Светосвязная реверсивная модуляция митоген-активированного пути протеинкиназы при дифференцировке клеток и<em&gt; Xenopus</em&gt; Эмбриональное развитие

Vishnu V. Krishnamurthy; Aurora J. Turgeon; John S. Khamo; Payel Mondal; Savanna R. Sharum; Wenyan Mei; Jing Yang; Kai Zhang

doi:10.3791/55823

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Светосвязная реверсивная модуляция митоген-активированного пути протеинкиназы при дифференцировке клеток и

8.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55823

⸱

15 июня 2017 г.

Vishnu V. Krishnamurthy^*¹ , Aurora J. Turgeon^*² , John S. Khamo¹ , Payel Mondal¹ , Savanna R. Sharum¹ , Wenyan Mei² , Jing Yang² , Kai Zhang¹^,³^,⁴

¹Department of Biochemistry, University of Illinois at Urbana-Champaign, ²Department of Comparative Biosciences, University of Illinois at Urbana-Champaign, ³Neuroscience Program, University of Illinois at Urbana-Champaign, ⁴Center for Biophysics and Quantitative Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign

^* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает оптигетную стратегию модуляции активности митоген-активированной протеинкиназы (MAPK) во время клеточной дифференцировки и эмбрионального развития Xenopus . Этот метод позволяет обратимую активацию сигнального пути MAPK в культуре клеток млекопитающих и в многоклеточных живых организмах, таких как эмбрионы Xenopus , с высоким пространственным и временным разрешением.

Аннотация

Киназная активность имеет решающее значение для множества клеточных функций, включая пролиферацию клеток, дифференцировку, миграцию и апоптоз. Во время раннего эмбрионального развития киназная активность очень динамична и широко распространена у эмбрионов. Фармакологические и генетические подходы обычно используются для исследования киназной активности. К сожалению, с помощью этих стратегий сложно достичь превосходного пространственного и временного разрешения. Кроме того, невозможно контролировать активность киназы обратимым образом в живых клетках и многоклеточных организмах. Такое ограничение остается узким местом для достижения количественного понимания активности киназы во время развития и дифференциации. В этой работе представлена оптогенетическая стратегия, в которой используется бицистронная система, содержащая фотоактивируемые белки Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) и N-концевой домен взаимодействующей с криптохром базовой спиральной спиральной спирали (CIBN). Реверси(MAPK) сигнальный путь достигается через посредство световой опосредованной транслокации белка в живых клетках. Такой подход может быть применен к культурам клеток млекопитающих и эмбрионам живых позвоночных. Эта бицистронная система может быть обобщена для контроля активности других киназ с аналогичными механизмами активации и может быть применена к другим модельным системам.

Введение

Факторы роста участвуют в широком спектре клеточных функций, включая пролиферацию, дифференцировку, миграцию и апоптоз, играют ключевую роль во многих биологических событиях, включая эмбриональное развитие, старение и регуляцию психического статуса ¹ ^, ² ^, ³ ^, ⁴ ^, ⁵ . Многие факторы роста сигнализируют через сложные внутриклеточные сигнальные каскады. Эти сигнальные события часто управляются обратимым фосфорилированием белка точно регулируемым способом ⁶ ^,