Методическая статья

Индукция клеточной дифференцировки и визуализации отдельных клеток Vibrio parahaemolyticus Плоттеры и богомольцы

DOI:

10.3791/55842

⸱

15 мая 2017 г.

 ,  , 
1Department of Ecophysiology, Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол позволяет одноклеточную микроскопию дифференциально различающихся пловцов Vibrio parahaemolyticus и роевых клеток. Этот метод дает популяцию клеток рояля, легко доступную для анализа одной клетки, и охватывает подготовку клеточных культур, индукцию дифференциации роянов, подготовку образцов и анализ изображений.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Способность изучать внутриклеточную локализацию белков имеет важное значение для понимания многих клеточных процессов. В свою очередь, это требует способности получать отдельные клетки для флуоресцентной микроскопии, что может быть особенно сложным при визуализации клеток, которые существуют в сообществах бактерий. Например, человеческий патоген Vibrio parahaemolyticus существует в виде коротких стержнеобразных пловчих клеток в жидких условиях, которые при поверхностном контакте дифференцируются в субпопуляцию сильно вытянутых клеток рояля, специализированных для роста на твердых поверхностях. В данной статье представлен метод проведения одноячеистого флуоресцентного микроскопического анализа V. parahaemolyticus в двух его дифференциальных состояниях. Этот протокол очень воспроизводимо индуцирует дифференциацию V. parahaemolyticus в жизненный цикл свиной клетки и облегчает их пролиферацию на твердых поверхностях. Этот метод дает вспышки дифференцированных клеток рояля, простирающихся от tОн - край стаи-колонии. Примечательно, что на самом кончике роевых вспышек ячейки рояля существуют в одном слое клеток, что позволяет легко переносить их на предметный стек микроскопа и последующую флюоресцентную микроскопию изображений отдельных клеток. Кроме того, представлен рабочий процесс анализа изображений для демографического представления бактериальных обществ. В качестве доказательства принципа описан анализ внутриклеточной локализации хемотаксисных сигнальных массивов в клетках пловца и свиньи V. parahaemolyticus.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Бактерии постоянно испытывают изменения в своей внешней среде и разработали несколько методов изменения и адаптации своего поведения. Один из таких механизмов включает дифференциацию в различные типы клеток, которые лучше дополняют измененную среду. Дифференциация часто включает в себя значительные изменения в регуляции клеточного цикла, морфологии клеток и пространственно-временную организацию клеток. Один организм, который может дифференцироваться, - Vibrio parahaemolyticus . V. parahaemolyticus принадлежит к Vibrionaceae , который является семейством протеобактерий, которые обычно обитают в пресной или соленой воде. Vibrionaceae широко распространены в окружающей среде и включают в себя несколько видов, которые вызывают инфекции кишечного тракта у людей, в том числе Vibrio cholerae.В. Parahaemolyticus - диморфный организм и способен дифференцироваться в два разных типа клеток в ответ на изменение егоВнешняя среда. В водных средах он существует как короткая стержнеобразная плоская клетка с одиночным полярным жгутиком, расположенным на старом полюсе клетки. При поверхностном контакте запускается дифференциация в рояльную клетку. Дифференциация клеток Swarmer включает в себя два основных изменения: морфогенез стайчатых клеток через торможение клеточного деления и индукцию второй системы жгутиков. Это приводит к формированию перифричной и сильно вытянутой палочковидной рояльной клетки, которая может либо продолжить образ жизни рояля, где события деления приводят к появлению клеток рогатого потомства, либо, альтернативно, дифференцируются обратно в клетки пловца.

Сообщалось о нескольких факторах, вызывающих или влияющих на дифференцировку рояля. Первичный стимул, по-видимому, управляется механосенсингом, где V. parahaemolyticus использует полярный жгутик в качестве тактильного датчика, который обнаруживает ингибирование вращения при поверхностном контакте, но некоторые другие факторы задействованы в качествеСкважина 1 . В лаборатории вращение полярного жгутика может быть искусственно ингибировано добавлением фенамила, который блокирует вегетарианное вращение натриевого канала, тем самым вызывая дифференцировку рояля 2 . Кроме того, в более раннем исследовании Vibrio alginolyticus был индуцирован для роения на твердых средах, когда клетки размножались на ростовой среде в чашке Петри, запечатанной прозрачной пластиковой лентой. Насыщенная щелочью фильтровальная бумага препятствовала роению в этих условиях, поэтому предполагалось, что одна или несколько летучих кислот могут участвовать в индукции роения. Таким образом, герметизация чашки Петри пластиковой лентой, вероятно, позволила накапливать летучие кислоты, образующиеся в качестве побочных продуктов клеточного метаболизма, в пределах свободного пространства пластины. Тот же эффект был достигнут, когда H 2 O 2 был добавлен к ростовой среде в незапечатанных чашках Петри для искусственного получения летучих кислот путем гидролиза компонентов среды 3 , 4 , 5 . Тем не менее, идентичность таких летучих кислот остается неизвестной. Более того, было показано, что избыточная доступность кальция 6 и железа-ограничения 7 как усиливает размножение рояля, так и пролиферацию на твердых поверхностях. Клетки могут голодать из-за железа, добавляя соединение 2,2'-бипиридил в среду для роста, которая, как было показано, влияет на дифференцировку рояля 8 . Факторы, известные регулировать дифференцировку, теперь реализуются при разработке протокола, который воспроизводимо индуцирует дифференциацию V. parahaemolyticus в клетки рояля и их пролиферацию на твердых поверхностях агара.

V. parahaemolyticus дифференцировка включает в себя значительные изменения в регуляции клеточного деления, клеточной морфологии и позиционирования макромолекулярных машин, таких как flagellА и хемотаксис - процессы, для которых все требуют специфической локализации белков в соответствии с клеточным циклом. Таким образом, способность изучать внутриклеточную локализацию таких белков является существенной для понимания вышеупомянутых клеточных процессов. Для проведения таких исследований требуется флуоресцентная микроскопия на отдельных клетках. Это может быть особенно сложным при визуализации клеток, которые существуют в плотных бактериальных популяциях, как это имеет место для роевых клеток. Были попытки побудить дифференцировку рояля в жидких средах, которые могли бы потенциально генерировать отдельные клетки для микроскопических исследований. И хотя на уровне транскрипции эти клетки частично индуцировали программу размножения рояликов, они не подвергаются таким же отчетливым морфологическим изменениям, как полностью дифференцированные клетки свиньи, выращенные на твердой среде 8 . Эта статья предлагает надежный и воспроизводимый протокол метода, чтобы вызвать ройер се11 на поверхности агара. Протокол дает популяцию легкодоступных клеток свиньи, легко доступных для одноэлементной микроскопии и последующего анализа. Кроме того, протокол позволяет провести локализацию флуоресцентно меченых белков как в клетках пловец, так и в рояльных клетках (разделы 1, 2, 3, 4). Кроме того, протокол описывает последующий рабочий процесс о том, как обрабатывать и анализировать сгенерированные данные из экспериментов по флуоресцентной микроскопии, что позволяет проводить демографический анализ бактериальных сообществ (раздел 5).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Получение электро-компетентных клеток V. parahaemolyticus и электропорация плазмидной ДНК в клетках пловец

ПРИМЕЧАНИЕ. В следующем разделе протокола допускается подготовка электрокомпетентных клеток и последующая электропорация плазмидной ДНК в клетках пловец. Этот этап важен, если флуоресцентные белки эктопически экспрессируются из плазмиды.

  1. Вычерпывают клетки V. parahaemolyticus из запаса глицерина -80 ° С на свежий пластинчатый агар LB, содержащий 100 мкг / мл ампициллина, и инкубируют в течение ночи при 37 ° C.
  2. На следующий день инокулируют 200 мл среды LB одной колонией V. parahaemolyticus и инкубируют ее при 37 ° С в условиях встряхивания до достижения OD 600 1,0. Обычно для культивирования клеток требуется 5-6 ч инкубации, чтобы достичь желаемой оптической плотности.
  3. Немедленно переносите клетки на лед и очищайтеВсе дальнейшие этапы на льду и в предварительно охлажденных центрифугах с температурой 4 ° C.
  4. Убирают клетки при 4 ° С в течение 10 мин при 2000 х g.
  5. Отбрасывают супернатант декантацией и повторно суспендируют осадок клеток в 25 мл ледяного 273 мМ раствора сахарозы (рН 7,4, забуференный KOH).
  6. Урожай клетки снова при 4 ° С в течение 10 мин при 2000 х g. Повторите два раза.
  7. Повторно суспендируйте промытый осадок клеток в 400 мкл ледяного 273 мМ раствора сахарозы. Затем добавляют глицерин до конечной концентрации 15 об.% / Об. Клетки теперь готовы для электропорации, но также могут быть заморожены в аликвотах 70 мкл при -80 ° C для последующего использования.
  8. Для электропорации смешать 70 мкл аликвоту электрокомпетентных клеток с 100-1000 нг плазмидной ДНК и перенести смесь в ледяную кювету для электропорации (0,2 см электродный зазор). Выполните электропорацию со следующими настройками: 25 мкФ, 2400 В и 200 Ом.
  9. Приостановить действиеКлеток в кювете для электропорации в 600 мкл бульона LB, переносят в пробирку объемом 2 мл и инкубируют при встряхивании при 37 ° С в течение 3 часов.
  10. Спином вниз клеток на 2000 мкг в течение 5 мин и повторно суспендирования гранул в 100 мкл бульона LB. Распределить клеточную суспензию на селективные пластины агара LB, содержащие необходимые антибиотики, и инкубировать при 37 ° С в течение ночи.
  11. На следующий день проверьте пластины для образования колонии. Колонии, которые растут, несут правильный ген устойчивости к антибиотикам, кодируемый на плазмиде, и могут теперь использоваться для дальнейших экспериментов.

2. Индукция дифференциации клеток рояля

ПРИМЕЧАНИЕ. Следующие этапы описывают, как вызвать дифференцировку V. parahaemolyticus в его жизненный цикл рояльной клетки и как стимулировать пролиферацию на твердых поверхностях.

  1. Приготовьте 4 г агара Heart Infusion (HI) в 100 мл ddH 2 O, чтобы подготовить ротационные пластины.
  2. Тщательно кипятите раствор HI-агара в микроволновой печи и время от времени встряхивайте бутылку до растворения порошка. Автоклав при 121 ° С в течение 20 мин.
  3. После автоклавирования охлаждают агар HI до 60-65 ° C. Добавить 2,2'-бипиридил до конечной концентрации 50 мкМ (исходный раствор 50 мМ в 100% этаноле). Добавить CaCl 2 до конечной концентрации 4 мМ (исходный раствор 4 М в ddH 2 O). Если необходимо, добавьте антибиотики в раствор для поддержания плазмид.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Если вы планируете использовать индуцибельную плазмиду, добавьте индуцирующий агент к ее конечной концентрации.
    ОСТОРОЖНО: 2,2'-Бипиридил: Острая токсичность (устные, кожные, ингаляционные). При работе с этим химикатом пользуйтесь перчатками и защитными очками.
  4. Налейте 30 - 35 мл конечного раствора агара HI в круглую 150 - миллиметровую чашку Петри и дайте агару затвердеть.
  5. Прямо перед культивированием культуры клеток высушите чашку с агаром при 37 ° С в течение не менее 10 мин (или пока не останутся какие-либо жидкие остаткиНо не более) вверх-вправо с открытой крышкой.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Время высыхания сильно зависит от используемого инкубатора, и сильно высушенные пластины не позволят роиться V. parahaemolyticus . (Этот шаг очень важен!) Плиты должны быть свежими и не старше 2 - 3 часов. Старые пластины будут слишком сухими, чтобы стимулировать роение.
  6. Прививают небольшое количество клеток от края одной колонии в 5 мл бульона LB. Инкубируйте культуру, встряхивая при 37 ° С до достижения OD 600 = 0,8, обычно это занимает 2-3 часа. После этого клетки готовы к нахождению на агаровых пластинках HI с копотью.
  7. Пятна 1 мкл клеточной культуры в центре комара HI-агара ( рис. 1А ).
  8. Дайте пятно высохнуть ( рис. 1B ).
  9. Заклейте пластину прозрачной пластиковой лентой и убедитесь, что она прочно прикреплена, иначе она может отсоединиться во время ночной инкубации ( рис. 1С ).
    ПРИМЕЧАНИЕ.Очень важно, чтобы печать была совершенной. Избегайте образования воздушных пузырьков и складок на ленте при ее применении.
  10. Инкубируйте планшет при 24 ° С в течение ночи. Это приведет к формированию стайной колонии V. parahaemolyticus с роевыми вспышками, идущими от периферии роевой колонии ( рис. 2 ).

3. Приготовление клеток рояля V. parahaemolyticus для флуоресцентной микроскопии

ПРИМЕЧАНИЕ. В нижеследующем протоколе описывается, как приготовить микроскопические слайды агарозы и последующий отпечаток вспыхивающих вспышек на агарозной подушке для получения одиночных клеток рояля для микроскопии.

  1. Для приготовления агарозных слайдов для микроскопии добавляют 1 г агарозы к 100 мл 20% об. / Об. PBS и 10% об. / Об. LB бульонного раствора. Тщательно кипятите раствор в микроволновой печи для растворения агарозы и дайте ей остыть до 65-70 ° C при смешивании с магнитной мешалкой.
  2. Место переменного токаНежирный микроскоп скользит на совершенно ровную часть рабочего стола. Обрежьте оба конца слайда двумя слоями лабораторной маркировочной ленты общего назначения, фиксируя предметное стекло на рабочем столе. Расстояние между двумя частями ленты должно составлять около 3 см.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Два слоя ленты создают очень маленькую отметку, которая определит высоту агарозной прокладки. Важно, чтобы рабочее пространство было ровным, чтобы клетки были в одной плоскости для микроскопического анализа.
  3. Налейте ~ 250 мкл ранее приготовленного раствора агарозы на незакрытую стеклянную поверхность.
  4. Теперь поместите второй слайд микроскопа в той же ориентации, что и нижний сверху, и слегка нажмите на него, чтобы остаточная агароза могла вытекать в стороны.
  5. Дайте агарозе затвердеть 1-2 минуты, а затем медленно потяните верхний предметный стекол от нижнего горизонтальным движением.
  6. Используя скальпель, отрежьте любую остаточную агарозу, которая прикреплена кСтороны слайда микроскопа и медленно удалите ленту с концов предметного стекла микроскопа.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Слайд агарозы теперь готов и должен использоваться как можно скорее, так как он постепенно начнет высыхать.
  7. Чтобы выполнить микроскопию на клетках рояля, вырежьте кусочек агара размером ~ 3 мм × 10 мм с самого внешнего края колошниковой колонии ( рис. 1D ). Очень важно не разрывать ленточное уплотнение рояльной пластины до тех пор, пока непосредственно перед переносом клеток рояля на предметное стекло микроскопа. После того как лента удалена, роившиеся клетки V. parahaemolyticus инициируют дифференцировку в клетки пловца.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Обязательно направляйте срезы с внешней стороны края колонии колонии внутрь колонии ( рис. 1D ). Таким образом, вы можете предотвратить «загрязнение пловца» в краю колошниковой колонии.
  8. Перенесите кусок рояного агара на предметное стекло с агарозой для микроскопа и клетки, обращенные к агарозе.D ( фиг. 1E ). Это отпечатывает роющие клетки на агарозную подушку.
  9. Подождав ~ 30 с, аккуратно снимите агаровый кусочек с агарозной подушки ( рис. 1F ).
  10. Поместите покровное стекло на агарозную подушку, где отпечатаны клетки. Клетки теперь готовы к микроскопии.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Важно сразу же отображать клетки рояля, так как клетки рояли медленно начинают дифференцировать состояние пловца.

4. Получение V. parahaemolyticus Plimmer Клеточные культуры для флуоресцентной микроскопии

ПРИМЕЧАНИЕ. В этом разделе протокола описывается, как подготовить культуру V. parahaemolyticus для проведения флуоресцентной микроскопии на клетках типа пловца.

  1. Прививают небольшое количество клеток от края одной колонии в 5 мл бульона LB. Инкубируйте культуру, встряхивая при 37 ° С в течение 1 ч или пока не станет видно небольшое увеличение клеток.
  2. ВНа этой стадии, если необходимо, добавляют стимулирующий агент для экспрессии представляющих интерес белков. В этом примере L-арабинозу добавляли до конечной концентрации 0,2% (мас. / Об.), Чтобы индуцировать экспрессию YFP-CheW 9 .
  3. Инкубируйте культуру, встряхивая еще 2 ч при 37 ° С.
  4. Выполните шаги 3.1-3.7, чтобы приготовить микроскопические агарозные слайды.
  5. Пятна 1 мкл культуры клеток в центре площадки агарозы и позволить пятно инкубировать, пока он не высохнет.
  6. Поместите покровное стекло на агарозную подушку, где были замечены клетки. Клетки теперь готовы к отображению под флуоресцентным микроскопом.

5. Анализ изображений

Эта часть протокола описывает рабочий процесс анализа изображений, в частности, как извлекать данные флуоресценции одиночных ячеек для демографического анализа.

  1. Перед началом анализа изображения убедитесь, что все изображения микроскопии сохранены в 16-битном формате TIF,
  2. Загрузите DIC (или фазовый контраст) и соответствующие изображения флуоресцентного канала в программное обеспечение.
  3. Создайте оверлейное изображение обоих каналов, выбрав «Отобразить / Наложить изображения». Установите количество изображений («# Images:») на два и выберите изображение DIC в первом канале и флуоресцентное изображение во втором канале.
  4. Выберите инструмент «Multi-Line» на панели инструментов и отметьте ячейки от одного полюса до другого через середину ячейки. Чтобы получить список всех сгенерированных линий (линейных объектов), откройте «Измерение / измерение области». Настройте измерения региона, чтобы отображать только метку области, расстояние и среднюю интенсивность.
  5. Откалибруйте размер пикселя в разделе «Измерение / Калибровка расстояний» до размера пикселя, который является специфическим для вашей настройки микроскопа, и нажмите «Применить ко всем открытым изображениям».
  6. Перенесите все регионы (линейные объекты) на изображение флуоресцентного канала. В разделе «Регионы / трансферы»Er Регионы "выберите исходное изображение (оверлейное изображение) и конечное изображение (изображение флуоресцентного канала). Выберите« Все регионы »и нажмите« OK ».
    ПРИМЕЧАНИЕ. Чтобы позднее можно было повторно создавать точные строки (линейные объекты, области, ROI), откройте «Регионы / Сохранить регионы» и сохраните регионы.
  7. Экспортируйте все измерения области в электронную таблицу, открыв «Measure / Region Measurements» и нажав «Open Log». Подтвердите открытие и экспорт данных. Как только электронная таблица откроется в фоновом режиме, окончательно экспортируйте данные, нажав «F9: Данные журнала».
  8. Чтобы определить положение флуоресцентных фокусов вдоль ячейки, откройте «Measure / Linescan». Установите для параметра «Ширина линии» значение так, чтобы вся ширина ячейки была покрыта областью, которую вы ранее создали. Щелкните правой кнопкой мыши график линейного сканирования и выберите «Показать данные графика». Щелчком левой кнопки мыши и перетаскиванием курсора мыши вдоль линии сканирования наТочки интереса, в окне «Графические данные» отобразится соответствующий пиксель / расстояние между двумя точками. Выберите синюю выделенную строку, а затем скопируйте содержимое.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Весь профиль интенсивности линейного сканирования можно записать в электронную таблицу, нажав «Log Data» в окне «Linescan». Извлеченные данные теперь можно использовать для визуализации на графиках или дальнейшего статистического анализа. Образцы локализации над клеточным циклом можно легко визуализировать в демографическом представлении длины клетки и интенсивности флуоресценции вдоль тела клетки. Эти представления могут быть получены с использованием той же выбранной ранее ROI. Следующие шаги приведут пример того, как создавать демографические данные, аналогичные тем, которые показаны на рисунках 3C и 4C .
    1. В графических областях области загрузки Fiji / ImageJ (.rgn), ранее созданных в программном обеспечении (шаг 5.6), с использованием «Metamorph nd и импортера файлов ROI»;. Альтернативно, представляющие интерес области (ROI) анализируемых ячеек могут быть созданы непосредственно в Фиджи / ImageJ с помощью встроенного инструмента «Сегментированная линия».
    2. Откройте «Analyze / Tools / ROI manager» и пометьте все активные записи списка ».
    3. После этого нажмите «More / Multi Plot», а затем выберите «Список» в новом окне «Multi Plot». Нажмите на запись в таблице, затем выберите и «скопируйте все». Затем вставьте в новую таблицу.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Убедитесь, что данные самой длинной ячейки (двух соответствующих столбцов X и Y с наибольшим количеством строк) являются последними справа в электронной таблице.
    4. Сохраните электронную таблицу как «CSV (с разделителями-запятыми) (* .csv)».
    5. Скачайте R-скрипты отсюда «https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles» 10. Сценарии сортируют ячейки по длине и нормализуют профили интенсивности флуоресценции всех клеток как среднее значение флуоресценции каждой клеткие.
    6. Запустите весь сценарий «профили ячеек function.R» в R [версия 3.0.1; 11 ].
    7. Отредактируйте сценарий «example plots.R» в строке 30 так, чтобы путь к файлу ссылался на папку, в которой сохранен ранее созданный CSV-файл. Кроме того, измените имя файла «profile.csv» в строке 31 на имя файла, выбранного для .csv-файла, сгенерированного на шаге 5.9.4. Затем запустите «example plots.R» и следуйте документации из «https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles», а также комментарии из файла сценария для демографического анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Индукция дифференцировки и генерация колонии роя

На рисунке 1 представлена ​​схема важных этапов, связанных с получением рояльных колоний V. parahaemolyticus ( Рисунок 1A-C ). Культуру пловца определяли на рожковом агаре и инкубировали при 24 o C, вызывая размножение и пролиферацию рояна по поверхности твердого агара. На рис. 2 представлен репрезентативный сте...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье описывается метод микроскопии изображений рояльных клеток V. parahaemolyticus с последующим анализом, направленным на разрешение и количественную оценку субклеточной локализации и других особенностей изученных флуоресцентно меченных белков. Хотя существуют несколько инструментов для обработки и анализа изображений микроскопов 14 , 15 , 16 , 17 ,

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Конфликт интересов не объявлен.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана обществом Макса Планка.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>Компоненты среды
LB среднийRothX968.3
Difco Agar, гранулированныйBD214510Для приготовления LB агара со средним
Difco Heart Infusion AgarBD244400Для приготовления HI агаровых роящихся пластин
Agarose NEEO, ультра качественныйRoth2267.3Для приготовления микроскопии агарозные прокладки
Название<strong>CompanyКаталожный номерКомментарии
>Добавки
L-арабинозаRoth5118.3Используется для индуцирования производных pBAD
2,2'-бипиридилаSigma AldrichD216305-25GДля приготовления пластин для роения агара HI
Дигидрат хлорида кальцияRoth5239.1Для приготовления тарелок для роения агара
HI Ампициллин натриевая сольRothK029.3
ХлорамфениколRoth3886.3
PBS буфер--Стандартный рецепт для фосфатно-солевого
D(+) СахарозаРота4621.1Для получения электрокомпетентных элементов
ГлицеринРота3783.5Для приготовления электрокомпетентных элементов
Название<strong>CompanyНомер в каталогеКомментарии
>Hardware
Чашка Петри 150 мм х 20 мм с кулачкамиSarstedt82.1184.500Для приготовления пластин для роения HI агара
kelvitron t (B 6420)Heraeus-Используется для сушки пластин роя HI агара
Gene Pulser Xcell Microbial SystemBioRad 1652662Используется для электропорации плазмидной ДНК
НазваниеCompanyНомер в каталогеКомментарии
Software
MetaMorph Offline (версия 7.7.5.0)Молекулярныеустройства-используютсядля анализа изображений под микроскопией
ExcelMicrosoft-используютсядля анализа данных микроскопии
буфера

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. Flagellar dynamometer controls swarmer cell differentiation of V. parahaemolyticus. Cell. 54 (3), 345-351 (1988).
  2. Kawagishi, I., Imagawa, M., Imae, Y., McCarter, L., Homma, M. The sodium-driven polar flagellar motor of marine Vibrio as the mechanosensor that regulates lateral flagellar expression. Mol. Microbiol. 20 (4), 693-699 (1996).
  3. Ulitzur, S. Induction of swarming in Vibrio parahaemolyticus. Arch. Microbiol. 101 (4), 357-363 (1974).
  4. Ulitzur, S. Effect of temperature, salts, pH, and other factors on the development of peritrichous flagella in Vibrio alginolyticus. Arch. Microbiol. 104 (3), 285-288 (1975).
  5. Ulitzur, S. The mechanism of swarming of Vibrio alginolyticus. Arch. Microbiol. 104 (1), 67-71 (1975).
  6. Gode-Potratz, C. J., Chodur, D. M., McCarter, L. L. Calcium and iron regulate swarming and type III secretion in Vibrio parahaemolyticus. J. Bacteriol. 192 (22), 6025-6038 (2010).
  7. McCarter, L., Silverman, M. Iron regulation of swarmer cell differentiation of Vibrio parahaemolyticus. J. Bacteriol. 171 (2), 731-736 (1989).
  8. Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Mol. Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).
  9. Heering, J., Ringgaard, S. Differential Localization of Chemotactic Signaling Arrays during the Lifecycle of Vibrio parahaemolyticus. Front Microbiol. 7 (November), 1-12 (2016).
  10. Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zupan, J. R., Zik, J. J., Zambryski, P. C. Peptidoglycan synthesis machinery in Agrobacterium tumefaciens during unipolar growth and cell division. mBio. 5 (3), (2014).
  11. Development Core Team, R. F. F. S. C. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. 1, 2673(2008).
  12. Ringgaard, S., et al. ParP prevents dissociation of CheA from chemotactic signaling arrays and tethers them to a polar anchor. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (2), E255-E264 (2014).
  13. Ringgaard, S., Schirner, K., Davis, B. M., Waldor, M. K. A family of ParA-like ATPases promotes cell pole maturation by facilitating polar localization of chemotaxis proteins. Genes Dev. 25, 1544-1555 (2011).
  14. Vischer, N. O. E., et al. Cell age dependent concentration of Escherichia coli divisome proteins analyzed with ImageJ and ObjectJ. Front Microbiol. 6 (JUN), (2015).
  15. Schneider, C. a, Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  16. Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. High-throughput, subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics. Mol. Microbiol. 80 (3), 612-627 (2011).
  17. Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis. Nat. Microbiol. 1, 16077(2016).
  18. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100(2006).
  19. Morales-Soto, N., et al. Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays. J. Vis. Exp. (98), e52338(2015).
  20. Paintdakhi, A., et al. Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Mol. Microbiol. 99 (4), 767-777 (2016).
  21. de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. -W. Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy. J. Vis. Exp. (53), e1-e6 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Vibrio parahaemolyticusCellular DifferentiationSwarmer CellsSingle Cell ImagingFluorescence MicroscopySwarm Colony FormationAgarose Slide PreparationChemotaxis Protein LocalizationBacterial MorphogenesisDemographic Analysis

Похожие статьи