Методическая статья

Геномное картирование белково-ДНК-взаимодействий с ChEC-seq in Разное

DOI:

10.3791/55836

⸱

3 июня 2017 г.

 , 
1Basic Sciences Division, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Department of Biology, Indiana University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем эндогенное расщепление хроматина в сочетании с высокопроизводительным секвенированием (ChEC-seq), хромопатическим иммунопреципитацией (ChIP) -ортогональным методом для картирования сайтов связывания с белками генома с гибридными белками с микрококковой нуклеазой (MNase).

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Геномное картирование взаимодействия белок-ДНК имеет решающее значение для понимания регуляции генов, ремоделирования хроматина и других хроматиновых резидентных процессов. Сформирование формальдегида с последующей иммунопреципитацией хроматина и секвенированием с высокой пропускной способностью (X-ChIP-seq) было использовано для получения многих ценных сведений о биологии генома. Однако X-ChIP-seq имеет значительные ограничения, связанные с сшиванием и ультразвуком. Родной ChIP избегает этих недостатков, исключая сшивание, но часто приводит к плохому восстановлению связанных с хроматином белков. Кроме того, все методы на основе ChIP подвержены соображениям качества антител. Для картирования белково-ДНК-взаимодействий также использовались ферментативные методы картирования белково-ДНК-взаимодействий, которые включают слияние белка, представляющего интерес для модифицирующего ДНК фермента. Недавно мы объединили один такой метод - хроническое эндогенное расщепление (ChEC), с высокопроизводительным секвенированием как ChEC-seq. ChEC-seq полагается на слияние хроматина-ассоциированногоКоторый представляет интерес для микрококковой нуклеазы (МНКазы) для получения целенаправленного расщепления ДНК в присутствии кальция в живых клетках. ChEC-seq не основан на иммунопреципитации и поэтому обходит потенциальные проблемы с сшиванием, ультразвуком, солюбилизацией хроматина и качеством антител, обеспечивая при этом отображение высокого разрешения с минимальным фоновым сигналом. Мы предполагаем, что ChEC-seq станет мощным партнером ChIP, предоставляя независимые средства, позволяющие как проверять результаты ChIP-seq, так и открывать новые представления о геномном регулировании.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сопоставление сайтов связывания факторов транскрипции (ТФ), ремоделиров хроматина и других связанных с хроматином регуляторных факторов является ключом к пониманию всех процессов на основе хроматина. В то время как подходы хромотанового иммунопреципитации и высокопроизводительного секвенирования (ChIP-seq) были использованы для получения многих важных сведений о биологии генома, они имеют значительные ограничения. Недавно мы представили альтернативный метод, называемый эндогенным расщеплением хроматина и секвенированием с высокой пропускной способностью (ChEC-seq) 1 , чтобы обойти эти недостатки.

ChIP-seq чаще всего проводят с начальной стадией поперечной сшивки формальдегида (X-ChIP-seq) для сохранения взаимодействия белок-ДНК. Однако в ряде недавних исследований было показано, что X-ChIP-seq захватывает переходные или неспецифические белково-ДНК-взаимодействия 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , что приводит к появлению ложноположительных сайтов связывания. Кроме того, обработка ультразвуком, обычно используемая для фрагментации хроматина в экспериментах X-ChIP-seq, предпочтительно сдвигает области открытого хроматина, что приводит к необъективному извлечению фрагментов из этих областей 9 , 10 . Ультразвук также дает гетерогенную смесь длин фрагментов, в конечном счете ограничивая разрешение сайта-сайта, хотя добавление стадии экстрагирования экзонуклеазой может значительно улучшить разрешение 11 , 12 . Нативные методы ChIP, такие как оккупированные области геномов из очищенного от аффинности естественно выделенного хроматина (ORGANIC) 13 , не используют сшивание и фрагмент хроматина с микрококковой нуклеазой (MNase), уменьшая потенциальные смещения, связанные с сшиванием формальдегида и ультразвуком. Однако,Растворимость многих белков, связанных хроматинами, в относительно мягких условиях, необходимых для естественной экстракции хроматина, является плохим, что потенциально приводит к уменьшению динамического диапазона и / или ложных негативов 14 .

В то время как различные итерации ChIP-seq наиболее часто используются для картирования белок-ДНК в геноме, были также реализованы несколько методов картирования, основанных на слиянии белков, представляющих интерес для различных модифицирующих ДНК ферментов. Одним из таких подходов является идентификация ДНК-аденин-метилтрансферазы ДНК (DamID) 15 , где интересующий хроматин белок, представляющий интерес, генетически слит с плотиной, и этот синтез экспрессируется в клетках или животных, что приводит к метилированию последовательностей GATC, близких к сайтам связывания белка. DamID выгодно тем, что он не полагается на иммунопреципитацию и поэтому избегает сшивания, антител или солюбилизации хроматина. Он также выполняется in vivo . Однако, Разрешение DamID ограничено шкалой килобаз, и метилирующая активность слитого белка плотины является конститутивной. Второй способ, основанный на ферментативном слиянии, - это Calling Card-seq 16 , в котором используется слияние интересующего фактора с транспозазой, направляя специфическую для сайта интеграцию транспозонов. Подобно DamID, Calling Card-seq не основан на иммунопреципитации и, следовательно, имеет схожие преимущества, с дополнительным преимуществом повышенного разрешения. Однако Call-Card-seq может быть ограничена последовательными смещениями транспозаз и также зависит от наличия сайтов рестрикции, близких к сайтам вставки транспозонов.

Третий метод ферментативного слияния, разработанный в лаборатории Laemmli, представляет собой эндогенное расщепление хроматина (ChEC) 17 . В ChEC слияние между хроматин-ассоциированным белком и MNase экспрессируется в клетках, а после добавления кальция для активации MNase ДНК расщепляется проксимально к сайтам связывания для меченыхФактора ( рис. 1 ). В сочетании с Саузерн-блоттингом ChEC использовался для характеристики структуры хроматина и связывания белка в ряде отдельных локусов в дрожжах 17 , 18 и был объединен с микроматричным анализом с низким разрешением для зондирования взаимодействия компонентов ядерных пор с дрожжами Геном 19 . ChEC предлагает преимущества, подобные DamID и Calling Card-seq, и его разрешение почти однопалубной пары при анализе с помощью расширения 19 праймера. ChEC также контролируема: надежное расщепление ДНК с помощью MNase зависит от добавления миллимолярного кальция, гарантируя, что MNase неактивен при низких концентрациях свободного кальция, наблюдаемых в живых дрожжевых клетках 20 .

Ранее мы предположили, что объединение ChEC с высокопроизводительным секвенированием (ChEC-seq) обеспечит карты с высоким разрешением сайтов привязки TF. Действительно, ChEC-seq генерирует карты высокого разрешения почкообразующих общих регуляторных факторов (GRF) Abf1, Rap1 и Reb1 в геноме 1 . Мы также успешно применили ChEC-seq к модульному медиаторному комплексу, сохраняющемуся, существенному глобальному транскрипционному коактиватору 21 , расширяющему применимость ChEC-seq к комплексам размером в мегадальтон, которые напрямую не связаны с ДНК и могут быть трудно отображены ChIP- Основанные методы. ChEC-seq является мощным методом как для независимой проверки результатов ChIP-seq, так и для генерации новых представлений о регулировании хроматин-резидентных процессов. Здесь мы представляем пошаговый протокол для реализации этого метода в почкодоносных дрожжах.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Генерация дрожжевых штаммов

  1. Генерируйте дрожжевой штамм, несущий фактор интереса, помеченный MNase.
    1. ПЦР амплифицируют кассету для маркировки MNase из желаемого вектора ( таблица 1 ), используя указанную реакционную смесь ( таблица 2 ) и условия циклирования ( таблица 3 ). Смешайте 5 мкл реакции ПЦР и 1 мкл 6X-загружающего ДНК ДНК. Проводите каждую аликвоту ПЦР на 0,8% агарозном геле при 120 В в течение 40 мин. Ожидаемый размер продукта ~ 2,3 кб.
    2. Преобразуйте усиленную кассету с мечением в выбранный штамм, используя стандартное преобразование 22 ацетата лития и выполняйте селекцию.
    3. Проверьте правильность интеграции кассеты с мечением с колониальной ПЦР.
      1. Подготовьте указанную реакционную смесь ( таблица 4 ) для количества колоний, подлежащих скринингу. Держите на льду, пока это не понадобится.
      2. Выберите часть каждой колонии, которая будетВ нижней части ПЦР-трубки, используя стерильную зубочистку или наконечник пипетки.
      3. Микроволны выбрали колонии при высокой мощности в течение 1 мин.
      4. Добавьте 50 мкл ПЦР-смеси ( таблица 4 ) в каждую микроволновую колонию и пипетку вверх и вниз для смешивания. Выполните ПЦР с использованием указанных условий циклирования ( Таблица 5 ).
      5. Смешайте 50 мкл реакции ПЦР и 10 мкл 6X ДНК-загружающего красителя непосредственно в каждой ПЦР-трубке. Прогон 10 мкл каждого образца на 1% агарозном геле при 120 В в течение 40 мин. Ожидаемый размер продукта ~ 700 б.п.
        ПРИМЕЧАНИЕ. При желании проверьте правильную экспрессию слитого белка MNase через вестерн-блоттинг. Ожидается сдвиг молекулярной массы меченого белка на 20,6 килодальтона.
  2. Генерируют свободный штамм MNase путем гомологического клонирования промотора интересующего гена в pGZ136 (таблица 1) и трансформации и отбора, как на этапе 1.1.2.
    1. AlternatiСобирают промотор интересующего гена и 3 × FLAG-MNase-SV40 NLS в вектор плазмиды, трансформируют и выбирают так же, как на этапе 1.1.2, и вырабатывают штамм в соответствующем селективном состоянии для поддержания плазмиды.

2. ЧЕК

  1. Во второй половине дня / вечером за день перед экспериментом ChEC инокулируйте 3 мл дрожжево-пептон-декстрозы (YPD) или подходящую селективную среду с одной колонией штамма, несущей фактор, меченный MNase. Инкубируйте эту культуру в течение ночи (180 об / мин встряхивания, 30 ° C).
  2. Утром дня эксперимента ChEC разбавьте ночную культуру до 50 мл среды до оптической плотности при 600 нм (OD 600 ) 0,2-0,3. Инкубируйте эту культуру (180 об / мин встряхивания, 30 ° C), пока она не достигнет OD 600 0,5-0,7. По мере приближения культуры к соответствующему OD 600 , установите тепловой блок или водяную баню до 30 ° C и начните оттаивать добавки буфера A ( Ta6).
  3. Подготовьте 5 мл добавок Buffer A plus ( таблица 6 ) на культуру. Храните буфер A при RT во время процедуры.
  4. Подготовьте микроцентрифужные пробирки, содержащие 90 мкл стоп-раствора ( таблица 7 ) и 10 мкл 10% SDS для каждого момента времени, который должен быть собран. Для каждого нового анализируемого фактора берут образцы через 0 с, 30 с, 1 мин, 2,5 мин, 5 мин и 10 мин.
  5. Декантируют культуру в 50 мл коническую трубку и центрифугируют при 1500 мкг и комнатной температуре (RT) в течение 1 мин.
  6. Тщательно ресуспендируйте клетки в 1 мл буфера А и перенесите ресуспендированные клетки в микроцентрифужную пробирку. Гранулы ресуспендировали клетки в микроцентрифуге при 1500 мкг и RT в течение 30 с.
  7. Супернатант аспирации и тщательно ресуспендировать клетки в 1 мл буфера А путем пипетирования вверх и вниз. Гранулы ресуспендировали клетки в микроцентрифуге при 1500 мкг и RT в течение 30 с. Повторите этот шаг один раз.
  8. Тщательно ресуспендировать клетки в 570 мкл буфера А. Добавить 30 мкл 2% дигитонина(Конечная концентрация 0,1%) для облегчения проницаемости клеток и инвертирования для смешивания.
  9. Пермеабилизируйте клетки в тепловом блоке или водяной бане при 30 ° С в течение 5 мин.
  10. Пипетируйте реакцию вверх и вниз, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток. Удалите 100 мкл аликвоты пермеабилизированных клеток в качестве отрицательного контроля в микроцентрифужную пробирку, содержащую стоп-раствор и SDS (шаг 2.4), и вихрь коротко для смешивания.
  11. Добавьте 1,1 мкл 1 М CaCl 2 (2 мМ конечной концентрации) в пермеабилизированные клетки для активации MNase и инвертируйте несколько раз быстро или вихрь коротко для смешивания. Немедленно возвратите смешанную реакцию при 30 ° C и запустите таймер.
  12. В каждый момент времени, который нужно собрать, пипетируйте реакцию вверх и вниз, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток, затем удалите 100 мкл аликвоты пермеабилизированных клеток в микроцентрифужную пробирку, содержащую стоп-раствор, и SDS и вихрь, чтобы перемешать. Для каждого нового анализируемого фактора возьмите 0 с (без добавления CaCl 2 ), 30 с, 1 мин, 2,5 мин, 5 мин и 10 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ. ЧИК-эксперименты с факторами, которые быстро расщепляют ДНК при 30 ° С, могут быть выполнены при более низких температурах, чтобы замедлить кинетику расщепления MNase.
  13. После того как все точки времени были собраны, добавьте 4 мкл 20 мг / мл протеиназы К в каждый образец, вихрь кратковременно перемешивают и инкубируют при 55 ° С в течение 30 мин.
  14. Добавьте к каждому образцу 200 мкл 25: 24: 1 фенола: хлороформ: изоамиловый спирт, энергично перемешивают, центрифугируют с максимальной скоростью и RT в микроцентрифуге в течение 5 мин.
  15. Удалите каждую водную фазу (~ 150 мкл) в новую пробирку. Добавьте 30 мкг гликогена и 500 мкл 100% этанола. Вихрь энергично перемешивают и осаждают на сухом льду в течение 10 мин или до тех пор, пока раствор не станет вязким.
  16. Гранулы осаждали ДНК с максимальной скоростью и 4 ° С в микроцентрифуге в течение 10 мин.
  17. Декантирующие супернатанты и промывные гранулы с 1 мл 70% этанола RT.
  18. Декантированный этанол, удаляющий остаток путем инвертированияD аккуратно постукивая трубками на бумажном полотенце. Кратко открутите образцы с помощью настольной центрифуги и используйте пипетку для удаления остаточного этанола, следя за тем, чтобы не повредить таблетку. Воздушно-сухие гранулы для РТ в течение 5 мин.
  19. В то время как гранулы сушат, сделайте основную смесь для ресуспендирования высушенных гранул в 29 мкл Трис, pH 8,0 + 1 мкл 10 мг / мл РНКазы А каждый. Дайджест РНК при 37 ° С в течение 20 мин.
  20. Смешайте 1 мкл 6X загружающего ДНК красителя с 5 мкл каждого образца и бегите на 1,5% агарозном геле при 120 В в течение 40 мин.

3. Выбор размера

ПРИМЕЧАНИЕ. Цель выбора размера заключается в удалении фрагментов из нескольких килобаз геномной ДНК из образца, подлежащего секвенированию, и обогащения фрагментов ~ 150 б.п. (примерно размер нуклеосомной ДНК) или меньше. В данных секвенирования фрагменты <400 б.п. обогащены, с заметным пиком вокруг размера нуклеосомной ДНК (~ 150 п.о.) и пиковым или широким распределением субнуклеосомных фрагментов.

<ол>
  • Для каждого образца добавьте 75 мкл твердофазных гранул с обратимой иммобилизацией (SPRI) в растворе 23 полиэтиленгликоля (ПЭГ) и пипеткой вверх и вниз 10 раз для смешивания. Инкубируйте гранулу: смесь ДНК при комнатной температуре в течение 5 мин.
  • Во время инкубации шариков SPRI готовят микрофьюзовые пробирки, содержащие 96 мкл 10 мМ Трис, рН 8,0 и 4 мкл 5 М NaCl для каждого образца.
  • Поместите трубки в магнитную стойку, чтобы собрать бусины со стороны трубки. Позвольте бусинам собирать на стороне трубки в течение 2 мин.
  • Перенесите каждый супернатант в новую пробирку, содержащую трис и NaCl (шаг 3.2).
  • Добавьте к каждому образцу 200 мкл 25: 24: 1 фенол: хлороформ: изоамиловый спирт, вихрь для смешивания и центрифугу с максимальной скоростью и RT в микроцентрифуге в течение 5 мин.
  • Удалите каждую водную фазу в новую пробирку. Добавьте 30 мкг гликогена и 500 мкл 100% этанола. Осаждайте ДНК на сухом льду в течение 10 мин или до тех пор, пока раствор не станет вязким.
  • ПеллетыНасыщенной ДНК с максимальной скоростью и 4 ° С в микроцентрифуге в течение 10 мин.
  • Декантируют супернатанты и промывают гранулы 1 мл 70% этанола.
  • Декантируйте этанол, удалив остаток, инвертируя и осторожно постукивая по трубам на бумажном полотенце. Кратко открутите образцы с помощью настольной центрифуги и используйте пипетку для удаления остаточного этанола, следя за тем, чтобы не повредить таблетку. Воздушно-сухие гранулы для РТ в течение 5 мин.
  • Ресуспендируют высушенные гранулы в 25 мкл Трис, pH 8,0. Определите концентрацию образца, используя высокочувствительный анализ. Для экспериментов TF ChEC ДНК 10-100 нг регулярно восстанавливается после выбора размера.
  • Подготовьте библиотеки секвенирования. Желательно, чтобы протоколы подготовки библиотек, которые не зависят от выбора размера, как описано ранее 24 , позволяют упорядочивать большой диапазон размеров фрагментов (25-500 пар оснований).
  • Библиотеки последовательностей в режиме сопряжения. Для качественного чтения требуется минимум 25 оснований последовательности на каждом концеотображение. От 1 до 2 миллионов чтений обеспечивает достаточный охват образца ЧЭО.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Анализ данных ChEC-seq является сложной процедурой и выходит за рамки данной статьи. Подробную информацию о анализе данных можно найти в предыдущих публикациях 1 , 21 , а пользовательские сценарии, используемые для анализа, доступны в GitHub (https://github.com/zentnerlab/chec-seq). HOMER 25 (http://homer.salk.edu) также может использоваться для анализа данных ChEC-seq в командной строке.

    • Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Результаты

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    В случае успешного эксперимента ChEC анализ ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле выявит зависимое от кальция увеличение фрагментации ДНК в течение времени, о чем свидетельствует размывание и возможное полное переваривание геномной ДНК. В некоторых случаях после длительного переваривания наблюдается лестница полос, сходная с таковой, наблюдаемая при традиционном расщеплении MNase. Это относится к анализу ChEC для Reb1, общего регуляторного фактора, который связывает нуклеосомно-об...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Обсуждение

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Мы показали, что ChEC может отображать различные типы дрожжевых белков на хроматине и предвидеть, что он будет широко применяться к различным семействам TF и ​​другим хроматин-связывающим факторам у дрожжей. ChEC-seq выгоден тем, что он не требует сшивки, солюбилизации хроматина или антител. Таким образом, ChEC избегает артефактов, потенциально присутствующих в X-ChIP-seq, таких как гипер-ChIPable артефакт 3 , 4 и собственный ChIP, таких как ложные негативы из-з...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Раскрытие информации

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Авторам нечего раскрывать.

    Благодарности

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Мы благодарим Мустафу Салеха и Джей Туиньи за критическое чтение рукописи и Стивена Хана и Стивена Хеникова за наставничество и поддержку во время разработки ChEC-seq и его применения к медиаторскому комплексу. SG поддерживается грантами NIH R01GM053451 и R01GM075114, а GEZ поддерживается фондами запуска Университета штата Индиана.

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Материалы

    Список материалов, использованных в этой статье
    ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
    dNTPsNEBN0447
    Q5 высокоточная ДНК-полимеразаNEBM0491LДругие высокоточные ДНК-полимеразы, такие как Phusion, могут быть использованы для кассетной амплификации.
    TrackIt 1 Kb Plus DNA ladderThermoFisher Scientific10488085
    Taq DNA полимеразаNEBM0273L
    cOmplete Mini EDTA-free protage inhibitor cocktailSigma-Aldrich11836170001Важно, чтобы использовалась смесь ингибиторов протеазы без ЭДТА, чтобы не ингибировать расщепление MNазы путем хелатирования Ca2+.
    PMSFACROS OrganicsAC215740010
    дигитонином, высокочистымEMD Millipore300410-250MGСделайте 2% бульон, растворив 20 мг дититонина в 1 мл ДМСО с энергичным вортексом.
    Протеиназа К, 20 мг/млИнвитроген25530049
    РНКаза А, 10 мг/млThermoFisher ScientificEN0531
    Бусины Ampure XPBeckman CoulterA63880Ампуроподобные бусины могут быть получены с использованием опубликованного протокола (ссылка 24).
    Магнитная стойка MagneSpherePromegaZ5342

    Ссылки

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo. Nat Commun. 6, 8733(2015).
    2. Chen, J., et al. Single-Molecule Dynamics of Enhanceosome Assembly in Embryonic Stem Cells. Cell. 156 (6), 1274-1285 (2014).
    3. Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (46), 18602-18607 (2013).
    4. Park, D., Lee, Y., Bhupindersingh, G., Iyer, V. R. Widespread Misinterpretable ChIP-seq Bias in Yeast. PLoS ONE. 8 (12), 83506(2013).
    5. Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. Active promoters give rise to false positive 'Phantom Peaks' in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. , (2015).
    6. Krebs, W., et al. Optimization of transcription factor binding map accuracy utilizing knockout-mouse models. Nucleic Acids Res. 42 (21), 13051-13060 (2014).
    7. Paul, E., Zhu, Z. I., Landsman, D., Morse, R. H. Genome-Wide Association of Mediator and RNA Polymerase II in Wild-Type and Mediator Mutant Yeast. Mol Cell Biol. 35 (1), 331-342 (2015).
    8. Worsley Hunt, R., Wasserman, W. W. Non-targeted transcription factors motifs are a systemic component of ChIP-seq datasets. Genome Biol. 15 (7), 412(2014).
    9. Vega, V. B., Cheung, E., Palanisamy, N., Sung, W. -K. Inherent Signals in Sequencing-Based Chromatin-ImmunoPrecipitation Control Libraries. PLoS ONE. 4 (4), 5241(2009).
    10. Teytelman, L., et al. Impact of Chromatin Structures on DNA Processing for Genomic Analyses. PLoS ONE. 4 (8), 6700(2009).
    11. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive Genome-wide Protein-DNA Interactions Detected at Single-Nucleotide Resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
    12. He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nat Biotech. 33 (4), 395-401 (2015).
    13. Kasinathan, S., Orsi, G. A., Zentner, G. E., Ahmad, K., Henikoff, S. High-resolution mapping of transcription factor binding sites on native chromatin. Nat Methods. 11 (2), 203-209 (2014).
    14. Skene, P. J., Hernandez, A. E., Groudine, M., Henikoff, S. The nucleosomal barrier to promoter escape by RNA polymerase II is overcome by the chromatin remodeler Chd1. eLife. 3, 02042(2014).
    15. Aughey, G. N., Southall, T. D. Dam it's good! DamID profiling of protein-DNA interactions. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 5 (1), 25-37 (2016).
    16. Wang, H., Mayhew, D., Chen, X., Johnston, M., Mitra, R. D. Calling Cards enable multiplexed identification of the genomic targets of DNA-binding proteins. Genome Res. 21 (5), 748-755 (2011).
    17. Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. ChIC and ChEC: Genomic Mapping of Chromatin Proteins. Mol Cell. 16 (1), 147-157 (2004).
    18. Merz, K., et al. Actively transcribed rRNA genes in S. cerevisiae are organized in a specialized chromatin associated with the high-mobility group protein Hmo1 and are largely devoid of histone molecules. Genes Dev. 22 (9), 1190-1204 (2008).
    19. Schmid, M., et al. Nup-PI: The Nucleopore-Promoter Interaction of Genes in Yeast. Mol Cell. 21 (3), 379-391 (2006).
    20. Dunn, T., Gable, K., Beeler, T. Regulation of cellular Ca2+ by yeast vacuoles. J Biol Chem. 269 (10), 7273-7278 (1994).
    21. Grünberg, S., Henikoff, S., Hahn, S., Zentner, G. E. Mediator binding to UASs is broadly uncoupled from transcription and cooperative with TFIID recruitment to promoters. The EMBO Journal. 35 (22), 2435-2446 (2016).
    22. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
    23. Rohland, N., Reich, D. Cost-effective, high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Res. 22 (5), 939-946 (2012).
    24. Orsi, G. A., Kasinathan, S., Zentner, G. E., Henikoff, S., Ahmad, K. Mapping regulatory factors by immunoprecipitation from native chromatin. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. 110, 21-25 (2015).
    25. Heinz, S., et al. Simple Combinations of Lineage-Determining Transcription Factors Prime cis-Regulatory Elements Required for Macrophage and B Cell Identities. Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
    26. Kungulovski, G., et al. Application of histone modification-specific interaction domains as an alternative to antibodies. Genome Res. 24 (11), 1842-1853 (2014).
    27. Vogel, M. J., Peric-Hupkes, D., van Steensel, B. Detection of in vivo protein-DNA interactions using DamID in mammalian cells. Nat. Protocols. 2 (6), 1467-1478 (2007).
    28. Feeser, E. A., Wolberger, C. Structural and Functional Studies of the Rap1 C-Terminus Reveal Novel Separation-of-Function Mutants. J Mol Biol. 380 (3), 520-531 (2008).
    29. Neph, S., et al. An expansive human regulatory lexicon encoded in transcription factor footprints. Nature. 489 (7414), 83-90 (2012).
    30. Mountjoy, K. G., Kong, P. L., Taylor, J. A., Willard, D. H., Wilkison, W. O. Melanocortin receptor-mediated mobilization of intracellular free calcium in HEK293 cells. Physiol Genomics. 5 (1), 11-19 (2001).
    31. Seurin, D., Lombet, A., Babajko, S., Godeau, F., Ricort, J. -M. Insulin-Like Growth Factor Binding Proteins Increase Intracellular Calcium Levels in Two Different Cell Lines. PLoS ONE. 8 (3), e59323(2013).
    32. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging Calcium in Neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
    33. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotech. 32 (4), 347-355 (2014).
    34. Filion, G. J., et al. Systematic Protein Location Mapping Reveals Five Principal Chromatin Types in Drosophila Cells. Cell. 143 (2), 212-224 (2010).
    35. van Bemmel, J. G., et al. A Network Model of the Molecular Organization of Chromatin in Drosophila. Mol Cell. 49 (4), 759-771 (2013).
    36. Izzo, A., et al. The Genomic Landscape of the Somatic Linker Histone Subtypes H1.1 to H1.5 in Human Cells. Cell Rep. 3 (6), 2142-2154 (2013).

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Перепечатки и разрешения

    Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

    Запросить разрешение

    Теги

    SPRI

    Похожие статьи