Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Единая методологическая основа для исследования везикулярной шванномы

7.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55827

⸱

20 июня 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Eaton Peabody Laboratories, Department of Otolaryngology, Massachusetts Eye and Ear, 2Department of Otolaryngology, Harvard Medical School, 3Department of Otolaryngology, Vienna General Hospital, Medical University of Vienna, 4Program in Speech and Hearing Bioscience and Technology, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Цель этого протокола состоит в том, чтобы наметить сбор и обработку человеческих хирургических образцов для нескольких нисходящих приложений в вестибулярной шванноме и исследованиях клеток Шванна.

Аннотация

Вестибулярные шванномы являются наиболее распространенными новообразованиями угла мозжечка, составляя 6-8% всех интракраниальных ростков. Хотя эти опухоли вызывают сенсорную потерю слуха у 95% пациентов, молекулярные механизмы, лежащие в основе этой потери слуха, остаются неуловимыми. В этой статье описываются этапы, установленные в нашей лаборатории для облегчения сбора и обработки различных первичных образцов тканей человека для последующих исследований, интегральных для изучения вестибулярных шванномов. В частности, эта работа описывает унифицированную методологическую основу для сбора, обработки и культивирования клеток Шванна и шванномы из хирургических образцов. Это интегрировано с параллельными этапами обработки, которые сейчас считаются необходимыми для текущих исследований: сбор опухолей и нервных секретов, сохранение РНК и экстракция белка из собранных тканей, фиксация ткани для подготовки секций,D воздействие первичных клеток человека на адено-ассоциированные вирусы для применения в генной терапии. Кроме того, в этой работе подчеркивается трансбрабиринтный хирургический подход, чтобы собрать эту опухоль как уникальную возможность получить сенсорный эпителий человека из внутреннего уха и перилимфа. Предусмотрены советы по улучшению качества эксперимента и выделены общие проблемы.

Введение

Vestibular schwannomas (VS) являются наиболее распространенными новообразованиями угла мозжечка, диагностированными в 1 из каждых 100 000 особей. Хотя они и не являются метастатическими, эти опухоли серьезно влияют на качество жизни пациента 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Пострадавшие люди обычно живут с потерей слуха, тиннитусом и чувством слуховой полноты. Симптомы становятся все более истощающими, когда опухоль растет, вызывая проблемы с балансом, лицевой паралич и ухудшение функций других черепных нервов. Также могут возникнуть опасные для жизни осложнения, связанные с компрессией мозга.

Варианты управления для ВС в основном ограничены внимательным ожиданием статических опухолей и стереотаксической лучевой терапии или хирургической резекцией для роста опухолей 8. Хирургическое удаление этих опухолей в научно-исследовательских больницах дает возможность приобретать и анализировать свежую опухолевую ткань, собранную во время операций пациента. Один конкретный хирургический подход к ВС, трансабиринтная резекция, может даже предложить доступ к ценному человеческому сенсорному эпителию из внутреннего уха и перилимфа.

Поскольку VS возникают из периферического сенсорного нерва ( т. Е. Вестибулярного нерва), важно сравнить VS-ассоциированные наблюдения с данными, полученными из соответствующего контрольного нерва, например, у человека с большим аурикулярным нервом (GAN). Здоровые ГАН регулярно жертвуют при паротидэктомии или диссекции шеи и могут использоваться в качестве надежных моделей для здоровой физиологии клеток Шванна 9 .

Поскольку нет лекарств, одобренных FDA для лечения или профилактики спорадических ВС, крайне важно, чтобы исследователи выяснили основные молекулярные мехиЧтобы определить терапевтические цели. Белки, которые, как было показано, играют роль в патогенезе VS, включают в себя мерлин, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), циклооксигеназу 2 (COX-2), ядерный фактор каппа B (NF-κB), фактор некроза опухолей альфа (TNF-альфа) , Рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) и связанные сигнальные молекулы 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .

Недавние достижения расширили и улучшили протоколы сбора, обработки, культивирования и последующего исследования первичных вестибулярных шванномов человека и здоровых нервных тканей 18 , 19 . Однако большинство существующих протоколов предназначены для( Например, только клеточная культура). В этой статье представлена ​​унифицированная методологическая основа для одновременной обработки одного первичного человеческого VS или образца GAN для нескольких последующих приложений: клеточная специфическая культура, экстракция белка, сохранение РНК, сбор опухолевых секретов и фиксация тканей. В этой работе также подробно описывается хирургический сбор и обработка спинномозговой жидкости человека (CSF) и перилимф во время трансабиринтной VS-резекции, поскольку эти тесно связанные ткани могут служить важными источниками биомаркеров для VS. Наконец, этот протокол представляет собой шаги для вирусной трансдукции первичных человеческих VS-клеток в культуре в качестве нового применения этой ткани для использования в генной терапии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Письменное информированное согласие на сбор всех образцов было получено до операции, и эксперименты проводились в соответствии с Кодексом этики Всемирной медицинской ассоциации (Хельсинская декларация). Все разделы протокола исследования были одобрены Управлением по надзору за исследованиями Массачусетской больницы для глаз и ушей и Массачусетса.

ПРИМЕЧАНИЕ. Разделы 1-7, приведенные ниже, предназначены для последовательного выполнения после получения первичного образца VS или GAN человека из операционной. Обработка всегда должна начинаться с раздела 1. Затем, как правило, сначала необходимо сохранить РНК (раздел 2), а затем подготовить ткань для сбора секретов (раздел 3) и экстракции белка (раздел 4). Ткани, подлежащие культивированию (раздел 5 для VS, раздел 6 для GAN), могут находиться в добавленной культуральной среде, тогда как секции 2, 3 и 4 выполняются. Фиксация ткани для секционирования (раздел 7) очень короткая и cВыполняются на любой стадии центрифугирования. Раздел 8 (обработка перилимфа) и раздел 9 (обработка CSF) может быть осуществлен после приема perilymph или CSF из операционной во время трансабиринтной VS-резекции. Раздел 10 (вирусная трансдукция) может быть проведен при выращивании клеток VS или Schwann в культуре.

1. Подготовка и получение хирургического образца

ПРИМЕЧАНИЕ. Следующие шаги должны выполняться в стерильной среде, такой как капюшон для тканевой культуры или ламинарный вытяжной шкаф. Ожидается знакомство с базовой стерильной техникой.

  1. Получение среды для первичной человеческой клеточной культуры человека или Шванна
    1. Оттепель 50 мл аликвоты замороженной эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) в 37 ° C водяной бане.
    2. Добавьте 5 мл смеси пенициллин / стрептомицин в 500 мл флакон DMEM / F-12, в результате чего окончательное разведение составляет 1: 100.
    3. Добавьте 50 мл талой FBS в 500 мл флакон DMEM / F-12,Что приводит к окончательному разведению 1:10.
    4. Напишите дату, инициалы исследователя и дополнительную информацию ( например, 1% P / S, 10% FBS) на бутылке.
    5. Поместите новую культуральную среду в холодильник (4 ° C).
  2. Получение и очистка образца VS или GAN
    1. В операционной комнате поместите только что собранный образец VS или GAN в стерильный солевой раствор в контейнер для образцов. Транспортируйте образец на льду из операционной в ламинарный вытяжной шкаф в лаборатории.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Размеры и вес образцов значительно варьируются между пациентами в зависимости от размера соответствующей опухоли или количества вырезанного нерва.
    2. Удалите из морозильника аликвоты щелочных растворов гиалуронидазы (25 000 Ед / мл) и коллагеназы (3200 Ед / мл) и заморозите ферменты при комнатной температуре (требуется для этапа 5.1.4 или 6.1.6 в зависимости от того, является ли образец VS или GAN).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Ресуспендирование лиофилизированных ферментов iПодробно описанные в информационных листах продуктов. Коллагеназу можно ресуспендировать в любом сбалансированном солевом растворе без кальция и гиалуронидазе в растворе 0,02 М фосфатного буфера (рН 7,0), 77 мМ NaCl и 0,01% 1 мг / мл бычьего сывороточного альбумина. Специфическая активность для каждого лиофилизированного фермента зависит от партии и должна быть проверена до ресуспендирования.
    3. Используя серию из трех пробирки объемом 1,5 мл, заполненных 1,4 мл 1x стерильного PBS, три раза промывайте образец VS или GAN. Осторожно передайте образец из трубки в трубку с помощью стерильных щипцов. Закройте каждую трубку, когда она содержит образец, и осторожно встряхните, чтобы вымыть.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Чтобы избежать наводнения 1,5-мл пробирки, менее 1,4 мл PBS можно использовать на пробирку, если опухолевая часть является большой.
    4. Поместите образец в сухую 60-миллиметровую чашку Петри и используйте щипцы для удаления всех мертвых тканей ( например, прижигаемых участков, которые обычно белые или непрозрачные по цвету) и области с видными кровеносными сосудами.
    5. Используйте fOrceps или скальпелевое лезвие для разделения образца на отдельные куски для сохранения РНК, экстракции белка, сбора секреции, фиксации и клеточной культуры (см. Разделы 2-6 ниже).
    6. Перенесите часть образца, предназначенную для культивирования клеток (раздел 5/6), на новую культуральную чашку 60 мм, содержащую 5-8 мл холодной, дополненной среды DMEM / F-12 (альтернативно, крышка первой чашки для культивирования может быть Используется для этого шага).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Требуемое количество среды DMEM / F-12 (начиная со стадии 1.1) будет зависеть от размера опухоли или нерва, но оно должно упасть от 5 до 8 мл. Этот кусок может находиться в культуральной среде, а последующие шаги выполняются.

2. Сохранение РНК ткани VS и GAN (также подходит для сенсорного эпителия человека)

  1. Под ламинарным вытяжным потоком переносите 1-1,2 мл раствора для стабилизации РНК в новую пробирку 1,5 мл.
  2. После промывки образца PBS (шаг 1.2.3), коротко окуните маленький пирогЦеллюлозы, предназначенной для сохранения РНК (приблизительно 3 мм 3 ВС или 5 мм длины ГАН) в раствор для стабилизации РНК. Убедитесь, что образец полностью погружен в раствор.
  3. Подготовьте и отметьте новую трубку объемом 1,5 мл. Извлеките образец из раствора для стабилизации РНК, перенесите его в новую пробирку и храните в морозильнике -80 ° C.

3. Сбор секретов ВС и ГАН

  1. 1 день
    1. После промывания образца PBS (шаг 1.2.3) поместите часть VS или GAN, предназначенную для сбора секретов, в пустую трубку объемом 1,5 мл.
    2. Подготовьте два дополнительных 1,5 мл пробирки и пипетку в каждую пробирку 500 мкл DMEM (не дополненной FBS).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Первая трубка DMEM будет использоваться для сбора опухолевых секретов, а вторая трубка DMEM будет использоваться в качестве согласованного контроля. Секреции можно собирать в DMEM, любой другой типичной культуральной среде, а неС добавлением сыворотки или PBS.
    3. Поместите одну из пробирок DMEM в градуированную цифровую шкалу. Тара масштаба, так что, когда трубка сидит на шкале, он читает 0 мг.
    4. Удалите трубку DMEM из шкалы, поместите образец образца, предназначенный для сбора выделений в трубку, и взвесьте его. Обратите внимание на результат, который будет представлять собой вес только ткани.
    5. Под ламинарным вытяжным потоком отрегулируйте объем DMEM в пробирке до 100 мкл на 10 мг образца.
    6. Поместите пробирку, содержащую образец ткани, и соответствующий им контроль (только DMEM) в инкубатор (37 ° C, 5% CO 2 ) в течение периода, соответствующего планам этого эксперимента. Инкубируйте ткань в течение по меньшей мере 72 часов для сбора биологически полезных количеств опухолей или нервных секретов 15 .
  2. День 4
    1. После инкубации в течение 72 ч удаляют содержащую секрецию среду из( Т. Е. Ткани с кондиционированной средой) с использованием 1 мл пипетки. Чтобы избежать повторных циклов замораживания-оттаивания, аликвотируйте среду в новые пробирки в соответствии с запланированными анализами ниже по течению ( например, для запуска ELISA с 4 лунками, требующими по 50 мкл каждый, могут быть получены аликвоты 210 мкл).
    2. При необходимости замораживайте кусочек ткани, оставшийся в исходной трубке (уже маркированной в День 1) при -80 ° C для дополнительных анализов, таких как извлечение ДНК, на более поздний срок.
    3. Храните ткань, выделения и контролируйте DMEM в морозильнике -80 ° C до тех пор, пока не начнутся нисходящие приложения ( например, ELISA, LC-MS / MS, цитокиновые массивы и т . Д. ).

4. Экстракция белка из ткани VS или GAN

  1. Получение обогащенного буфера RIPA
    1. Добавьте одну таблетку ингибитора фосфатазы и одну таблетку ингибитора протеазы в 10 мл буфера RIPA в пробирке объемом 15 мл; Это укрепленоБуфер RIPA.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Храните буфер RIPA при 4 ° C и добавляйте таблетки непосредственно перед использованием.
  2. Выделение белков
    1. Перенесите 210 мкл обогащенного буфера RIPA (этап 4.1.1) в новую 1,5 мл пробирку.
    2. После промывки образца с помощью PBS (шаг 1.2.3) переносите небольшой кусочек ткани, предназначенный для экстракции белка (приблизительно 3 мм 3 ВС или длиной 5 мм GAN) в трубку, содержащую буфер RIPA, и помещайте ее на лед В течение не менее 10 мин. При изучении фосфорилированных форм белков добавьте буфер RIPA ингибиторами протеазы и фосфатазы 14 . Тем временем могут быть выполнены шаги для других компонентов обработки ткани, такие как фиксация (раздел 7).
    3. Предварительно охладить центрифугу до 4 ° C.
    4. Используя пластиковый пестик, гомогенизируйте ткань в буфере, содержащей буфер RIPA. Сонатируйте ткань в течение 10-15 с при 20% амплитуде. Убедитесь, что образецОстается на льду даже во время обработки ультразвуком.
    5. Центрифугируют в течение 10 мин при 15000 × и 4 ° С.
    6. Выровняйте супернатант с шагом 50 мкл в новые 0,5 мл трубки (в зависимости от предполагаемых нижестоящих приложений можно выбрать любой размер приращения).
    7. Храните аликвоты белкового лизата в морозильнике -80 ° C до тех пор, пока не начнутся нисходящие приложения ( например, ELISA или вестерн-блоты) 20 , 21 .

5. Первичная культура ВС ВС

  1. 1 день
    1. Отделите ткань VS, предназначенную для культуры клеток (которая сидит в культуральной среде, как описано на стадии 1.2.6), приблизительно до 1 мм 3 штуки, используя пару щипцов в каждой руке.
    2. Аспирируйте среду, содержащую опухоль, с помощью 10 мл серологической пипетки и переносите все содержимое в коническую трубку емкостью 15 мл.
    3. Центрифуга в течение 3 мин при1000 xg и 25 ° C.
    4. Подготовьте среду для дезинтеграции в новой 60-миллиметровой культуральной чашке, объединив 4,7 мл добавленной среды DMEM / F-12 с 250 мкл коллагеназы (конечная концентрация: 160 ед / мл) и 50 мкл гиалуронидазы (конечная концентрация 250 Ед / мл) , Для конечного объема 5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Оба фермента следует хранить в морозильнике -20 ° C, но размораживать перед приготовлением этой среды (шаг 1.2.2).
    5. После центрифугирования кусочки опухоли образуют гранулу на дне конической трубки. Тщательно удалите пипеткой и выбросьте супернатант.
    6. Добавить 2 мл свежеприготовленной ферментсодержащей дезинтегрирующей среды (этап 5.1.4) в опухолевую таблетку. Несколько раз пипетируйте вверх и вниз, чтобы мобилизовать ткань и перенести среду, содержащую опухоль, в культуральную посуду 60 мм.
    7. Поместите культуральную чашку в инкубатор (37 ° C, 5% CO 2 ) в течение 18 часов.
  2. День 2
    1. Теплый DСреда MEM / F-12 с добавлением 10% FBS и 1% пенициллина / стрептомицина (полученного на стадии 1.1) в водяной бане с температурой 37 ° C.
    2. Удалите чашку Петри, содержащую VS-культуру, из инкубатора (шаг 5.1.7). Используя иглу 22 G, прикрепленную к шприцу объемом 6 мл, аспирируйте культурально-содержащую среду и перенесите ее в новую 15-миллилитровую коническую трубку.
    3. Центрифугируют в течение 5 мин при 1000 мкг и 37 ° С.
    4. Тем временем, используйте стерильные щипцы, чтобы поместить необходимое количество покровных покрытий с поли-D-лизином и ламинином в 24-луночный планшет.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Количество колодцев, подлежащих культивированию, зависит от размера образца; Приблизительно 24-32 лунки можно культивировать с 1 см 3 опухоли, поэтому для большинства меньших опухолей целесообразно планировать 8-16 лунок культивируемых клеток.
    5. После центрифугирования отбрасывают супернатант ( то есть среду, обогащенную ферментами) и ресуспендируют остаточный клеточный осадок в свежей, дополненной среде DMEM / F-12, предварительно нагретойНа этапе 5.2.1.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Объем ресуспендирования гранулы определяется количеством скважин, запланированных на этапе 5.2.4, с оценкой 1 мл среды в плановой скважине.
    6. Аспирируют 2 мл ресуспендированной клеточной среды (этап 5.2.5) с использованием 5 мл серологической пипетки. Поместите 1 мл среды, содержащей опухолевые клетки, в каждую подготовленную лунку 24-луночного планшета.
    7. Продолжайте аспирирование и осаждение среды, содержащей опухолевые клетки (аспирация с шагом 2 мл, из которой 1 мл осаждается в каждую запланированную скважину) до тех пор, пока суспензия опухолевых клеток не будет поделена поровну между всеми подготовленными лунками.
    8. Поместите 24-луночный планшет в инкубатор с температурой 37 ° С в течение ночи.
  3. День 3
    1. Если на дне колодцев отмечается значительный обломки, осторожно измените среду в каждой лунке на новую добавленную культуральную среду DMEM / F-12, стараясь не выщелачивать адгезивные клетки. Если нет, верните пластину в инкубатор и измените ееПервый в первый раз на 5-й день.
  4. Дни 5-7 и после
    1. Изменяйте среду каждые 3 дня.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Первичные клетки VS и GAN человека обычно поддерживаются в культуре до тех пор, пока они не будут использованы в нисходящих приложениях в возрасте 14 дней или около 14 лет. После этого чистота культуры уменьшается.

6. Первичная культура человеческого GAN

  1. 1 день
    1. Под рассекающим микроскопом выделяют пучки из ткани, обозначенной для культуры GAN (которая сидит в культуральной среде, как указано на этапе 1.2.6).
      1. Выделите пучки из эпинеурия и волокнистой оболочки, потянув за перинеурий, используя нет. 5 щипцов, сжимая эпиневриум, нет. 3 пинцета.
    2. Как только пучки достаточно изолированы от окружающего эпинеурия, перенесите их в новое блюдо для культуры, содержащее 2 мл свежего суп.
    3. Отрежьте пучки на 1 - 2 мм сегменты, используя лезвие скальпеля.
    4. Пипеткой мелкие кусочки и окружающая среда в 15 мл пробирку, содержащую 3 мл свежей добавленной культуральной среды, так что общий объем в 15-мл пробирке становится 5 мл.
    5. Центрифугируйте образец в течение 3 минут при 1000 xg и 25 ° C.
    6. Тем временем сделайте среду культивирования клеток Шванна в новой 60-миллиметровой чашке Петри, объединив 4,7 мл добавленной среды DMEM / F-12, 250 мкл коллагеназы и 50 мкл гиалуронидазы для конечного объема 5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Храните оба фермента при -20 ° C; Оттаивают их при комнатной температуре перед приготовлением этой среды (этап 1.2.2).
    7. После центрифугирования образца пучки будут конденсироваться в небольшой шарик в конической трубке. Отбросьте супернатант.
    8. Добавьте 2 мл свежеприготовленной ферментсодержащей дезинтегрирующей среды (этап 6.1.6) в нервную таблетку. Пипеткой и dНесколько раз, чтобы мобилизовать ткань и перенести ее на новое блюдо культуры 60 мм.
    9. Поместите блюдо в инкубатор (37 ° C, 5% CO 2 ) в течение 20-22 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Это более длительная инкубация, чем требуется для образцов VS (шаг 5.1.7).
  2. День 2
    1. Теплая добавленная среда DMEM / F-12 в водяной бане с температурой 37 ° C.
    2. Используя иглу 22 G, прикрепленную к 6-мл шприцу, аспирируйте среду, содержащую культуру клеток, и перенесите ее в новую 15-миллилитровую коническую пробирку.
    3. Центрифугируют в течение 5 мин при 1000 мкг и 37 ° С.
    4. Удалите супернатант и повторно суспендируйте образец в новой, предварительно нагретой, дополненной среде DMEM / F-12.
    5. Используйте стерильные щипцы, чтобы поместить необходимое количество покровных покрытий с покрытием в лунки 24-луночного культурального планшета.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Вычисление двух лунок культивируемых клеток на 1-сантиметровый образец нерва способствует устойчивому росту культуры.
    6. Добавьте 1 мл среды, содержащей культуру, в каждуюХорошо обозначен в 24-луночном планшете.
    7. Поместите 24-луночный планшет в инкубатор при температуре 37 ° C и 5% CO 2 .
  3. День 3
    1. Если в лунках отмечается значительный мусор, тщательно замените среду новой добавленной культуральной средой DMEM / F-12, стараясь не выщелачивать адгезивные клетки. Если нет, верните пластину в инкубатор и сначала замените носитель в день 5.
  4. Дни 5-7 и после
    1. Изменяйте среду каждые 3 дня.

7. Фиксация ткани VS & GAN

  1. Внесите 1-1,2 мл 4% параформальдегида (PFA, ВНИМАНИЕ) в новую пробирку 1,5 мл.
  2. После промывки опухоли или нерва PBS (шаг 1.2.3) перенесите небольшой кусочек ткани (приблизительно 3 мм 3 VS или 5 мм длины GAN) в 4% PFA и поместите пробирку на шейкер при 4 ° C. Убедитесь, что образец полностью погружен в tОн решение.
  3. После не менее 2 ч фиксации извлеките трубку из шейкера и продолжайте дальнейшую обработку ( например, встраивание в парафин или оптимальное количество для резки (OCT) для последующей иммуногистохимии или иммунофлуоресценции) 22 , 23 , 24 . Альтернативно, ткань можно замораживать, как описано ранее 25 , 26 .

8. Сбор и хранение человеческого перилимфа во время транслябиринтинной VS-резекции

  1. Поместите три стерильных 1,5 мл трубки на лед.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Одна трубка будет храниться как резервная копия в случае загрязнения.
  2. Заполните одну 1,5 мл пробирку примерно 1,2 мл раствора PBS, который дважды фильтруют с использованием фильтра 0,22 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Чтобы собрать perilymph во время transabyrinthine VS резекции, хирург должен сначала убедиться, что хирургиКалорийное поле не содержит костной пыли, крови или физиологического раствора. Для этой цели хирург может использовать всасывающую трубку Schuknecht 21 или 24 G в не доминирующей руке.
    Типичным местом для извлечения перилимф является боковой полукруглый канал (однако, задний полукруглый канал или мембрана с круглым окном также могут быть доступны в зависимости от предпочтения хирурга). Хирург должен тщательно удалить лабиринтную кость с помощью алмазного бура (при использовании непрерывного всасывающего орошения), чтобы идентифицировать синюю линию ( т. Е. Мембранный лабиринт) полукруглого канала. Полукруглый канал проникает через синюю линию, используя длинную иглу 27 G, прикрепленную к 1 мл туберкулиновому шприцу.
  3. Попросите хирурга осторожно аспирировать небольшое количество перилимфа, а затем пропустите шприц и прикрепите иглу к хирургической медсестре.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Как правило, выпадает капля perilymph или меньше. Если наблюдаемый объем больше, образец, вероятно, загрязнен другими fLUID.
  4. Откройте подготовленную, пустую трубку объемом 1,5 мл и пробирку, заполненную PBS непосредственно перед использованием. Будьте осторожны, чтобы не прикасаться к внутренней части крышек труб при их открытии.
  5. Получите шприц и прикрепленную иглу от хирургической медсестры и полностью очистите жидкость до пустой трубки, стараясь не касаться самой трубки иглой.
  6. Осторожно отсоедините иглу от шприца. Не загрязняйте наконечник иглы и продолжайте удерживать ее в одной руке.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Очень маленький объем перилимфы собран, поэтому некоторые жидкости могут оставаться на длинном кончике иглы.
  7. С другой стороны, используйте сам шприц (без иглы), чтобы сосать 0,2 мл отфильтрованного раствора PBS из подготовленной трубки в корпус шприца.
  8. Верните иглу в шприц. Полностью эвакуируйте шприц в трубку, содержащую перилимф, используя стерильный PBS для промывки наконечника иглы.
  9. Закройте пробирку, содержащую перилимф и PBS, и место Это на льду.
  10. Утилизируйте иглу в контейнере для острых предметов.
  11. Поместите трубку, содержащую перилимф, в морозильник -80 ° C как можно скорее.

9. Сбор и хранение CSF человека

  1. Поместите три (или более) стерильных 1,5 мл пробирки на лед.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Одна трубка будет резервной в случае загрязнения или объема образца, который больше, чем ожидалось.
  2. После открытия твердой мозговой оболочки попросите хирурга собрать CSF с 3 мл шприцем (без прикрепленной иглы).
    ПРИМЕЧАНИЕ. Чтобы предотвратить загрязнение, сбор CSF должен происходить сразу же после открытия твердой мозговой оболочки.
  3. Попросите хирурга передать шприц хирургической медсестре.
  4. Получите шприц от хирургической медсестры и полностью эвакуируйте необходимый объем CSF в пробирку (и).
  5. Закройте трубку (ы) и поместите их на лед.
  6. Поместите трубку (-и) в морозильник -80 ° C как можно скорее.
E "> 10. Эксперименты по вирусной трансдукции для первичных клеток VS

  1. Используя концентрацию вирусного запаса в качестве эталона, вычислите требуемое количество генома (gc) и множественность инфекции (MOI), необходимые для предлагаемого эксперимента по трансдукции; Вирусный материал можно развести непосредственно в добавленную культуральную среду.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Любой вирусный вектор, подходящий для первичной клеточной трансдукции, может быть использован; См. Landegger et al. (2017) для детального сравнения шести различных серотипов, связанных с адено-ассоциированными вирусами 27 . Кроме того, при культивировании первичных клеток человека количество клеток обычно не определяется перед нанесением покрытия на покровные стекла. Первичные VS-клетки плохо реагируют на трипсинизацию и пассирование, поэтому для надежного расчета MOI количество адгезивных клеток на лунку можно оценить с помощью фазово-контрастного микроскопа. Альтернативно, если ячейки близки к слиянию, их числа могут быть надежно оценены с использованием стандартных значений плотности ячеек для24-луночный планшет ( например, 5 × 10 4 клетки на лунку).
  2. Под ламинарным вытяжным потоком подготовьте добавленную среду, содержащую требуемое количество вируса, в 15 мл конической лабораторной пробирке, так что 1 мл вируссодержащей среды готовят для каждой лунки клеток, подлежащих трансмутации. Пипеткой, содержащей вирусы, вверх и вниз, чтобы перемешать осторожно, но тщательно.
  3. Используя стерильные щипцы, перенесите покровные стекла, содержащие первичные клетки VS (этап 5.2.8), из исходной 24-луночной планшеты на новую 24-луночную планшета. После переноса каждого покровного лица добавьте 1 мл вирусосодержащей среды. Закручивайте пластину каждый раз, когда добавляется среда, чтобы обеспечить равномерное покрытие клеток вирусом.
  4. Инкубируйте при 37 ° C и 5% CO 2 в течение всего запланированного эксперимента.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Инкубации в пределах от 48 до 120 ч показали многообещающие результаты трансдукции 27 .

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Первичные человеческие ВС-клетки в культуре, как установлено в разделе 5, можно рассматривать как информативные модели связанных с болезнями процессов во многих последующих исследовательских приложениях ( рисунок 1 ). Здоровые клетки Шванна, культивированные в разделе 6, обеспечивают прямую и поучительную точку сравнения. Как указано ниже, обширные данные от VS и GAN, обработанных в соответствии с этой унифицированной методологической структурой, доступны в ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этой рукописи описывается унифицированная методологическая основа исследования VS, в которой описывается одновременная обработка образцов VS и GAN человека для последующих исследований. Поскольку исследование VS входит в эпоху прецизионной медицины, подготовка одного и того же образца в формах, способных отвечать на многочисленные исследовательские вопросы, позволит обнаружить молекулярные, клеточные, генетические и протеомические свойства, характерные для отдельных пациентов.

Чистоту чело...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным институтом глухоты и других расстройств связи грантов R01DC015824 (KMS) и T32DC00038 (поддержка JES и SD), грант Министерства обороны W81XWH-14-1-0091 (KMS), Фонд Bertarelli (KMS) , Фонд Нэнси Сэйлса (KMS), Исследовательский центр Lauer Tinnitus Research (KMS) и Фонд Барнса (KMS).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin 12 мм #1 Немецкое стекло CoverslipCorning 354087Или подготовьте покровные стекла с Corning Laminin (CB-40232) и Cultrex Poly-L-Lysine (3438-100-01)
CELLSTAR 15 мл Центрифужные пробирки, коническое дно, градуировка, стерильныеGreiner Bio-One188161
CELLSTAR 50 мл Центрифужные пробирки, коническое дно, градуировка, стерильныеGreiner Bio-One227261
Чашка для клеточных культур CELLSTAR, 60 ммGreiner Bio-One628160
Коллагеназа из Clostridium histolyticum, стерильно отфильтрованнаяSigma-AldrichC1639
Costar 24 Хорошо прозрачные многолуночные планшеты, обработанные TC, стерильные3526
DAPI (4',6-Диамидино-2-фенилиндол, дигидрохлорид)Thermo Fisher ScientificD1306
DMEM, высокий уровень глюкозы, пируват, без глутамина, 500 млThermo Fisher Scientific10313-039
DMEM/F-12, 500 млThermo Fisher Scientific11320-033
Щипцы Dumont #3, DumoxelFine Science Tools11231-30Автоклав перед использованием
Щипцы Dumont #5, стандартный наконечник,автоклавFine Science Tools11251-20
Фетальная бычья сыворотка, сертифицированная, одобренная Министерством сельского хозяйства США, 500 млThermo Fisher Scientific10437-028Аликвота в пробирках по 50 мл и хранить при температуре -20°С; C морозильная камера
Гиалуронидаза из яичек крупного рогатого скота, тип I-S, лиофилизированный порошокSigma-AldrichH3506
Millex-GP Шприцевой фильтрующий блок, 0,22 &; m, полиэфирсульфон, 33 мм, стерильныйEMD MilliporeSLGP033RS
параформальдегид, класс реагента, кристаллическийSigma-AldrichP6148Перед использованием: Установите стандартные операционные процедуры на основе протоколов, доступных в Интернете
PBS, pH 7,4, 500 млThermo Fisher Scientific10010-023Autoclave перед применением
Пенициллин-стрептомицин (10 000 Ед/мл), 100 млThermo Fisher Scientific15140-122
Таблетки ингибитора фосфатазы PhosSTOPТаблетки
PierceThermo Fisher Scientific88666
Пипетки и наконечники для пипеток, 5/10/25 млВариабельныйпестик
гомогенизации пластика объемом 1,5/2,0 мл МикропробиркиE& Иглы K ScientificEK-10539
PrecisionGlide, 27 г x 1 1/2 inBD301629
RIPA BufferBoston BioProductsBP-115
RNAlater (раствор для стабилизации РНК)Thermo Fisher ScientificAM7021
Safe-Lock Микроцентрифужные пробирки, полипропилен, 0,5 млEppendorf022363719автоклав перед использованием
Safe-Lock Микроцентрифужные трубки, полипропилен, 1,5 млEppendorf022363204автоклав перед использованием
физиологического раствора - 0,9% натрия хлорид для инъекций, бактериостатический, 20 млHospira0409-1966-05
Лезвия скальпеля - #15Fine Science Tools10015-00
Schuknecht Всасывающая трубка 24 калибрBausch + LombN1698 42Полезно для хирургического подхода (в дополнение к обычным отологическим хирургическим инструментам) и например синий хирургический маркер
Контейнер для образцов, ИЛИ стерильный, 4 унцииMedlineDYND30331H
Stemi 2000-C СтереомикроскопZeiss000000-1106-133
Комбинация шприца/иглы, наконечник Люэра-Лока, 5 мл, 22 г x 1 дюйм.BD309630
Только туберкулиновый шприц, скользящий наконечник, 1 млBD309659
только туберкулиновый шприц, скользящий наконечник, 3 млBD309656
ультразвуковой гомогенизатор, серия 4710, зонд CV18Cole-ParmerCP25013
DAPI Inox перед использованием ингибитора протеазы Roche 04906845001 для

Ссылки

  1. Babu, R., et al. Vestibular schwannomas in the modern era: epidemiology, treatment trends, and disparities in management. J Neurosurg. 119 (1), 121-130 (2013).
  2. Gal, T. J., Shinn, J., Huang, B. Current epidemiology and management trends in acoustic neuroma. Otolaryngol Head Neck Surg. 142 (5), 677-681 (2010).
  3. Propp, J. M., McCarthy, B. J., Davis, F. G., Preston-Martin, S. Descriptive epidemiology of vestibular schwannomas. Neuro Oncol. 8 (1), 1-11 (2006).
  4. Stangerup, S. E., Tos, M., Thomsen, J., Caye-Thomasen, P. True incidence of vestibular schwannoma? Neurosurgery. 67 (5), 1335-1340 (2010).
  5. Tos, M., Stangerup, S. E., Caye-Thomasen, P., Tos, T., Thomsen, J. What is the real incidence of vestibular schwannoma? Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 130 (2), 216-220 (2004).
  6. Stangerup, S. E., Caye-Thomasen, P. Epidemiology and natural history of vestibular schwannomas. Otolaryngol Clin North Am. 45 (2), 257-268 (2012).
  7. Mahaley, M. S., Mettlin, C., Natarajan, N., Laws, E. R., Peace, B. B. Analysis of patterns of care of brain tumor patients in the United States: a study of the Brain Tumor Section of the AANS and the CNS and the Commission on Cancer of the ACS. Clin Neurosurg. 36, 347-352 (1990).
  8. Carlson, M. L., Link, M. J., Wanna, G. B., Driscoll, C. L. Management of sporadic vestibular schwannoma. Otolaryngol Clin North Am. 48 (3), 407-422 (2015).
  9. Dilwali, S., et al. Sporadic vestibular schwannomas associated with good hearing secrete higher levels of fibroblast growth factor 2 than those associated with poor hearing irrespective of tumor size. Otol Neurotol. 34 (4), 748-754 (2013).
  10. Caye-Thomasen, P., et al. VEGF and VEGF receptor-1 concentration in vestibular schwannoma homogenates correlates to tumor growth rate. Otol Neurotol. 26 (1), 98-101 (2005).
  11. Koutsimpelas, D., et al. The VEGF/VEGF-R axis in sporadic vestibular schwannomas correlates with irradiation and disease recurrence. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 74 (6), 330-338 (2012).
  12. Dilwali, S., Roberts, D., Stankovic, K. M. Interplay between VEGF-A and cMET signaling in human vestibular schwannomas and schwann cells. Cancer Biol Ther. 16 (1), 170-175 (2015).
  13. Dilwali, S., Kao, S. Y., Fujita, T., Landegger, L. D., Stankovic, K. M. Nonsteroidal anti-inflammatory medications are cytostatic against human vestibular schwannomas. Transl Res. 166 (1), 1-11 (2015).
  14. Dilwali, S., et al. Preclinical validation of anti-nuclear factor-kappa B therapy to inhibit human vestibular schwannoma growth. Mol Oncol. 9 (7), 1359-1370 (2015).
  15. Dilwali, S., Landegger, L. D., Soares, V. Y., Deschler, D. G., Stankovic, K. M. Secreted Factors from Human Vestibular Schwannomas Can Cause Cochlear Damage. Sci Rep. 5, 18599(2015).
  16. Blakeley, J. Development of drug treatments for neurofibromatosis type 2-associated vestibular schwannoma. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 20 (5), 372-379 (2012).
  17. Schroeder, R. D., Angelo, L. S., Kurzrock, R. NF2/merlin in hereditary neurofibromatosis 2 versus cancer: biologic mechanisms and clinical associations. Oncotarget. 5 (1), 67-77 (2014).
  18. Schularick, N. M., Clark, J. J., Hansen, M. R. Primary culture of human vestibular schwannomas. J Vis Exp. (89), (2014).
  19. Dilwali, S., et al. Primary culture of human Schwann and schwannoma cells: improved and simplified protocol. Hear Res. , 25-33 (2014).
  20. Brown, C. M., Ahmad, Z. K., Ryan, A. F., Doherty, J. K. Estrogen receptor expression in sporadic vestibular schwannomas. Otol Neurotol. 32 (1), 158-162 (2011).
  21. Cioffi, J. A., et al. MicroRNA-21 overexpression contributes to vestibular schwannoma cell proliferation and survival. Otol Neurotol. 31 (9), 1455-1462 (2010).
  22. Doherty, J. K., Ongkeko, W., Crawley, B., Andalibi, A., Ryan, A. F. ErbB and Nrg: potential molecular targets for vestibular schwannoma pharmacotherapy. Otol Neurotol. 29 (1), 50-57 (2008).
  23. Aguiar, P. H., Tatagiba, M., Samii, M., Dankoweit-Timpe, E., Ostertag, H. The comparison between the growth fraction of bilateral vestibular schwannomas in neurofibromatosis 2 (NF2) and unilateral vestibular schwannomas using the monoclonal antibody MIB 1. Acta Neurochir (Wien). 134 (1-2), 40-45 (1995).
  24. Cattoretti, G., et al. Monoclonal antibodies against recombinant parts of the Ki-67 antigen (MIB 1 and MIB 3) detect proliferating cells in microwave-processed formalin-fixed paraffin sections. J Pathol. 168 (4), 357-363 (1992).
  25. Hung, G., et al. Immunohistochemistry study of human vestibular nerve schwannoma differentiation. Glia. 38 (4), 363-370 (2002).
  26. Archibald, D. J., et al. B7-H1 expression in vestibular schwannomas. Otol Neurotol. 31 (6), 991-997 (2010).
  27. Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
  28. Zinn, E., et al. In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector. Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).
  29. Kim, B. G., et al. Sulforaphane, a natural component of broccoli, inhibits vestibular schwannoma growth in vitro and in vivo. Sci Rep. 6, 36215(2016).
  30. Soares, V. Y., et al. Extracellular vesicles derived from human vestibular schwannomas associated with poor hearing damage cochlear cells. Neuro Oncol. 18 (11), 1498-1507 (2016).
  31. Lysaght, A. C., et al. Proteome of human perilymph. J Proteome Res. 10 (9), 3845-3851 (2011).
  32. Caye-Thomasen, P., Borup, R., Stangerup, S. E., Thomsen, J., Nielsen, F. C. Deregulated genes in sporadic vestibular schwannomas. Otol Neurotol. 31 (2), 256-266 (2010).
  33. Schulz, A., et al. The importance of nerve microenvironment for schwannoma development. Acta Neuropathol. 132 (2), 289-307 (2016).
  34. Torres-Martin, M., et al. Global profiling in vestibular schwannomas shows critical deregulation of microRNAs and upregulation in those included in chromosomal region 14q32. PLoS One. 8 (6), e65868(2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Единая методологическая основа для исследования везикулярной шванномы
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.