколькими ROI ( Рисунок 2 ):
- Откройте изображение, содержащее несколько ROI.
- Откройте диспетчер ROI, нажав «Анализ | Инструменты | ROI-менеджер».
- Последовательно укажите (см. Шаг 2.1.2) и добавьте каждый ROI в диспетчер ROI, нажав «Добавить» в окне диспетчера ROI; Сделайте это для всех ROI внутри изображения. Используйте команду «Analyze | Measure», если интерес представляют показатели ROI.
- См . Рисунок 2 A для примера выбора нескольких сегментированных линий и рисунка 2 E для примера нескольких вариантов многоугольника.
- Выберите «Multi Clock Scan» в меню «Plugins», чтобы открыть всплывающее окно параметров протокола.
- Используйте окно параметров протокола, чтобы сделать следующее.
- При необходимости сбросьте предел сканирования согласно шагу 2.1.4.2; Значение по умолчанию - 1,20.
- При необходимости выберите опциюИон, чтобы построить средний профиль сканирования часов с помощью SD-баров, установив флажок «Участок со стандартным отклонением». См . Рис. 2 C и D.
ПРИМЕЧАНИЕ. Вычисленные значения SD будут представлять собой разницу между встроенными профилями сканирования часов разных объектов. Также обратите внимание на строку в окне плагина, отображающую информацию о «количестве выбранных ROI». - Нажмите «ОК», чтобы запустить протокол.
- В сгенерированном «окне профиля сканирования часов» используйте команду «Список», чтобы отобразить значения, отображаемые в окне «Значения сюжетов». См. Условное обозначение окна «Многоканал сканирования профиля» для обозначения столбцов по цветному каналу.
- Обратите внимание, что ROI пронумерованы и их профили сканирования часов для любого заданного цветового канала отображаются в той же последовательности, в которой ROI были выделены и добавлены в «Менеджер ROI».
- MulTiple ROI Clock Scan плагин - работа со стеклом изображения ( рисунок 3 ):
- Откройте интересующий стек.
- Откройте диспетчер ROI, нажав «Анализ | Инструменты | ROI-менеджер».
- Обозначьте ROI изображений в стеке и добавьте его в менеджер ROI, как описано в шагах 2.1.2 и 2.2.3. Используйте команду «Analyze | Measure», если интерес представляют показатели ROI.
- Выберите «Multi Clock Scan» в меню «Plugins», чтобы открыть всплывающее окно параметров протокола.
- Используйте окно параметров протокола, чтобы сделать следующее.
- Сбросьте предел сканирования, как описано в шаге 2.1.4.2; Значение по умолчанию - 1,20.
- Выберите параметр, чтобы отобразить средний профиль сканирования часов с помощью SD-баров, установив флажок «Участок со стандартным отклонением».
ПРИМЕЧАНИЕ. Вычисленные значения SD будут представлять собой разницу между различными экземплярами объекта, выбранного в изображении staск. Также обратите внимание на строку в окне плагина, отображающую информацию о «количестве изображений в стеке». - Нажмите «ОК», чтобы запустить протокол.
- В окне «Окно профиля часового сканирования» нажмите «Список», чтобы отобразить значения, отображаемые в окне «Значения сюжетов», где номер столбца Y представляет позицию изображения в стеке - 1.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Изображения, которые используются здесь для иллюстрации, взяты из баз данных, созданных во время наших предыдущих биологических исследований клеток и тканей 5 , 6 , 7 и из Allen Mouse Brain Atlas 8 . Оба плагина были успешно протестированы с использованием ImageJ 1.50i / Java 1.8.0_77, ImageJ 2.0.0-rc-44 / 1.50e / Java 1.8.9_66 и Fiji ImageJ 2.0.0-rc54 / 1.51g / Java 1.8....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Протокол сканирования часов: протокол сканирования часов - это быстрый и простой инструмент анализа изображений. Преимущества этого протокола по сравнению с существующими общими подходами анализа изображений (такими как сканирование интенсивности линейных пикселов или вычисление средней интенсивности пикселов ROI) были подробно описаны в предыдущих публикациях 1 , 9 . Вкратце, этот протокол позволяет генерировать интегральные радиальные профили ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов или других конфликтов интересов.
Благодарности
Мы благодарим доктора Танью Маритцен и доктора Фабиана Фютлинского (Институт молекулярной фармакологии им. Лейбница, Берлин, Германия) за то, что вы ознакомились с нашей версией плагина Fuji ImageJ Clock Scan и вдохновили нас на разработку этой версии программы. Мы также благодарны доктору Фрицу Мелчерсу (Отдел развития лимфоцитов, Институт биологии макса Планка) за его любезное разрешение использовать изображения из базы данных своего отдела с целью тестирования и улучшения плагина. Поддержка: Центр трансляционных нейронаук; Грант NIH: P30-GM110702-03.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Компьютер | : Любой | совместимый с программным обеспечением, перечисленным ниже | |
| ImageJ или Fiji ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ или https://fiji.sc/ | в комплекте с Java 1.8 или выше |
| плагинами Clock-scan, | бесплатным программным обеспечением | https://sourceforge.net/projects/clockscan/ | Clock_Scan-1.0.1 jar и Multi_Clock_Scan-1.0.1/ jar |
| Origin 9.0 | OriginLab | Нортгемптон, Массачусетс, США | Эта программа была использована для создания некоторых графиков исходных данных Clock Scan. Для выполнения этой функции может быть использовано любое другое графическое программное обеспечение |
Ссылки
- Dobretsov, M., Romanovsky, D. "Clock-scan" protocol for image analysis. Am J Physiol Cell Physiol. 291, 869-879 (2006).
- Feutlinske, F., Browarski, M., Ku, M. C., et al. Stonin1 mediates endocytosis of the proteoglycan NG2 and regulates focal adhesion dynamics and cell motility. Nat Commun. 6, 8535(2015).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
- Dobretsov, M., Hastings, S. L., Stimers, J. R. Non-uniform expression of alpha subunit isoforms of the Na+/K+ pump in rat dorsal root ganglia neurons. Brain Res. 821, 212-217 (1999).
- Hayar, A., Gu, C., Al-Chaer, E. D. An improved method for patch clamp recording and calcium imaging of neurons in the intact dorsal root ganglion in rats. J Neurosci Methods. 173, 74-82 (2008).
- Dobretsov, M., Pierce, D., Light, K. E., Kockara, N. T., Kozhemyakin, M., Wight, P. A. Transgenic mouse model to selectively identify alpha3 Na,K-ATPase expressing cells in the nervous system. Society for Neuroscience. , Online Program No. 123.01/B54 1(2015).
- Lein, E. S., Hawrylycz, M. J., Ao, N., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445, 168-176 (2007).
- Romanovsky, D., Mrak, R. E., Dobretsov, M. Age-dependent decline in density of human nerve and spinal ganglia neurons expressing the alpha3 isoform of Na/K-ATPase. Neuroscience. 310, 342-353 (2015).
- Campbell, J., Singh, D., Hollett, G., et al. Spatially selective photoconductive stimulation of live neurons. Front Cell Neurosci. 8, 142(2014).
- Yuryev, M., Pellegrino, C., Jokinen, V., et al. In vivo Calcium Imaging of Evoked Calcium Waves in the Embryonic Cortex. Front Cell Neurosci. 9, 500(2015).
- Qiao, M., Sanes, J. R. Genetic Method for Labeling Electrically Coupled Cells: Application to Retina. Front Mol Neurosci. 8, 81(2015).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
