Методическая статья

Роман клинических класс изоляции метод человеческая почка периваскулярной стромальные клетки

8.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55841

⸱

7 августа 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, Leiden University Medical Centre

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем Роман клинических класс изоляции и культуры метод для почек периваскулярной стромальные клетки (kPSCs), основанный на весь орган перфузии с пищеварительные ферменты и обогащения NG2-клеток. С помощью этого метода можно получить достаточного числа клеток для клеточной терапии.

Аннотация

Мезенхимальные стромальные клетки (Майкрософт) (MSCs) являются ткани гомеостатических иммунной и модулирующее клетки, которые показали благотворное воздействие при заболеваниях почек и пересадки. Периваскулярной стромальные клетки (Чок) имеют характеристики с костного MSCs (bmMSCs). Однако они также обладают, скорее из-за местных импринтинг, ткани специфические свойства и играть определенную роль в местных тканей гомеостаза. Эта специфика ткани может привести к конкретным репарации тканей, также в нарушениях функции почек. Ранее мы показали, что человеческая почка Чок (kPSCs) расширили почек эпителиальных заживления в то время как bmMSCs не имеет этот потенциал. Кроме того kPSCs может улучшить почек травмы в естественных условиях. Таким образом kPSCs представляют собой интересный источник для клеточной терапии, особенно для болезней почек и пересадки почки. Здесь мы покажем подробный метод изоляции и культуры в kPSCs от пересадки класса человека почки, основанные на целом орган перфузии пищеварительных ферментов через почечной артерии и обогащения для маркера периваскулярной NG2. Таким образом можно получить крупноклеточный количеств, которые подходят для клеточной терапии.

Введение

Мезенхимальных стромальных клеток (МСК), модулирующее клетки иммунной системы, которые были первоначально выделены из костного мозга. Они характеризуются их шпинделя форме морфологии, способности дифференцироваться в жир, кости и хряща и пластиковые присоединения. MSCs Экспресс стромальные маркеры CD73, CD90, CD105 во время негативные для маркеров CD31 и CD451,2,3. MSCs являются перспективным кандидатом на клеточной терапии из-за их ткани гомеостаза и иммуномодулирующим потенциала. bmMSCs в настоящее время изучаются в клинических испытаниях для ряда заболеваний, включая заболевания почек и пересадки почки как обзор других4.

Ранее было показано, что периваскулярной клетки от нескольких различных твердых органов, включая жировой ткани, плаценты и скелетных мышц разделяют характеристик с MSCs9. Однако эти клетки также демонстрируют Ткани специальные функции, которые могут привести к organotypic ремонт10. Клетки человека миокарда периваскулярной, например, стимулировали ангиогенных ответы после гипоксии и дифференцированной в кардиомиоцитов, в то время как периваскулярной клетки изолированы от других тканей не показывать эти потенциалы11.

Периваскулярной стромальные клетки также могут быть изолированы от мыши12,13,14 и нарушениями функции почек15,16. Мы широко характеризуется kPSCs и сравнить их в bmMSCs. Мы обнаружили, что kPSCs, похож на bmMSCs, иммунодепрессивные потенциал и может поддерживать формирование сосудистого сплетения. Однако есть ткани конкретные различия между типами клеток, как показали organotypic transcriptional выражение подписи, включая нефрогенной транскрипционных факторов, HoxD10 и HoxD11 kPSCs. kPSCs, в отличие от bmMSCs, не проходят Миофибробласт трансформации после стимуляции с TGF-β и были способны дифференцироваться в адипоцитов. Кроме того kPSCs ускоренного эпителиальных целостности в почки трубчатых эпителиальных рану скретч assay, явление, которое не наблюдалось с bmMSCs. Это расширение рану ремонт был опосредуется через релиз фактора роста гепатоцитов. Кроме того kPSCs смягчены травмы почек в мышиной модели острой почечной травмы15. Поэтому kPSCs кажется, Улучшенный почечной ремонт потенциала и интересный новый источник для клеточной терапии при заболеваниях почек.

Для того, чтобы иметь возможность использовать kPSCs для целей терапии клеток, kPSCs должен быть изолирован на основе клинических класс с клинической класс ферментов и протоколы. Кроме того чтобы иметь возможность лечить несколько пациентов с kPSCs от 1 донора, должно быть получено достаточное число клеток. Здесь мы покажем в деталях, клинические класса изоляции процедура kPSCs от всего трансплантации почки класс, давая достаточное количество клеток для клинического клеточной терапии.

Протокол

Местный медицинский этический комитет и этический консультативный совет Европейского консорциума (STELLAR) одобрили исследование и сбор человеческих почек трансплантатного качества, отброшенных в основном по хирургическим причинам. Согласие на исследование было дано для всех почек.

1. Подготовка к культивированию клеток

  1. Приготовьте бассейн с лизатами тромбоцитов.
    1. Храните тромбоциты с истекшим сроком годности менее 2 дней при температуре -80 °C до использования (максимум 1 год).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тромбоциты первоначально были получены от коммерческого поставщика. Были получены излишки больничного материала, распределенные местным банком крови.
    2. Разморозьте тромбоциты не менее 5 доноров (предпочтительно 10) O/N при 4 °C.
    3. Соберите тромбоциты в большой стерильной бутылке, переложите в конические центрифужные пробирки и отверждайте в течение 10 минут при температуре 1 960 x g при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем тромбоцитов зависит от количества доноров и количества больничного излишка материала на одного донора.
    4. Пипеткой нанесите надосадочную жидкость в пакеты с кровью (50 мл/пакет) через цилиндр шприца объемом 50 мл. Хранить при температуре -80 °C.
  2. Приготовление клеточной питательной среды.
    1. Разморозьте один пакетик лизатов тромбоцитов на водяной бане при 37 °C.
    2. Добавьте в пакетик 1 л (т.е. 2 флакона) Minimum Essential Medium - альфа-модификации (alphaMEM), 5 мл 200 мМ глутамина и 20 мл пенициллина (5 000 ЕД/мл)/стрептомицина (5 000 мкг/мл) (ручка/стрептококк).
    3. Выдерживать в течение 3 ч при 37 °C.
    4. Встряхните мешок для дегелирования, осторожно постукивая по пакету, когда мешок лежит на ровной поверхности.
    5. Фильтруйте 5% среду для лизатов тромбоцитов, протягивая лизаты через фильтр системы переливания крови с помощью стерильного шприца объемом 50 мл.
    6. Разложите среду по 50 мл и храните при температуре -80 °C до использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая новая партия лизатов тромбоцитов тестируется в клеточной культуре и сравнивается с предыдущей партией путем выращивания представляющих интерес клеток (bmMSCs или kPSCs) до слияния в обеих партиях. По количеству клеток и жизнеспособности кПСК или бммц, выращенные в новой партии, не должны отличаться более чем на 10%, а маркерная экспрессия CD73, CD90, CD105 и CD31, CD34 и CD45 при анализе методом проточной цитометрии не должна отличаться. Методы культивирования клеток описаны в разделе 6 протокола (Культивирование кПСК).

2. Подготовка к сбору клеток

  1. Приготовление растворов.
    1. Приготовьте обычную среду, добавив 10 мл шприц-ручки/стрептококка к 500 мл (1 флакон) Dulbecco's Minimum Essential Medium (DMEM)-F12.
    2. Приготовьте средство для умывания, добавив 50 мл обычной человеческой сыворотки (NHS) и 10 мл ручки/стрептококка в 1 флакон DMEM-F12.
    3. Приготовьте ферментный буфер, добавив 2,9 мл 1 М 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинетансульфоновой кислоты (HEPES), 1,2 мл NaHCO3 2,5% [w/v] и 160 мкл CaCl2 (1 M) в 160 мл раствора Висконсинского университета.
    4. Приготовьте раствор коллагеназы, медленно добавив 20 мл буфера фермента в флакон коллагеназы GMP-класса, содержащей >2000 ЕД/бутылку коллагеназы. Растворить при температуре 4 °C примерно на 40 минут. Осторожно встряхните несколько раз в течение периода растворения.
    5. Приготовьте сублимированную среду, добавив 5 мл диметилсульфоксида (ДМСО) в 45 мл NHS.
  2. Приготовление перфузионного лотка (рисунок 1А).
    1. Очистите проточную кабину и накройте хирургическими простынями. Нагрейте водяную баню примерно до 40 - 45 °C, чтобы нагреть перфузионный поддон до 37 °C. Наденьте хирургические халаты и хирургические перчатки.
    2. Подсоедините стерилизованный перфузионный поддон к водяной бане, чтобы предварительно нагреть перфузионный поддон теплой водой. Убедитесь, что в перфузионном лотке нет воздуха, начав с перфузионного лотка в вертикальном положении. При необходимости добавьте на водяную баню еще воды, чтобы предотвратить вливание воздуха в перфузионный поддон.
    3. Поместите трубку LS25 в насос. Оставьте оба стерильных конца трубки в проточном шкафу. Поместите щипцы Кохера на один конец трубки и дайте им отдохнуть на дне перфузионного лотка. Положите стерильную марлю поверх трубки, чтобы предотвратить непроходимость. Прикрепите соединитель Люэра на другой конец трубки.
    4. Добавьте примерно 100 мл обычной среды в перфузионный лоток и начните промывать трубку со скоростью насоса 100 мл/мин.

3. Выделение клеток почек

  1. Подготовка почки.
    1. Извлеките почку из двойных стерильных пакетов и поместите на стерильный лоток для перфузии (рисунок 1B). Удалите околопочечную жировую ткань и капсулу почки с помощью ножниц и осторожного разрыва (Рисунок 1C) и определите почечную артерию на аортальном пластыре, как показано на рисунке Рисунок 1D.
    2. Канюлялизируйте почечную артерию с помощью добавочного шипа, зафиксируйте стерилизованной стяжкой и прикрепите к концу трубки насоса с помощью разъема Люэра, пока насос включен. Если трубки не полностью заполнены, сначала добавьте больше среды в лоток и промывочные трубки, запустив насос (Рисунок 1E - F). Промойте почку простой средой с помощью насоса с расходом 100 мл/мин.
  2. Лечение коллагеназой и выделение клеток почек.
    1. Добавьте коллагеназу (20 мл, >2 000 ЕД) и ДНКазу (2,5 мл, 1 мг/мл) в перфузионный лоток (рис. 1 G). Время от времени аккуратно поворачивайте почку рукой. Подождите, пока почка станет мягкой, а перфузионная жидкость станет менее прозрачной (примерно 30 - 40 минут).
    2. Аккуратно помассируйте почку (Рисунок 1H) до получения клеточной суспензии (Рисунок 1I). Удалите непереваренный материал и спайк в почечной артерии.
  3. Промывание и забор клеток почек.
    1. Добавьте 50 мл NHS в клеточную суспензию. Слейте клеточную суспензию из перфузионного лотка, поставив насос на низкий расход и поместив трубку, сначала соединенную с почкой, над трубками объемом 50 мл (рис. 1 J).
    2. Центрифугируйте при 300 х г в течение 7 мин при 4 °C и удалите надосадочную жидкость. Промойте гранулы моющим средством, содержащим 10% NHS, и снова центрифугируйте при 300 x g в течение 7 минут. Повторите стирку еще раз. Измерьте объем клеточных гранул и добавьте такой же объем клеточной питательной среды.
    3. Либо криоконсервировать клетки отсюда, добавив замораживающую среду 1:1 к клеточной суспензии, и хранить в криогенных флаконах в соответствии со стандартными протоколами, либо продолжить культивирование клеток (раздел 4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточная суспензия содержит клеточные сгустки и требует дополнительных действий для получения отдельных клеток, что приводит к увеличению гибели клеток. Поэтому клетки содержатся в подвешенном состоянии и на данном этапе не подсчитываются.

4. Клеточная культура сырых клеток почек

  1. Добавьте примерно 1 мл клеточной суспензии к 24 мл 5% лизатов тромбоцитов alphaMEM (среда для культивирования клеток) в колбу для культуры клеток T175 (Рисунок 1K) и культивируйте при 37 °C, 5%CO2. Через 2 дня удалите среду и клеточные остатки из адгезивных клеток и обновите среду 25 мл среды для культивирования клеток.
  2. Обновляйте питательную среду два раза в неделю, удаляя половину среды (12,5 мл) и добавляя свежую среду (12,5 мл) с помощью асептических методов.
  3. Культура до слияния (обычно 5 - 7 дней) (рисунок 1л). Удалите среду, дважды промойте PBS и трипсинизируйте клетки, добавив по 5 мл трипсина в каждую колбу T175 в течение 5 минут при 37 °C. Промойте в питательной среде и центрифугируйте при 490 x g в течение 5 минут и удалите надосадочную жидкость.

5. Обогащение клеток для NG2 путем магнитного разделения клеток (Рисунок 1M)

  1. Подготовьте буфер для разделения ячеек в соответствии с протоколом производителя.
  2. Ресуспендируйте трипсинизированные кПСК в буфере для разделения клеток объемом 10 мл. Центрифугируйте при 490 x g в течение 5 минут, выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в буфере для разделения клеток объемом 300 мкл.
  3. Добавьте 100 мкл блокирующего reagen/5 x 107 клеток, добавьте 100 мкл гранул антимеланомы (NG2) на 5 x 107 клеток и инкубируйте в течение 30 мин при 4 °C. Отделите NG2-положительную фракцию в соответствии с протоколом производителя. Добавьте 10 мл среды и центрифужных ячеек на 5 минут при 490 x g.
  4. Подсчитайте ячейки с помощью счетной камеры Bürker в соответствии с протоколом производителя. Засейте клетки в колбу для культур (примерно 4 x 103 клетки/см2) и инкубируйте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Засейте клетки в следующих концентрациях: <250 000 в колбе T25, 250 000 - 500 000 в колбе T75 и 700 000 - 800 000 в колбе T175. После обогащения магнитными элементами выделяется положительная фракция примерно 1 - 2%. Однако, поскольку этот шаг является обогащением клеток, а не сортировкой клеток, в культуре будут присутствовать другие типы клеток (Рисунок 1N). После нескольких проходов (обычно около 4 - 5) присутствует только однородная популяция kPSC (Рисунок 1P).

6. Культура kPSC

  1. Обновляйте среду два раза в неделю, удаляя половину среды, и заменяйте ее свежеразмороженной питательной средой (Рисунок 1N).
    ПРИМЕЧАНИЕ: КПСК имеют тенденцию быть более жизнеспособными и пролиферативными, когда обновляется только половина среды.
  2. Пассаж kPSCs.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проходите kPSCs либо при 90 - 100% конфлюенции, либо при появлении 3D-структур (см. Рисунок 1O), либо при отсутствии роста клеток более недели. Последние два особенно могут возникать на ранних пассажах после обогащения клеток. В этом случае, после пассирования, клетки обычно снова начинают расти в монослойной культуре (Рисунок 1P).
    1. Удалите среду из 90 - 100% слитых клеток (оставьте среду для последующего использования). Дважды промойте колбу PBS (1 мл в T25, 5 мл в T75, 10 мл в T175). Добавьте трипсин (0,5 мл в Т25, 2 мл в Т75, 5 мл в Т175) и инкубируйте в течение 5 мин при 37 °C. Добавьте старую среду в колбу и осторожно восстановите суспендию.
    2. Переложите в пробирку объемом 15 или 50 мл (в зависимости от объема) и центрифугируйте при 490 x g в течение 5 мин. Подсчитайте жизнеспособные клетки и планшет <250 000 в T25, 250 000 - 500 000 в T75 или 700 000 - 800 000 в T175 (примерно 4 x 103 ячейки/см2).
  3. Испытайте kPSC в проходе 5 или 6 (например, анализ на царапины, раздел 7).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Охарактеризуйте размножаемые клетки с помощью проточной цитометрии с использованием стандартных протоколов. Маркерная экспрессия NG2, PDGFR-β, CD146, CD73, CD90, CD105, HLA-ABC должна быть положительной, а CD31, CD34, CD45 и HLA-DR должна быть отрицательной. Тест на микоплазму, бактерии и грибы в питательной среде согласно стандартным протоколам клинической микробиологической лаборатории. Функциональное тестирование кПСК в анализе царапин эпителиальной раны почек. Эксперименты обычно проводят с стерильными, подтвержденными проточной цитометрией гомогенными популяциями кПСК с ранозаживляющей способностью между пассажами 6-8.
  4. Криоконсервировать kPSCs путем добавления 0,5 мл криоконсервирующей среды к 0,5 мл клеточной суспензии (2 млн клеток на мл питательной среды) с использованием стандартных протоколов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После размораживания засейте kPSCs с более высокой плотностью (10-6 клеток в T175).

7. Функциональное испытание кПСК: анализ на царапины эпителиальной раны почки

  1. Культивируют kPSCs в 6-луночном планшете с плотностью 200 000 клеток/лунку в культуральной среде объемом 2 мл. После 48 ч культивирования при 37 °С, 5%СО2, соберите надосадочную жидкость. Это и есть кондиционированная среда.
  2. Засейте HK-2 (проксимальные канальцевые эпителиальные клетки)17 в 2 мл среды проксимальных канальцевых эпителиальных клеток (PTEC), состоящей из соотношения 1:1 DMEM-F12 с добавлением инсулина (5 мг/мл), трансферрина (5 мг/мл), селена (5 нг/мл), гидрокортизона (36 нг/мл), трийодтирина (40 пг/мл), эпидермального фактора роста (10 нг/мл) и пера/стрептококка, в плотности 500 000 клеток на лунку в 6-луночном планшете для культивирования клеток.
  3. Посев в течение 48 ч при 37 °C, 5% CO2. Удалите среду для культивирования клеток HK-2 и создайте царапину на монослое HK-2, сделав царапину кончиком желтой точки пипетки сверху вниз лунки. Промойте HK-2s с PBS и добавьте кондиционированную среду kPSCs или контрольную среду. Отметьте в нижней части таблички область, которую необходимо изобразить.
    ПРИМЕЧАНИЕ: HK-2 должны сливаться. Изображение двух областей на лунку.
  4. Сфотографируйте царапину через 4, 8, 12 и 24 часа в том же отмеченном месте с помощью инвертированного светлопольного микроскопа.
  5. Измерьте площадь царапин на изображении J с помощью инструмента выделения полигона, чтобы определить процент смыкания.

Результаты

Метод изоляции kPSCs клинические класса приводится на рисунке 1. Сырой почечных клеток изолированы от человеческого трансплантации почки класс, коллагеназа перфузии. Результате суспензию клеток культивируемых до притока в 5% тромбоцитов лизатов. А затем периваскулярной стромальные клетки фракции изолированных на основе NG2 выражения.

kPSCs пластиковые адэрентных веретеновидной формы клетки (рисA) и являются положительными стромальные маркеры CD73, CD90, CD105 и периваскулярной маркеров NG2, PDGFR-B и CD146, при отрицательной CD31, CD34, CD45 и HLA-DR (рис. 2B). Как правило однородное население kPSCs можно добраться на проход 4 и kPSCs достигают старение вокруг проход 9-10 (рис. 2C). Поэтому мы рекомендуем выполнять эксперименты между прохождения 5-8.

Для оценки функциональных возможностей изолированных kPSCs, мы выполняем в vitro почек эпителиальных раны скретч assay на каждый новый пакет kPSCs, как мы ранее показал, что обусловлено среднего kPSCs может ускорить эпителиальных заживления ран в этой скретч пробирного15. ССКП кондиционером среднего производится выращивание kPSCs за 48 ч в alphaMEM 5% тромбоцитов лизатов и собирая супернатант. Далее увековечен человеческая почка проксимальных канальцах эпителиальных клеток (HK-2)17 культивируемых до притока и затем производится скретч рану. Затем либо кондиционером среднего kPSCs или управления среды добавляется к скважинам и измеряется скорость заживления ран. При добавлении кондиционером среднего kPSCs, рана закрывает значительно быстрее (Рисунок 2D).

figure-results-1
Рисунок 1 : Клинические изоляции класса метод человеческого kPSCs. Трансплантации почки класса являются канюлированной увлажненную с коллагеназы через почечной артерии (A - G) и промывают результате суспензию клеток и либо криоконсервированных или введены в культуру (H - K). После того, как клетки достигают confluency (L), NG2 обогащение клеток исполнил (M). Клетки trypsinized, когда они либо вырожденная, перестали пролиферирующих или когда 3D структуры появляются (N - P). Критерии выпуска для kPSCs являются стерильности, маркер выражения и возможность повышения трубчатых эпителиальных заживление ран (Q). Стрелка: почечной артерии. Шкалы бар = 200 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2: Характеристика человека kPSCs. ) KPSCs являются веретеновидной формы, пластиковые адэрентных клеток. KPSCs B) являются позитивными для мезенхимальных маркеры CD73, CD90, CD105, периваскулярной маркеры NG2, PDGFR-β и CD146, при отрицательной CD31, CD34 и CD45. kPSCs Экспресс MHC-класса я (HLA-ABC), но не класс II (HLA-DR). C) роста характеристик трех различных ССКП доноров из проточной цитометрии подтвердил однородной NG2 позитивные населения (на прохождение 4). kPSCs достичь старение вокруг проход 9-10. KPSCs D) имеют возможность повышения эпителиальных ремонт почек в рану скретч assay. Представитель изображения управления среднего и среднего ССКП кондиционером при t = 0, 4, 8 и 12 h показываются. Линейки в A) = 200 мкм, в D) = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

Периваскулярной клетки были изолированы от многих различных человека твердых органов, включая поджелудочной железы, жира, хряща и почек9,,1516. Большинство методов, однако, основаны на небольшие образцы ткани, которые анализировали и потом лечили пищеварительные ферменты. Кроме того это обычно не выполняется с клинической класс продуктов. Это делает эти стратегии менее подходит для прямого клинический перевод которых необходимо большое количество клинических класса клеток.

Здесь мы покажем Роман изоляции метод человеческого kPSCs для целых органов, основанные на перфузии с клинической класс ферментов и материалами. Протокол приспособлен от изоляции протокол клинических островков Лангерганса в настоящее время для клинического применения в нашем центре18.

Это первый метод клинического класса, где может быть достигнуто большое количество kPSCs. Изменчивость в ячейке урожайности является во многом зависит от доноров. Однако когда экстраполируется доходность клетки, которые мы в настоящее время получить от фракции сырой клеток подвеска трех различных доноров, в теории, средняя урожайность 2.7 x 10-12 kPSCs за доноров может быть достигнуто. Как MSC терапии обычно состоит из 2 клетки инфузии с 1-2 х 106 клеток/кг веса тела4, эти числа клеток являются достаточными для аллогенной лечения нескольких больных.

Один важный шаг в процедуре изоляции является продолжительность коллагеназы пищеварение. Когда задан слишком короткий период пищеварения, останется большие clumps из ткани, которая будет труднее культуры. Когда период перфузии является слишком долго, может наблюдаться увеличение клеточной гибели. Поэтому как только почка начинает становиться мягкой и менее прозрачной жидкости, функции почек следует осторожно массируют и коллагеназы лечение должно быть прекращено.

Другим важным шагом является культура клеток после обогащения клеток NG2. Иногда после обогащения клеток NG2 периваскулярной клетки не начинают размножаться или начинают расти в трехмерных структур. В этом случае когда клетки trypsinized и заполнения, клетки обычно начинают расти в монослойном культивировании.

Как исходный материал, были использованы человека трансплантации почки класс отбрасываются главным образом для хирургического. Это функциональных органов без крупных фиброз. Мы признаем, что это может быть ограничение, как это случается относительно редко и трудно получить орган источник. Описаны функции почек может быть еще одним источником; Однако в зависимости от причины эксплантация почек, эти почки может содержать больше фиброз и таким образом миофибробласты, и поэтому следует проявлять осторожность, поскольку миофибробласты могут быть изолированы и культивировали вместо периваскулярной клетки.

Как изолированные kPSCs с этим протоколом шоу органо Инт свойства с почкой эпителиальных раны исцеление потенциала15, клеточной терапии с kPSCs при заболеваниях почек и пересадки будет интересное будущее применение. Для этой цели существует несколько стратегий клеток/доставки продукции. Первая стратегия является IV вливания kPSCs, как в настоящее время используется в клинических исследованиях показано. Еще одна интересная приложения является использование kPSCs или экскретируется ССКП факторы перфузии машины до пересадки. Таким образом может улучшить качество explanted почки, которые могут привести к улучшению почки после пересадки. Для обеих стратегий kPSCs являются интересный новый источник клеток для дальнейшего изучения клинических целей.

Раскрытие информации

D.G.L., M.A.E., и T.J.R. связаны с патентной заявки относительно этого исследования. Другие авторы имеют ничего не разглашать.

Благодарности

Это исследование получил финансирование от Европейского сообщества, седьмой рамочной программы (FP7/2007-2013) под Грант номер договора 305436 STELLAR.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Мешки BaxterFenwalR4R-7004
Человеческие тромбоцитыSanquinбольничный излишек материала с истекшим сроком годности менее 2 дней используется
лизатна заказ
Одноразовые стерильные бутылкиCorning09-761-11
500 мл полипропиленовые центрифужные пробиркиCorning431123
a-MEM среднийLonzaBE12-169F
глутамакстермофишер35050038
ручки/стрепток;Система переливания инвитроген15070063
Codan455609
DMEM-F12life technologies11320-074
Нормальная человеческая сыворотка (NHS)Sanquin
Hepes 1 MLonzaBE-17-737E
NaHCO3 7,5%LonzaBE17-613E
CaCl< sub>2 1 MSigma-Aldrich10043-52-4
UWBridge to life32911
HeparinLeo Pharma
коллагеназа NB1 GMP gradeSERVA17455.03
DMSOSigma AldrichD2650-100мл
хирургические простыни3M NederlandDH999969404
перфузионный насосMetrohmX007528300
головка насосаMetrohmX077202600
перфузионный лотокна заказ
LS25 трубки masterflexMasterflexHV-96410-25
аксессуаршип Gambro DASCO6038020
пульмозимомRoche
колбы для культуры 25 CM2Greiner690175
колба для культур 75 см2greiner658170
колба для культур 175 cm2greiner661160
Trypsinsigma t4174
Бычий сывороточный альбумин (BSA)SigmaA2153
EDTASigma-AldrichE5134-500g
Блокирующий реагент FcR130-059-901
против меланомы в гранулах (NG2)130-090-452
клеточный фильтр 70 & микро; mCorning352350
LS колонкиMiltenyi130-042-401
MACS магнитMiltenyi130-090-976
CD34 FITCBD 
CD45 APCBD 
CD146 PEBD 
NG2 APCR& DFAB2585A
CD90 PEBD 
HLA ABC APCBD 
CD105 FITCAncell326-040
HLA DR APCBD 
CD56 PEBD 
CD73 PEBD 
CD31 FITCBD 
CD133 ПЭмилтеньи130-090-853
PDGF-r НИР Dmab 1263
мышь IgG1 FITCBD 
мышь IgG1 PEBD 
мышь IgG1 APCBD 
IgG2b PEBD 
козий антимышиный PE DakoR0480
азид натрияMerck822335
DMEM Ham' s F12Gibco31331-028
ITS (инсулин, трансферрин, селен)SigmaI1884
гидрокортизонSigmaH0135
трийодтирининSigmaT5516
Эпидермальный фактор роста (EGF)sigmaE9644
Увековеченный почечный PTEC человека (HK2)любезно предоставлен М. Райаном, Университетский колледж Дублина
тромбоцитов изготовленный 555821555485550315555596555555559866555516550257555445345815345816345818555743

Ссылки

  1. Friedenstein, A. J., et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Exp Hematol. 2 (2), 83-92 (1974).
  2. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  3. Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
  4. Leuning, D. G., Reinders, M. E., de Fijter, J. W., Rabelink, T. J. Clinical translation of multipotent mesenchymal stromal cells in transplantation. Semin Nephrol. 34 (4), 351-364 (2014).
  5. Reinders, M. E., et al. Autologous bone marrow-derived mesenchymal stromal cells for the treatment of allograft rejection after renal transplantation: results of a phase I study. Stem Cells Transl Med. 2 (2), 107-111 (2013).
  6. Perico, N., et al. Autologous mesenchymal stromal cells and kidney transplantation: a pilot study of safety and clinical feasibility. Clin J Am Soc Nephrol. 6 (2), 412-422 (2011).
  7. Perico, N., et al. Mesenchymal stromal cells and kidney transplantation: pretransplant infusion protects from graft dysfunction while fostering immunoregulation. Transpl Int. 26 (9), 867-878 (2013).
  8. Tan, J., et al. Induction therapy with autologous mesenchymal stem cells in living-related kidney transplants: a randomized controlled trial. JAMA. 307 (11), 1169-1177 (2012).
  9. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
  10. Sacchetti, B., et al. No Identical "Mesenchymal Stem Cells" at Different Times and Sites: Human Committed Progenitors of Distinct Origin and Differentiation Potential Are Incorporated as Adventitial Cells in Microvessels. Stem Cell Reports. 6 (6), 897-913 (2016).
  11. Chen, W. C., et al. Human myocardial pericytes: multipotent mesodermal precursors exhibiting cardiac specificity. Stem Cells. 33 (2), 557-573 (2015).
  12. Dekel, B., et al. Isolation and characterization of nontubular sca-1+lin- multipotent stem/progenitor cells from adult mouse kidney. J Am Soc Nephrol. 17 (12), 3300-3314 (2006).
  13. Li, J., et al. Collecting duct-derived cells display mesenchymal stem cell properties and retain selective in vitro and in vivo epithelial capacity. J Am Soc Nephrol. 26 (1), 81-94 (2015).
  14. Pelekanos, R. A., et al. Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities. Stem Cell Res. 8 (1), 58-73 (2012).
  15. Leuning, D. G., et al. Clinical-Grade Isolated Human Kidney Perivascular Stromal Cells as an Organotypic Cell Source for Kidney Regenerative Medicine. Stem Cells Transl Med. , (2016).
  16. Bruno, S., et al. Isolation and characterization of resident mesenchymal stem cells in human glomeruli. Stem Cells Dev. 18 (6), 867-880 (2009).
  17. Ryan, M. J., et al. HK-2: an immortalized proximal tubule epithelial cell line from normal adult human kidney. Kidney Int. 45 (1), 48-57 (1994).
  18. Nijhoff, M. F., et al. Glycemic Stability Through Islet-After-Kidney Transplantation Using an Alemtuzumab-Based Induction Regimen and Long-Term Triple-Maintenance Immunosuppression. Am J Transplant. , (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

NG2wound scratch assay

Похожие статьи