В этом протоколе описывается внедрение системы оптической микроскопии с временным растяжением асимметричного детектирования для одноэлементной визуализации в сверхбыстрой микрожидкостной среде и ее применениях в цитометрии изображений.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Микрофлюидная имитационная проточная цитометрия с помощью асимметричного детектирования оптической микроскопии с временным растяжением (ATOM)
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Масштабирование числа измеряемых параметров, что позволяет проводить многомерный анализ данных и, таким образом, статистические результаты с более высокой достоверностью, является основной тенденцией в развитии технологии проточной цитометрии. Примечательно, что добавление изображений высокой четкости позволяет комплексный морфологический анализ сотовых / субклеточных структур. Это невозможно для стандартных проточных цитометров. Тем не менее, это полезно для продвижения наших знаний о клеточных функциях и может принести пользу исследованиям в области естественных наук, клинической диагностике и мониторингу окружающей среды. Включение возможностей визуализации в проточную цитометрию ставит под угрозу пропускную способность анализа, в первую очередь из-за ограничений скорости и чувствительности в технологиях камеры. Было показано, что для преодоления этой проблемы скорости или пропускной способности, связанной с цитометрией потока изображений, при сохранении качества изображения, была продемонстрирована асимметричная оптическая микроскопия с временным растяжением (АТОМ), позволяющая высококонтрастный однокамерный образС разрешением до соты, при пропускной способности изображения до 100 000 ячеек / с. Основываясь на концепции визуализации обычного времени-растяжения, которая опирается на все-оптическое кодирование и извлечение изображений с использованием ультрабыстрого широкополосного лазерного импульса, ATOM еще больше повышает производительность изображения за счет усиления контрастности изображения немаркированных / неокрашенных ячеек. Это достигается путем доступа к информации фазового градиента ячеек, которая спектрально кодируется в одноканальные широкополосные импульсы. Следовательно, ATOM особенно выгодна при высокопроизводительных измерениях одноклеточной морфологии и текстуры - информации, указывающей типы клеток, состояния и четные функции. В конечном счете, это может стать мощной платформой для картирования проточной цитометрии для биофизического фенотипирования клеток, дополняющего текущий современный клеточный анализ на основе биохимических маркеров. В этой работе описывается протокол для установления ключевых модулей системы ATOM (от оптического интерфейса до данных pОбработка и визуализация), а также рабочий процесс цитометрии изображений на основе ATOM с использованием в качестве примеров человеческих клеток и микроводорослей.
Введение
Оптическая визуализация представляет собой мощный инструмент и анализ на основе клеток для (почти) неинвазивной визуализации подробного пространственного распределения многих клеточных / субклеточных компонентов, тем самым раскрывая множество морфологических, биофизических и биомолекулярных сигнатур клеток. Однако эта способность извлекать информацию с высоким содержанием из отдельных ячеек, как правило, была скомпрометирована, когда нужно было исследовать огромную и гетерогенную популяцию клеток. Это указывает на общий компромисс в анализах на основе клеток между пропускной способностью измерения и контентом. Примечательным примером является то, что добавление возмо....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка образца
- Подготовка образца (адгезивные клетки, клетки MCF-7)
- Выньте блюдо для культивирования клеток из инкубатора и слейте культуральную среду.
- Промойте клетки на блюде 1х фосфатно-буферным солевым раствором (PBS) для удаления избыточной культуральной среды.
- Добавьте 3 мл раствора 0,25% трипсина в культуральную чашку (диаметр 100 мм) и поместите в инкубатор на 37 ° С, 5% СО 2 в течение 4 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ. Трипсин растворяет клеточный белок клеток, чтобы они отделились от культуральной тарелки. - Проверьте, все ли клетки отделились от блюд культуры, используя световой микр....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В этой работе показаны две одноячеистые демонстрации изображений ATOM: одна с клетками млекопитающих (мононуклеарная клетка периферической крови человека (PBMC) и клетки рака молочной железы (MCF-7)), а другая с фитопланктоном s (Scenedesmus и Chlamydomonas). Первый эксперимент был вызван растущим интересом к жидкой биопсии для обнаружения, подсчета и характеристики циркулирующих опухолевых клеток (КТК) в крови 23 . Способность измерять КТК,.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Существует несколько технических деталей, требующих особого внимания при настройке системы ATOM. Во-первых, важно отметить, что асимметричное / наклонное спектрально-кодированное освещение может вводить остаточные компоненты фазового градиента ( т. Е. Эффект затенения) в контраст поглощения и влиять на усиление контраста фазового градиента в АТОМ. Поэтому этот эффект наклонного освещения должен быть сведен к минимуму. Во-вторых, следует подчеркнуть, что схема временного мультиплексирования или временного чередо.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы благодарим г-на П. Юнга за подготовку MCF-7 для нас. Эта работа была частично поддержана грантами Совета по научным грантам Гонконгского особого административного района, Китай (проект № 17259316, 17207715, 17207714, 17205215 и HKU 720112E), Программа поддержки инноваций и технологий (ITS / 090/14 ), И Фонд развития университета HKU.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Объектив Nikon Plan Fluorite Physiology 40X | Nikon | MRF07420 | (Obj2) |
| Объектив Olympus Plan Fluorite, 0,75 NA, 0,51 мм WD, 40X | Olympus | RMS40X-PF | Объектив (Obj1) |
| N-BK7 Плоско-выпуклые объективы | Thorlabs | LA1145-C | Для ретрансляции спектрального душа |
| FC/APC Оптоволоконный коллимационный пакет | Thorlabs | F220APC-1064 | Для вывода и сбора лазерных импульсов |
| Пелликл светоделитель | Thorlabs | BP145B3 | Для изготовления реплики |
| луча Защищенное серебряное зеркало | Thorlabs | PF10-03-P01 | Для отражения света |
| 800-1650 нм 12 ГГц одномодовый DC-связанный NIR фотоприемник | Newport | 1544-B | Для преобразования света в электрический сигнал |
| Infiniium Высокопроизводительный осциллограф | Agilent | DSOX91604A | Для сохранения преобразованных светом электрических сигналов |
| HI1060 Оптическое волокно | Corning | HI1060 | Оптическое волокно для растягивания по времени |
| УСИЛИТЕЛЬ ВОЛОКНА, ЛЕГИРОВАННОГО ИТТЕРБИЕМ, | KEOPSYS | KPS-STD-BT-YFA-37-BO-SM-111-FA-FA | Оптический линейный усилитель |
| Голографическая решетка | Wasatch Photonics | 020305-6 | Шприц |
| введения/забора решетки Насосы | Harvard Apparatus | PHD 2000 | Шприцевой насос для загрузки проб в микрофлюидные каналы |
Ссылки
- Lau, A. K. S., Wong, T. T. W., Shum, H. C., Wong, K. K. Y., Tsia, K. K. Imaging Flow Cytometry: Methods and Protocols. Barteneva, N. S., Vorobjev, I. A. , Springer New York. New York, NY. 23-45 (2016).
- Goda, K., Tsia, K. K., Jalali, B. Serial time-encoded amplified imaging for real-time observation of fast dynamic ph....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
