Индукция клеточной дифференцировки и визуализации отдельных клеток Vibrio parahaemolyticus Плоттеры и богомольцы

Summary

Этот протокол позволяет одноклеточную микроскопию дифференциально различающихся пловцов Vibrio parahaemolyticus и роевых клеток. Этот метод дает популяцию клеток рояля, легко доступную для анализа одной клетки, и охватывает подготовку клеточных культур, индукцию дифференциации роянов, подготовку образцов и анализ изображений.

Abstract

Способность изучать внутриклеточную локализацию белков имеет важное значение для понимания многих клеточных процессов. В свою очередь, это требует способности получать отдельные клетки для флуоресцентной микроскопии, что может быть особенно сложным при визуализации клеток, которые существуют в сообществах бактерий. Например, человеческий патоген Vibrio parahaemolyticus существует в виде коротких стержнеобразных пловчих клеток в жидких условиях, которые при поверхностном контакте дифференцируются в субпопуляцию сильно вытянутых клеток рояля, специализированных для роста на твердых поверхностях. В данной статье представлен метод проведения одноячеистого флуоресцентного микроскопического анализа V. parahaemolyticus в двух его дифференциальных состояниях. Этот протокол очень воспроизводимо индуцирует дифференциацию V. parahaemolyticus в жизненный цикл свиной клетки и облегчает их пролиферацию на твердых поверхностях. Этот метод дает вспышки дифференцированных клеток рояля, простирающихся от tОн - край стаи-колонии. Примечательно, что на самом кончике роевых вспышек ячейки рояля существуют в одном слое клеток, что позволяет легко переносить их на предметный стек микроскопа и последующую флюоресцентную микроскопию изображений отдельных клеток. Кроме того, представлен рабочий процесс анализа изображений для демографического представления бактериальных обществ. В качестве доказательства принципа описан анализ внутриклеточной локализации хемотаксисных сигнальных массивов в клетках пловца и свиньи V. parahaemolyticus.

Introduction

Бактерии постоянно испытывают изменения в своей внешней среде и разработали несколько методов изменения и адаптации своего поведения. Один из таких механизмов включает дифференциацию в различные типы клеток, которые лучше дополняют измененную среду. Дифференциация часто включает в себя значительные изменения в регуляции клеточного цикла, морфологии клеток и пространственно-временную организацию клеток. Один организм, который может дифференцироваться, - Vibrio parahaemolyticus . V. parahaemolyticus принадлежит к Vibrionaceae , который является семейством протеобактерий, которые обычно обитают в пресной или соленой воде. Vibrionaceae....

Protocol

1. Получение электро-компетентных клеток V. parahaemolyticus и электропорация плазмидной ДНК в клетках пловец

ПРИМЕЧАНИЕ. В следующем разделе протокола допускается подготовка электрокомпетентных клеток и последующая электропорация плазмидной ДНК в клетках пловец. Этот этап важен, если флуоресцентные белки эктопически экспрессируются из плазмиды.

1. Вычерпывают клетки V. parahaemolyticus из запаса глицерина -80 ° С на свежий пластинчатый агар LB, содержащий 100 мкг / мл ампициллина, и инкубируют в течение ночи при 37 ° C.
2. На следующий день инокулируют 200 мл среды LB одной колонией ....

Results

Индукция дифференцировки и генерация колонии роя

На рисунке 1 представлена ​​схема важных этапов, связанных с получением рояльных колоний V. parahaemolyticus ( Рисунок 1A-C ). Культуру пловца определяли на рожковом агаре и инкубировали при 24 ^o C, вызывая размножение и пролиферацию рояна по поверхности твердого агара. На рис. 2 представлен репрезентативный сте.......

Discussion

В этой статье описывается метод микроскопии изображений рояльных клеток V. parahaemolyticus с последующим анализом, направленным на разрешение и количественную оценку субклеточной локализации и других особенностей изученных флуоресцентно меченных белков. Хотя существуют несколько инструментов для обработки и анализа изображений микроскопов ^{14 , 15 , 16 , 17 ,}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<сильно>Компоненты среды
LB средний	Roth	X968.3
Difco Agar, гранулированный	BD	214510	Для приготовления LB агара со средним
Difco Heart Infusion Agar	BD	244400	Для приготовления HI агаровых роящихся пластин
Agarose NEEO, ультра качественный	Roth	2267.3	Для приготовления микроскопии агарозные прокладки
Название<	strong>Company	Каталожный номер	Комментарии
>Добавки
L-арабиноза	Roth	5118.3	Используется для индуцирования производных pBAD
2,2'-бипиридила	Sigma Aldrich	D216305-25G	Для приготовления пластин для роения агара HI
Дигидрат хлорида кальция	Roth	5239.1	Для приготовления тарелок для роения агара
HI Ампициллин натриевая соль	Roth	K029.3
Хлорамфеникол	Roth	3886.3
PBS буфер	-	-	Стандартный рецепт для фосфатно-солевого
D(+) Сахароза	Рота	4621.1	Для получения электрокомпетентных элементов
Глицерин	Рота	3783.5	Для приготовления электрокомпетентных элементов
Название<	strong>Company	Номер в каталоге	Комментарии
>Hardware
Чашка Петри 150 мм х 20 мм с кулачками	Sarstedt	82.1184.500	Для приготовления пластин для роения HI агара
kelvitron t (B 6420)	Heraeus	-	Используется для сушки пластин роя HI агара
Gene Pulser Xcell Microbial System		BioRad 1652662	Используется для электропорации плазмидной ДНК
Название	Company	Номер в каталоге	Комментарии
Software
MetaMorph Offline (версия 7.7.5.0)	Молекулярные	устройства-используются	для анализа изображений под микроскопией
Excel		Microsoft-используются	для анализа данных микроскопии