Method Article

Пищевых патогенов скрининга с помощью магнитно люминесцентные нано: Быстрое обнаружение кишечной палочки O157: H7

DOI:

10.3791/55821

⸱

September 17th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Kansas Polymer Research Center, Pittsburg State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Общая цель настоящего Протокола заключается в синтезировать функциональных Наносенсоры для портативных, экономически эффективным, и быстрое обнаружение конкретно болезнетворные бактерии через сочетание Магнитная релаксация и флуоресценции выбросов условий.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Энтерогеморрагические кишечной палочки O157: H7 был связан с оба водного и болезней пищевого происхождения, так и остается угрозой несмотря на методы отбора пищи и воды в настоящее время используется. Во время обычных бактериальных обнаружения методов таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР) и энзим соединенный иммуноферментного анализа (ИФА) конкретно может обнаружить патогенных загрязнителей, они требуют обширной пробоподготовки и длительных периодов ожидания. Кроме того эти методы требуют сложных лабораторных инструментов и параметров и должна выполняться квалифицированными специалистами. Здесь протокол предлагается для простой диагностики техника, которая имеет уникальное сочетание параметров магнитных и флуоресцентные в платформу на основе наночастиц. Предлагаемая многопараметрических магнито люминесцентные Наносенсоры (MFnS) можно обнаружить кишечной палочки O157: H7 загрязнения как 1 колонии формирование подразделения в раствор в течение менее 1 ч. Кроме того, MFnS способность оставаться весьма функциональный в сложных средах, таких как молоко и воды озера была проверена. Дополнительные специфика анализов использовались также для демонстрации способности MFnS только обнаружить конкретные целевые бактерий, даже при наличии аналогичных видов бактерий. Спаривание магнитных и люминесцентные методы позволяет для выявления и количественной оценки загрязнения возбудителя в широком диапазоне концентраций, экспонирования его высокая производительность в обоих ранней и поздней стадии обнаружения загрязнения. Эффективности, доступности и переносимости MFnS делают их идеальным кандидатом для точки обслуживания скрининга для бактериальных загрязнений в широком диапазоне параметров, от водных резервуаров для коммерчески упакованных пищевых продуктов.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Стойких возникновения бактериального загрязнения в оба коммерчески производства продуктов питания и источники воды создала потребность в более быстрых и конкретных диагностики платформ. 1 , 2 некоторые из более общих бактериальных загрязнений, ответственность за загрязнение пищи и воды, от сальмонеллы, стафилококки, Listeria, Vibrio, Shigella, родов Bacillus и Escherichia. 3 , 4 бактериального загрязнения этими патогенами часто приводит к симптомы, как лихорадка, холера, гастроэнтерит и понос. 4 загрязнение источников воды часто имеет радикальные и негативное воздействие на общины без доступа к достаточно фильтрованной воды, и загрязнение продуктов питания привела к большое количество заболеваний и усилия отозвания продукта. 5 , 6

Для того, чтобы уменьшить возникновение заболеваний, вызванных бактериального загрязнения, были ряд усилий по разработке методов, которыми воды и пищи можно эффективно сканировать до продажи или потребления. 3 методы, такие как ПЦР, ИФА,11,12 цикла опосредованной изотермической амплификация (1,7,8,9,10 ЛАМПА),14 13,среди прочего,15,16,,1718,19,20,21, 22,,2324 недавно были использованы для обнаружения различных возбудителей. По сравнению с традиционными бактериальных культивирования методов, эти методы являются гораздо более эффективным в отношении конкретности и время. Однако эти методы до сих пор борьба с ложных срабатываний и негативы, сложные процедуры и стоимость. 1 , 3 , 25 именно по этой самой причине, что многопараметрических магнито люминесцентные Наносенсоры (MFnS) предлагается как альтернативный метод для обнаружения бактерий.

Эти Наносенсоры уникально пара вместе Магнитная релаксация и люминесцентные методы, позволяя двойной обнаружения платформы, которая является быстрой и точной. Как пример загрязнения с помощью кишечной палочки O157: H7, свидетельствует MFnS способность обнаруживать кое как 1 в течение нескольких минут. Возбудитель специфические антитела используются для увеличения специфичности, и сочетание как магнитные, так и люминесцентные методы позволяет для обнаружения и количественного определения бактериальных загрязнений в обоих диапазонах низкого и высокого загрязнения. 16 в случае бактериального загрязнения, Наносенсоры будут роиться вокруг бактерии из-за ориентации способностей возбудителя специфических антител. Привязку между магнитным Наносенсоры и бактерии ограничивает взаимодействие между магнитным железное ядро и окружающие воды протонов. Это приводит к увеличению в T2 времени релаксации, как записано в магнитных релаксометр. Как повышается концентрация бактерий в растворе, Наносенсоры расходятся с увеличение количества бактерий, что приводит к более низкие значения T2. И наоборот флуоресценции выбросов будет увеличиваться пропорционально концентрации бактерий, в связи с увеличением числа Наносенсоры непосредственно привязаны к патогена. Центрифугирования образцов и изоляции бактериальной Пелле, только сохранит наночастиц, непосредственно подключенные к бактерии, удаление любого свободного плавающего Наносенсоры и непосредственно корреляция выбросов флуоресценции с числом бактерии, присутствующие в растворе. Схематическое представление этого механизма представлена на рисунке 1.

Эта платформа MFnS был разработан с точки обслуживания скрининга в виду, в результате характеристики лоу кост и портативный. MFnS стабильны при комнатной температуре и требуется только в очень низких концентрациях для точного обнаружения бактериальных загрязнений. Кроме того после синтеза, использование MFnS прост и не требует использования квалифицированных специалистов в этой области. Наконец это диагностическая платформа позволяет высоко настраиваемый ориентации, предоставляя средства, которых это одна платформа может использоваться для выявления возбудителей всех видов, в много различных настроек.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. синтеза и функционализация несколькими параметрическими магнито люминесцентные Наносенсоры (MFnS).

  1. Синтеза окиси железа суперпарамагнетическим наночастиц (IONPs)
    1. подготовить для синтеза IONP, подготовить следующие 3 решения: решение 1: FeCl 3 (0,70 g) и FeCl 2 H 2 O (2 мл), решение 2: NH 4 OH (2,0 мл, 13,4 М) H 2 O (15 мл) и решение 3: Полиакриловая кислота (0.855 g) H 2 O (5 мл).
    2. Мкл 90 2 М соляной кислоты (HCl) решения 1 и затем сразу же смешать с 2 решения при vortexing на 875 об/мин. Затем добавьте решение 3. Продолжать vortexing 60 мин
    3. Центрифуги для 20 мин в 1620 x g. Центрифуга супернатант 20 мин в 2880 x g.
    4. Очистить окончательный супернатант через диализа. Добавьте супернатант мешок диализа (MWCO 6 − 8 K) и поместите его в стакан, содержащие-фосфатный буфер (PBS) (рН = 7,4) и спин-бар. Дайте ему впитаться в течение 12 ч, заменяя свежими буфера каждые 2-3 ч.
  2. Спряжение целевой объект специфического антитела к поверхности IONPs
    1. подготовить следующие четыре решения: раствор A: 5 мг 1-этил - 3-(3-dimethylaminopropyl) Карбодиимиды гидрохлорид (EDC) в 250 мкл МЧС [2-(N- Морфолино) ethanesulfonic кислота] буфер (0,1 М, pH = 6,8), решение B: 3 мг N-оксисукцинимидного (NHS) в 250 мкл буфера MES (0,1 М, pH = 6,8), решение C: 5 мкг IgG1, E. coli МАБ, в 225 мкл фосфат амортизированное saline (PBS) (рН 7,4) и решение D: 4 мл IONP (5,0 ммоль) в 1 мл PBS (рН 7,4).
    2. Добавить 2-(N-Морфолино) ethanesulfonic кислота (MES) буфера в раствор А, затем сразу же добавить решение A D решения в малых приращений в течение 15 сек, инвертирование решение после каждого дополнения для смешивания.
    3. Сразу же начинают добавить решение B D решения в малых приращений в течение трех минут. Микс, инвертирование решение после каждого добавления.
    4. Добавить решение C решение с шагом 5 мкл, инвертирование решение после каждого дополнения для микширования.
    5. Позволяют реакции продолжать за 3 ч при комнатной температуре и затем продолжать инкубацию при температуре 4 ° C на ночь.
    6. Очистить результате Ab конъюгированных IONPs через магнитные столбца с помощью PBS (рН = 7,4, финал [Fe] = 3,5 ммоль) для удаления любых неконъюгированной антител.
      1. Мыть магнитные столбец с PBS (1 мл). Придаем столбце магнитные пластины и добавить решение IONP.
      2. Снова помойте магнитные столбец с PBS (1 мл). Удалите столбец магнитные из магнитные пластины. Добавление столбца PBS и собрать решение. Хранить при 4 ° C
  3. инкапсуляции флуоресцентные 1,1 ' - Dioctadecyl - 3,3,3 ', 3 '-краска Tetramethylindocarbocyanine перхлорат (дии) в полиакриловой кислоты (ПАА) покрытие конъюгированных антител IONPs с помощью метод жидкостной диффузии.
    1. До 4 мл IONPs, добавить прикапывают 2.0 мкл концентрированного красителя DiI (2 ммоль) в 100 мкл ДМСО с непрерывного перемешивания на 1100 об/мин.
    2. Dialyze полученный раствор (MWCO 6-8 кДа, 12 h) против PBS, создание окончательного решения MFnS с концентрацией окончательный железа [Fe] = 2 ммоль.
  4. Характеристика MFnS
    1. для спектрофотометрический анализ, использовать читатель пластины для обнаружения инкапсулированные красителя DiI с флуоресцентным выбросов на 595 Нм.
    2. Динамическое рассеяние света
      1. Поместить образец решения MFnS в zetasizer, чтобы определить средний размер и поверхности заряд MFnS.
        Примечание: Здесь, средний размер и поверхности заряд функциональных MFnS были признаны 77.09 Нм и-22.3 МВ, соответственно.

2. Бактериальный Culturing и приготовления раствора фондовая

  1. бактериальной культивирования
    1. гидрата лиофилизированной Пелле (кишечной палочки O157: H7) в 1 мл бульона, питательных и затем добавить еще 5 мл бульона.
    2. Применить 100 мкл этого решения агар пластины и подряд с помощью стерильных прививка цикла, следуют инкубации при 37 ° C за 24 ч.
    3. После 24 ч, выберите изолированной колонии от плиты агара и добавить его в 15 мл бульона культуры. Инкубировать при 37 ° C для 4-6 ч, при мониторинге значение оптической плотности (поглощение на 600 Нм).
    4. Получив оптической плотности значение 0.1, остановить культивирование и выполнить серийных разведений.
  2. Серийных разведений
    1. Добавить 900 мкл питательных бульон до восьми бесплодных microcentrifuge трубок.
    2. Добавить 100 мкл бактериальной подвески к первой трубе (разбавления 10 -1).
    3. Взять 100 мкл от первого трубки и добавить его на второй, чтобы получить разбавления 10 -2. Продолжать этот шаблон для остальных трубок, заканчивая окончательного растворения 10 -8.
    4. Передачи 100 µL из каждой трубки для разделения плиты агара и инкубировать в течение 24 ч при 37 ° с.
    5. Следующий день, граф колонии, образуя единиц (CFUs) на каждой табличке. Выберите пластину с ~ 100 CFUs. Используйте соответствующий разведениях для дальнейших экспериментов (100 мкл = ~ 100 CFUs).
      Примечание: Здесь было 10 -6 разрежения, которая привела к ~ 100 CFUs.

3. Быстрое обнаружение E. палочки O157: H7 с помощью MFnS

  1. шип различные решения PBS (1 X, рН 7,4, 300 мкл) с увеличением количества бактериальных акций 10 -6, результате CFU колеблется от 1-100. Добавление последовательного количество MFnS (100 мкл) к этим решениям.
  2. Создать одно базовое решение, содержащее только PBS (1 X, рН 7,4, 300 мкл) и MFnS (100 мкл).
  3. Инкубировать решения для 30 минут при 37 ° C и затем дать им остыть до комнатной температуры.
  4. Передача индивидуальных решений для магнитного релаксометр (0.47 Тесла) и записывать изменения в времена релаксации (T2) по отношению к CFUs в каждом решении.
    1. Записывать изменения в значения T2, начать путем измерения T2 значение базового решения, содержащего только PBS и MFnS.
      1. Место решение в магнитной релаксометр. Откройте соответствующее программное обеспечение, выберите " релаксации T2 " настроек и нажмите " мера. "
    2. после сбора базовых T2, измерить значения T2 дополнительных решений, которые были шипами с различными концентрации бактерий.
      Примечание: Изменения в T2 эквивалентна базовой T2, вычитается из шипами T2.
  5. Удалить образцы из магнитного релаксометр и центрифуги трубы на 2880 x g 10 мин
  6. Сцеживаться супернатант и Ресуспензируйте бактериальных окатышей в 100 мкл PBS (1 X, рН 7,4).
  7. Добавить 80 мкл каждого ресуспендирования 96-луночных тарелку и интенсивностью флюоресценции запись в 595 Нм.
    Примечание: Тестирование можно повторять с помощью различных растворителей, включая озеро воду, молоко и другие, как описано в разделе результаты

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Механизм MFnS действия представлен на рисунке 1. Кластеризация MFnS вокруг поверхности бактериальных загрязнений вмешивается взаимодействия между magnetic cores MFnS и окружающие ядра водорода. В результате этого кластеризации, Магнитная релаксация значения увеличивают. С увеличением концентрации бактериальных загрязнений, кластеризация уменьшает, а изменение значения T2 уменьшается. Таким образом Добавление флуоресцентные модальности имеет решающее значение. Как бактериальные концентрация у...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол был разработан для получения полностью функциональной MFnS как просто как можно скорее. Однако есть много ключевых моментов, на которые изменения протокола может быть полезным, в зависимости от конечной цели пользователя. Например использование различных антител позволит для ориентации многих других возбудителей. Кроме того этот протокол не ограничивается использование антител, как ориентация молекул. Любая молекула, которая имеет конкретные сродство для целевых патогены, на...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Продемонстрировали применение этой нанотехнологий не еще не утвержденных FDA.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа поддерживается P20GM103418 K-INBRE, Канзас сои Комиссией (KSC/БП 1663), ACS PRF 56629-UNI7 и БП полимерной химии запуска фонда, все СС. Мы благодарим университета видеооператор, г-н Якоб Anselmi, за его выдающуюся работу с видео. Мы также благодарим г-н Роджер Heckert и миссис Катха Heckert за их щедрую поддержку для проведения исследований.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Тетрагидрат хлорида железаFisherScientific I90-500
Хлорид железа гексагидратFisherScientific I88-500
Гидроксид аммонияFisher ScientificA669S-500
Соляная кислота FisherScientificA144S-500
Полиакриловая кислотаSigma-Aldrich323667-100G
EDCThermofisher Scientific22980
NHSFisher ScientificAC157270250
антитела к E. coli O111 sera care5310-0352
Антитела к E. coli O157:H7 [P3C6] Abcamab75244
DiI StainFisher ScientificD282
Питательный бульонDifco233000
Сублимированная E. coli O157:H7 гранулаATCC700728
Магнитный релаксатор Brukermq20
ZetasizerMalvernNANO-ZS90
 Магнитная колонка TecanInfinite M200 PRO
 QuadroMACS130-090-976
ЦентрифугаEppendorf5804
(accuSpin Micro 17)Fisher Scientific13-100-676
Напольная модель Встряхивающий инкубаторSHEL LABSSI5
Аналитические весыMetler ToledoME104E
Цифровой вихревой смесительFisher Scientific02-215-370
Шейкер-качалка под открытым небомFisher Scientific02-217-765
Считыватель пластин Серия

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Law, J. W., Ab Mutalib, N. S., Chan, K. G., Lee, L. H. Rapid methods for the detection of foodborne bacterial pathogens: principles, applications, advantages and limitations. Front Microbiol. 5, 770(2014).
  2. Pandey, P. K., Kass, P. H., Soupir, M. L., Biswas, S., Singh, V. P. Contamination of water resources by pathogenic bacteria. AMB Express. 4, 51(2014).
  3. Zhao, X., Lin, C. W., Wang, J., Oh, D. H. Advances in rapid detection methods for foodborne pathogens. J Microbiol Biotechnol. 24 (3), 297-312 (2014).
  4. Heithoff, D. M., et al. Intraspecies variation in the emergence of hyperinfectious bacterial strains in nature. PLoS Pathog. 8 (4), e1002647(2012).
  5. Ishii, S., Sadowsky, M. J. Escherichia coli in the Environment: Implications for Water Quality and Human Health. Microbes Environ. 23 (2), 101-108 (2008).
  6. Chiou, C. S., Hsu, S. Y., Chiu, S. I., Wang, T. K., Chao, C. S. Vibrio parahaemolyticus serovar O3:K6 as cause of unusually high incidence of food-borne disease outbreaks in Taiwan from 1996 to 1999. J Clin Microbiol. 38 (12), 4621-4625 (2000).
  7. Zhou, G., et al. PCR methods for the rapid detection and identification of four pathogenic Legionella spp. and two Legionella pneumophila subspecies based on the gene amplification of gyrB. Appl Microbiol Biotechnol. 91 (3), 777-787 (2011).
  8. Chen, J., Tang, J., Liu, J., Cai, Z., Bai, X. Development and evaluation of a multiplex PCR for simultaneous detection of five foodborne pathogens. J Appl Microbiol. 112 (4), 823-830 (2012).
  9. LeBlanc, J. J., et al. Switching gears for an influenza pandemic: validation of a duplex reverse transcriptase PCR assay for simultaneous detection and confirmatory identification of pandemic (H1N1) 2009 influenza virus. J Clin Microbiol. 47 (12), 3805-3813 (2009).
  10. Mahony, J. B., Chong, S., Luinstra, K., Petrich, A., Smieja, M. Development of a novel bead-based multiplex PCR assay for combined subtyping and oseltamivir resistance genotyping (H275Y) of seasonal and pandemic H1N1 influenza A viruses. J Clin Virol. 49 (4), 277-282 (2010).
  11. Alvarez, M. M., et al. Specific recognition of influenza A/H1N1/2009 antibodies in human serum: a simple virus-free ELISA method. PLoS One. 5 (4), e10176(2010).
  12. Huang, C. J., Dostalek, J., Sessitsch, A., Knoll, W. Long-range surface plasmon-enhanced fluorescence spectroscopy biosensor for ultrasensitive detection of E. coli O157:H7. Anal Chem. 83 (3), 674-677 (2011).
  13. Zhang, J., et al. Rapid visual detection of highly pathogenic Streptococcus suis serotype 2 isolates by use of loop-mediated isothermal amplification. J Clin Microbiol. 51 (10), 3250-3256 (2013).
  14. Han, F., Wang, F., Ge, B. Detecting potentially virulent Vibrio vulnificus strains in raw oysters by quantitative loop-mediated isothermal amplification. Appl Environ Microbiol. 77 (8), 2589-2595 (2011).
  15. Wang, J., et al. Rapid detection of pathogenic bacteria and screening of phage-derived peptides using microcantilevers. Anal Chem. 86 (3), 1671-1678 (2014).
  16. Banerjee, T., et al. Multiparametric Magneto-fluorescent Nanosensors for the Ultrasensitive Detection of Escherichia coli O157:H7. ACS Infect Dis. 2 (10), 667-673 (2016).
  17. Shelby, T., et al. Novel magnetic relaxation nanosensors: an unparalleled "spin" on influenza diagnosis. Nanoscale. 8, 19605-19613 (2016).
  18. Bui, M. P., Ahmed, S., Abbas, A. Single-Digit Pathogen and Attomolar Detection with the Naked Eye Using Liposome-Amplified Plasmonic Immunoassay. Nano Lett. 15 (9), 6239-6246 (2015).
  19. Farnleitner, A. H., et al. Rapid enzymatic detection of Escherichia coli contamination in polluted river water. Lett Appl Microbiol. 33 (3), 246-250 (2001).
  20. Huh, Y. S., Lowe, A. J., Strickland, A. D., Batt, C. A., Erickson, D. Surface-enhanced Raman scattering based ligase detection reaction. J Am Chem Soc. 131 (6), 2208-2213 (2009).
  21. Jayamohan, H., et al. Highly sensitive bacteria quantification using immunomagnetic separation and electrochemical detection of guanine-labeled secondary beads. Sensors (Basel). 15 (5), 12034-12052 (2015).
  22. Kaittanis, C., Naser, S. A., Perez, J. M. One-step, nanoparticle-mediated bacterial detection with magnetic relaxation. Nano Lett. 7 (2), 380-383 (2007).
  23. Meeker, D. G., et al. Synergistic Photothermal and Antibiotic Killing of Biofilm-Associated Staphylococcus aureus Using Targeted Antibiotic-Loaded Gold Nanoconstructs. ACS Infect Dis. 2 (4), 241-250 (2016).
  24. Wang, Y., Ye, Z., Si, C., Ying, Y. Subtractive inhibition assay for the detection of E. coli O157:H7 using surface plasmon resonance. Sensors (Basel). 11 (3), 2728-2739 (2011).
  25. Zhao, X., et al. A rapid bioassay for single bacterial cell quantitation using bioconjugated nanoparticles. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (42), 15027-15032 (2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Magneto fluorescent NanosensorsE coli O157 H7 DetectionAntibody ConjugationFluorescent Dye LoadingMagnetic RelaxationFluorescence Plate ReaderZetasizer AnalysisBacterial Contamination ScreeningPoint of Care DiagnosticsSpecificity Assays

Related Articles