Методическая статья

Трехмерные ткани спроектированы в соответствие экзоцитоз сетей для пилки развития механизмов и содействия регенерации нервной системы

DOI:

10.3791/55848

⸱

10 января 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Brain Injury & Repair, Department of Neurosurgery, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Center for Neurotrauma, Neurodegeneration & Restoration, Michael J. Crescenz Veterans Affairs Medical Center, 3School of Biomedical Engineering, Drexel University, 4Department of Bioengineering, School of Engineering and Applied Sciences, University of Pennsylvania, 5Neuroscience Graduate Group, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы витрина развития собственн-собранные, трехмерные связки продольно соответствие Астроцитарная somata и процессов в рамках Роман биоматериала оболочки. Эти инженерии «живые леса», экспонируется микрон шкала диаметр еще расширение сантиметров в длину, могут служить в качестве тест кровать изучения механизмов психомоторного развития или облегчить neuroregeneration направляющие нейронной миграции и/или аксональное Поиск пути.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нейротравма и нейродегенеративные заболевания часто приводят к прочному неврологического дефицита из-за ограниченных возможностей центральной нервной системы (ЦНС) для замены потерянных нейронов и регенерировать аксональное пути. Однако во время развития нервной системы, нейронной миграции и аксональной расширение часто происходят вдоль путей, образованный другие клетки, называют «живые леса». Стремясь подражать Эти механизмы и разработать стратегию, которая обходит среды ингибирующих ЦНС, эта рукопись представляет протокол для изготовления тканей спроектированы на основе экзоцитоз «живые леса». Для создания этих конструкций, мы используем схему оболочки Роман биоматериала, чтобы побудить астроциты самостоятельно собрать в плотной трехмерные жгуты биполярного продольно по краю somata и процессов. Во-первых, полые гидрогеля микро столбцы были собраны, и внутренний просвет был покрыт коллагена внеклеточного матрицы. Диссоциированных мозговой коры астроциты затем были доставлены в просвете цилиндрических микро колонки и в критических внутренний диаметр < 350 мкм, спонтанно самостоятельно выровнены и контракт производить долго волоконно как кабели, состоящий из плотных пучков экзоцитоз процессов и фибрилл коллагена измерения < 150 мкм в диаметре, но расширение несколько см в длину. Эти инженерии жизни леса выставлены > 97% клеток жизнеспособность и были практически исключительно состоит из астроцитов, выражая сочетание промежуточного накаливания белки глиальных фибриллово кислой белка (СВМС), виментин и Нестин. Это соответствие экзоцитоз сетей были найдены для предоставления разрешительной субстрата для нейронов вложения и по краю neurite расширение. Кроме того эти конструкции сохранять целостность и выравнивание при извлечении из гидрогеля оболочки, что делает их пригодными для имплантации ЦНС. Эти предварительно конструкции структурно подражать cytoarchitectural ключевые элементы естественным глиальных на основе «живые леса» в естественных условиях. Таким образом эти инженерии жизни леса могут служить в качестве тест кровать учиться психомоторного развития механизмов в пробирке или облегчить neuroregeneration, направляя нейронной миграции и/или аксональное пути после ЦНС дегенерации в естественных условиях .

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Центральной нервной системы (ЦНС) имеет ограниченные возможности противодействовать потери и/или дисфункции нейронов и аксональной пути, которые сопровождают условий, таких как черепно-мозговой травмы (ЧМТ), инсульт, травме (ТСТ) и нейродегенеративных заболеваний спинного1 ,-2,-3,-4,-5. Нейрогенез в ЦНС ограничивается ограниченное количество областей в мозге, препятствует восстановлению утраченных нейронов6,7. Кроме того восстановление утраченных аксональное путей в ЦНС недостаточно из-за отсутствия направленного указаний, присутствие ингибиторов нарост и реактивной astrogliosis после повреждения нервной ткани2,8, 9,10. Астроциты, как правило, имеют различные функции в деле оказания помощи нейронов с ионного гомеостаза, Распродажа нейромедиатора, формирования синапсов и нервно-сосудистых муфты11. Тем не менее после даже умеренные повреждения нервной ткани, астроциты могут пройти молекулярные, структурные и функциональные изменения, как они переход к гипертрофических состояние11. В ответ на серьезные нейротравма эти изменения приводят к формированию шрам с полутень, содержащие перенос реактивной астроциты и поражения ядро, которое включает в себя лейкоциты, утечка из расколовшегося гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), микроглии, Олигодендроциты и фибробласты11,12,13. Эти реактивные астроциты достичь морфология нитевидные, неорганизованное процессов и демонстрируют увеличение выражение промежуточного накаливания белков и протеогликаны хондроитин сульфат (CSPGs), которые препятствуют нейронная регенерация12. Несмотря на то, что глиальный рубец первоначально помогает восстановить целостность BBB и избежать передачи воспалительной реакции на окружающие здоровые ткани, он служит физических и биохимических барьер против регенерации аксона12,14 ,,1516. Например аксоны которых сталкиваются глиальный рубец отображения луковичных дистрофические роста шишки и сдерживали рост12. Кроме того дезорганизация Астроцитарная процессов после травмы препятствует расширение регенерировать аксоны17. Итоги этих характеристик тормозной проявляется в часто постоянного физические и неврологические расстройства, которые пациенты страдают после тяжелой нейротравма, включая ЧМТ и SCI.

Независимо от того, внешние задачи, стоящие перед функциональным регенерации в ЦНС аксоны было показано, обладают внутреннюю способность к регенерации. Например динамический характер дистрофические роста конусов при контакте с глиальный рубец свидетельствует о том, что эти окончаний сохраняют свою способность расширять12. Следовательно считается, что основным препятствием для аксональное re рост является среды ингибирующих после травмы ЦНС и что предоставление более питательную среду через сокращение глиальных рубцов и/или предоставление восстановительной мосты через шрам будет выгодно. Действительно предыдущие исследования показали, что нейронов ЦНС способны расширения аксоны через поражения с помощью периферических нервов графтов как мосты, которые создают более благоприятные условия для axon регенерации12,18, 19. Ряд других стратегий предпринимались эксплуатировать этот рудиментарный регенеративной способностью. К примеру манипуляции клеток роста сигнальных путей в различных моделях травмы привело к аксональное регенерации и глиальных Шрам сокращения10,,2021. Кроме того исследования показали, что лечение с chondroitinase ABC, который расщепляет большинство цепочки сахара в CSPGs, уменьшает эффект CSPGs, выделяемый реактивной астроциты22. Несмотря на обнадеживающие результаты, эти подходы не дают направлен руководством конусы роста, которые потенциально может приводить к аномальным регенерации12, а также не учитывают потери нейронов. Подходы на основе клеток были использованы в попытках преодолеть последствия глиальный рубец и пополнить потерянные клеток, особенно нейронов. Некоторые группы Дедифференцированная реактивной астроциты в нейроны, в то время как другие пересажены нейронных прогениторных клеток в поражениях ЦНС населить области травмы и поощрять аксона регенерации23,24, 25. Однако, трансплантация стволовых клеток только ограничивается низкой выживаемости, плохое интеграции и скромный удержания в поврежденной ткани5. Кроме того эти стратегии на основе клеток удастся восстановить междугородной аксональное участки, особенно в контролируемым образом. Таким образом биоматериалов в сочетании с другими подходами в настоящее время изучаются как средства доставки для различных нейронных и клеток-предшественников и роста факторы26. Подходы на основе биоматериала имеют высокую степень управления дизайн для производства конструкций, которые имитируют конкретные физические, haptotaxic, и chemotaxic сигналы в трехмерной (3D) микроокружения целевого узла ткани27, 28,29,30,,3132,,3334. Воспроизведение этих экологических сигналов имеет первостепенное значение для пересаженные клетки представить родной как морфология, распространения, миграции и сигнализации, среди других нейробиологических характеристики29. Несмотря на эти выгодные свойства улучшению за пределами традиционных клеток посеян биоматериала подмостей требуется одновременно направлены междугородной аксональное регенерации и заменить потерянные нейронов.

Обещая альтернативный подход основан на нервной ткани инженерии «живые леса», которые отличаются от других подходов, основанных на ячейки, из-за присутствия живых нервных клеток с предварительно cytoarchitecture, что эмулирует родной нейроанатомия и/или развития механизмов для облегчения целевых замена, восстановление и регенерация нейронной схемы4,35. Соображения по проектированию жизни леса включают фенотипы и источники нервные клетки, а также механические/физические свойства и биохимические сигналы продиктовано состав любых сопровождающих биоматериалов35. После изготовления в пробирке, эти живые леса может быть имплантирован в естественных условиях настоящего молекул клеточной адгезии и эозинофилов и нейротрофическими сигналы активно регулировать миграцию нервных клеток и аксон нарост в зависимости от государства и прогрессирование регенераторные процессы35. Глиальные клетки может служить основой для инженерных cytoarchitecture жизни леса, так как эти клетки посредником различные механизмы развития в естественных условиях. Во время развития мозга новые нейроны полагаются на базальную процессы, продлен на радиальной глии из желудочков зоны к развивающихся корковых пластины как живые леса для миграции направлены36,37. Кроме того расширение роста шишки показано ориентироваться по зондирования привлекательным и репелленты сигналы с ориентиром глиальных клеток и так называемые «первопроходца» аксоны предлагается достичь правильной цели, расширяя вдоль заранее узорной глиальных помостами35,,3839. Таким образом, глиальные клетки необходимы для руководства первопроходца аксонов, которые впоследствии служат как на основе аксон «живые леса» в прямой проекции «последователь» аксоны. Кроме того, механизмы роста глии опосредованной было показано постнатально, сохраняются как нейробласты следовать ростральной миграционных потока (RMS) для перехода из субвентрикулярной зоны (SVZ), один из немногих оставшихся областей нейрогенез взрослого мозга, обонятельные луковицы (OB)40. Эти нейробласты в RMS мигрируют в глиальных трубки (рис. 1а-1), который состоит из продольно в соответствие Астроцитарная процессов, через прямой ячеек спаек и локализованные растворимых факторов37, 41. Наконец, хотя повреждения ЦНС в млекопитающих причин нарушается механизм Астроцитарная процесса формирования глиальных шрам, который физически препятствует аксональное регенерации17, многие системы не млекопитающих не хватает формирования глиальных наносит шрам. Скорее глиальные клетки не млекопитающих видов поддерживать более организованной, соответствие шаблонов, которые используются в качестве руководства через пострадавшего региона17,42,43. Например в моделях SCI не млекопитающих, аксоны показываются расти в тесном сотрудничестве с глиальных мосты, пересекая поражения, предлагая важную роль для организованных глиальных леса как субстратов, содействия аксональное регенерации и восстановления функций ( Рисунок 1A -2) 42 , 44 , 45. перепросмотре нейроанатомический функций и развития/восстановительных механизмов, описанных выше может принести новый класс инженерии глиальных основе жизни леса, которые могут одновременно управлять незрелых нейронной миграции и аксональной Поиск пути через иначе либеральной среды, тем самым потенциально смягчения последствий нейронов и аксон тракта дегенерации, связанные с ЦНС травмы и болезни.

Наша исследовательская группа ранее разработала несколько типов живых подмости для восстановления и регенерации аксональное участки в ЦНС и периферической нервной системы (ПНС) через микро ткани спроектирован нейронных сетей (микро TENNs) и ткани графтов инженерии нерва (TENGs), соответственно27,46,47,48. Обе стратегии по существу основаны на biomimicry. Микро-TENNs являются анатомически вдохновил сооружения, предназначенные для структурно и функционально заменить аксональное участки, подключение различных нейрональных популяций головного мозга. TENGs использовать механизму развития аксон способствовали аксональное регенерации, подтверждается «последователь» аксон роста вдоль аксоны «Пионер», для достижения целевой хост аксональное регенерации35,46,48. Мы недавно капитализируются на универсальность живых эшафот техника с использованием аналогичной схемы оболочки как микро TENNs и ищет вдохновение от механизмов на основе глии представить на протяжении развития. Здесь мы разработали конструкции, состоящей из унифицированных Астроцитарная связки, охватывающих коллагеновых люмен гидрогеля микро колонки49. Эти леса Астроцитарная жизни, разработанные Первое заполнение сборку капиллярной трубки иглоукалывание иглы с жидким агарозы для создания полые цилиндрические гидрогеля с внешнего диаметра (OD) и внутренний диаметр (ID) соответствующих диаметров трубки и иглы, соответственно. После геля агарозы и извлечение микро столбце гидрогеля с капиллярной трубки, полые интерьер является покрытием с типом коллаген предоставлять среде разрешительных для экзоцитоз адгезии и соответствие комплекта формирования (рис. 1B -1). После этого просвет заполняется с мозговой коры астроциты, изолированы от послеродового крыса щенков (Рисунок 1B-2). Вопреки двухмерный (2D) выравнивания методы, которые полагаются на применение электрических полей, micropatterned канавки и внеклеточного матрикса (ECM) белка кучность, экзоцитоз выравнивания в жизни леса способ полагается на самостоятельной сборки по данным контролируемых переменных, таких как субстрат кривизны (столбец ID), плотность ячеек и коллаген концентрации50,51,52. Астроциты контракт и перестроить коллагена и приобрести биполярный, продольно соответствие морфологии, аналог природных лесов, наблюдается в vivo (рис. 1B-3). Действительно мы активно осуществляем использование этих кабель подобных структур как физические субстратов для целенаправленного руководства миграции незрелых нейронах, а также содействия аксональное регенерации в неблагоприятной окружающей среде повреждения ЦНС, особенно млекопитающих глиальный рубец (рис. 1 c). Эта статья представит подробные изготовления для Астроцитарная микро колонки, фаза контраст и иммунофлюоресценции изображения ожидаемого cytoarchitecture и всеобъемлющее обсуждение текущих ограничений и будущие направления деятельности техника.

figure-introduction-1
Рисунок 1: вдохновение, изготовление протокол и предлагаемых приложений для выровненного Астроцитарная сетей. (A) нейробиологических вдохновение: (1) нейробласты возникая от нейрогенный субвентрикулярной зоны (SVZ) использовать продольно унифицированных глиальных трубки в ростральной миграционных потока (RMS) для направленного миграции к обонятельной луковицы (OB); (2) Non млекопитающих, таких как амфибий и рыб могут поддерживать регенерации после нервной ткани ущерб отчасти за счет формирования глиальных мост, который соединяет заканчивается поражением (например пересекал спинного мозга) и служит леску для руководства регенерирующее аксоны. (B) Обзор изготовления: (1) строительство микро столбца микронного размера, полые гидрогеля с люмен, покрытые ECM, (2) заполнение первичной коры астроциты, изолированы от послеродового крыса детенышей, (3) самосборки продольно ориентированных связки в культуре и (4) добыча комплект из оболочки биоматериала для исследования будущей имплантации. (C) в естественных условиях применения: (1) эти живые леса могут служить инженерии глиальных трубы для направленного нейрон миграции из нейрогенный центров, чтобы населить нейрон недостаточным регионов; (2) резюме развития механизма новаторской руководство аксона и регенеративной механизм глиальных мостов в не млекопитающих может наделить эти Астроцитарная леса с способностью прямой регенерации аксона через не разрешительной окружающей среды млекопитающих глиальный рубец. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры были одобрены институциональный уход животных и использование комитетами в университете штата Пенсильвания и Майкл J. Crescenz ветеранов медицинский центр управления по делам и придерживаться руководящих принципов, изложенных в политике службы общественного здравоохранения НИЗ на человека Уход и использование лабораторных животных (2015).

1. Разработка агарозы гидрогеля микро-колонок

  1. Сделать 3% агарозном вес/объем (w/v) раствор, весом 3 g агарозы и передачи его в стерильных стакан, содержащие 100 мл Дульбекко фосфатный буфер (DPBS). Добавить стерильные магнитный бар в стакан и поместите его на поверхность горячей плиты/мешалкой. Держите стакан, накрыть, чтобы предотвратить испарение ее содержимое на следующем шаге.
  2. Нагрейте агарозы и DPBS при температуре 100 ° C и перемешайте на 60-120 об/мин. Настроить эти параметры, как необходимо и постоянно контролировать прогрессирование процесса распада, как решение изменения первоначально от непрозрачного четкий вид, что означает, что агарозы полностью распущена.
    Внимание: Горячий стакан и решение горячие!
  3. Как агарозы раствор нагревается и перемешивают, получить четыре пустые 10 см Петри и добавляют 20 мл DPBS в двух из них. Место иглы для акупунктуры (диаметр: 300 мкм, длина: 40 мм), стеклянные капиллярные трубки микролитр (диаметр: 701.04 мкм, длина: 65 мм, грузоподъёмность: 25,0 мкл) и диспенсером шарик внутри шкафа биобезопасности. Когда раствор жидкого агарозы очищает, поддерживать постоянное Отопление на приблизительно 50 ° C и помешивая, чтобы избежать геля агарозы.
  4. Ввести акупунктурные иглы в отверстие нижней колбы распылителя. Вставьте капиллярную трубку через иглу, подвергается снаружи. Закрепите капиллярной трубки, введя часть его в раздел резиновые цилиндра распределитель колбы.
  5. Передача 1 мл жидкого агарозы с микропипеткой на поверхности пустой чашке Петри и место один конец капиллярной трубки вертикально (с иглой вставлены) контакт с агарозы, в то время как резиновую крышку распределителя лампы является защемления внутрь. Медленно отпустите давление на крышку лампы распределитель рисовать агарозы в капиллярную трубку.
    Примечание: Передача жидких агарозы в капиллярной трубки должны выполняться быстро. Если остается жидкой агарозы для охлаждения на поверхности Петри достаточное время (примерно 60 s), он начинает гель, предотвращая подходит отсасывание агарозы вдоль капиллярной трубки.
  6. Место каждой лампы труба иглы сборки в бесплатную чашку Петри и пусть агарозы гель внутри капиллярных трубок закрепить за 5 минут осторожно потяните капиллярную трубку с руками из резиновой пробкой в цилиндре распределитель колбы, оставляя иглу и гель агарозы в месте внутри трубки.
  7. Вручную извлечь акупунктурные иглы, медленно потянув его из капиллярной трубки; также недавно затвердевших агарозы цилиндра слайды из трубки в этой процедуре, по-прежнему вокруг иглы. Нежно подталкивать микро колонки вдоль иглоукалывание иглы с кончика стерильный пинцет, чтобы переместить его в конец. Поместите иглу открытой, DPBS-содержащих Петри и вставьте DPBS микро колонки с щипцами.
    Примечание: Если агарозы микро столбец остается внутри стеклянной капиллярной трубки после удаления акупунктурные иглы, медленно толкать агарозы микро столбец из капиллярной трубки с 25-мм иглы и в блюдо с DPBS.
  8. Стерилизуйте микроскальпели или щипцы с использованием горячей шарик стерилизатор. Сделайте 4% w/v агарозы, весом 4 g агарозы и передачи его в 100 мл DPBS. Тепло и движение как описано в шаге 1.2 для получения четких 4% раствора жидкого агарозы. Поддержания нагрева и перемешивания раствора на протяжении следующих шагов.
  9. Передача Петри, содержащий микро столбцы, чтобы вскрытия капота и переместить микро столбец с тонкой щипцами пустой чашке Петри. Используют стереоскоп для визуальной ориентации и microscalpel сократить микро столбцы до желаемой длины. Трим обоих концах формы конические концы углом 45o от горизонтали для облегчения обработки микро столбцов при добавление ECM и ячейки.
  10. Повторите предыдущий шаг для трех более микро столбцы в том же Петри и выровняйте четыре конструкции параллельно с разделением < 3 мм между каждым из цилиндра. Загрузить 50 мкл раствора 4% агарозном с микропипеткой и залить микро столбца массива для подключения и комплект конструкций в группы по четыре подряд/линия жидкости (далее называется «микро колонка лодки»). Избегайте движения 4% агарозном к концам микро столбцов, которые могут засорить интерьер, сведения к минимуму расстояние между конструкциями и добавляя агарозы быстро в тонкой линией.
    Примечание: Организация групп четыре микро столбцов в «лодочки» не требуется для изготовления Астроцитарная леса. Тем не менее лодки служат для ускорения процесса изготовления и предложить более безопасный способ перемещения и обрабатывать микро столбцы в последующих шагах.
  11. Пусть прохладно микро колонки лодка для 1-2 мин разрешить геля агарозы добавлен 4%. Подбирать лодка микро колонки с тонкой щипцами, соединительные агарозы 4% и переместить микро столбцы других DPBS-содержащих Петри блюдо, приготовленное в шаге 1.1.3. Изготовить больше лодки с оставшиеся микро столбцы нужным.
  12. Переместить Петри, содержащий микро столбцы или лодки биобезопасности кабинета и стерилизации с воздействием ультрафиолетового (УФ) света за 30 мин.
    Предупреждение: Носить надлежащую защиту для предотвращения воздействия Ультрафиолета.
  13. Хранить блюда с лодки микро колонка в DPBS на 4 ° C, если сложение ECM и ячейки покрытия не произойдет сразу же после этого, вплоть до 1 недели. Повторите шаги микро колонки изготовление, если в течение этого срока не используются конструкции.

2. изоляции и культуры главной ячейки

  1. Корковых экзоцитоз изоляции от крыс щенков
    1. В рамках подготовки следующих шагов добавьте 20 мл Хэнка сбалансированного солевого раствора (HBSS) для четырех Петри 10 см, которые будут служить в качестве резервуаров для расчлененных тканей. Держите все блюда на льду. Стерилизуйте чистой хирургические ножницы, щипцы, микро шпатель и микро Скальпели в стерилизаторе горячей шарик.
    2. Prewarm трипсин 0.25% с 1 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) и 0,15 мг/мл дезоксирибонуклеаза (DNase) я в HBSS при 37 ° C. Кроме того prewarm экзоцитоз питательной среды при 37 ° C, которая состоит из Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM) с ветчиной и F-12 питательной смеси и 10% плода бычьим сывороточным (ФБС).
    3. Анестезировать послеродовой день 0 или 1 день Sprague-Dawley крыса щенков, подвергая их гипотермического условий и усыпить путем обезглавливания. Контактный голову в сцену с помощью 19 мм манометра в морду впереди глаз.
    4. Сделайте надрез с помощью скальпеля посередине кзади передний, от основания шеи до позади глаз. Осуществляют еще один разрез сбоку идя от непосредственно за глаза вниз, образуя Т-образных. Использование тонкой щипцы стащить черепной кожи/черепа в сторону.
    5. Держите голову морду (вверх), поместив один зубец щипцы в рот животного и другой на внешней поверхности. Удаление мозга с стерильных микро шпателем и поместите его в одном из Петри, наполнен охлажденным HBSS. Место это Петри блюдо на льду сразу же после этого и вообще раза за исключением когда в использовании.
    6. Расположить блока гранита, ранее сохраненные при-20 ° C ниже стереоскоп внутри рассечение Худ. Место на поверхности гранита блок для сохранения своей низкой температуре во время процедуры вскрытия Петри с ткани мозга. Используйте стереоскоп как визуального руководство на протяжении следующих шагов.
    7. Если обонятельные луковицы остаются нетронутыми, извлечь их путем резки с щипцами или микроскальпели. Кроме того используйте microscalpel для удаления мозжечка и сделать разрез средней линии, разделяющей две полушарий. Трансфер полушарий с щипцами в чашку Петри, содержащий свежие, охлажденные HBSS.
    8. Вскрыть структур мозга изнутри с microscalpel для получения только раздельный коре полушарий. Использование тонкой щипцы слезает мозговых оболочек, лист как структура, из кортикального слоя ткани и передать новым Петри с холодной HBSS изолированных коре. Используйте microscalpel, чтобы фарш ткани для того, чтобы увеличить площадь поверхности для действий трипсина в следующем шаге.
    9. Использование пипетки Пастера передать 15 мл пластиковых пробирок, содержащий 4 мл подогретую трипсина-ЭДТА (8 коре в каждой тюбике) коре. Разоблачить кортикального слоя ткани трипсина ЭДТА для 5-7 минут при 37 ° C.
    10. С пипетка Пастера, тщательно удалить трипсина ЭДТА и 400 мкл 0,15 мг/мл DNAse I решение для пластиковых пробирок. Агитируйте трубки или вихрь, до тех пор, пока все ткани в отрыве и есть нет оставшихся кусков ткани в жидкости. Если это не возможно полностью раствориться в ткани, удалите оставшиеся фрагменты с кончика пипетки Пастера.
    11. Центрифуга трубка, содержащая решение диссоциированных ячейки на 200 g x 3 мин удалить супернатант с пипетка Пастера не нарушая клетки. Добавьте 1 mL экзоцитоз питательной среды (определенных в шаге 2.1.2) на трубу с микропипеткой и агитировать Ресуспензируйте и создать однородное решение.
    12. Передавать T-75 флакон 10 мл экзоцитоз питательной среды с Серологические Пипетки. Добавьте 250 мкл раствора 1 мл клеток (подготовленных на шаге 2.1.11) с микропипеткой Фляга для пластины одного щенка мозга стоит клеток за флакон. Равномерно распределите разряженные ячейки решения питательной среды и аккуратно агитировать Фляга для дальнейшего содействия равномерное распределение.
    13. Культура покрытием колбы в увлажненные инкубатора при 37 ° C и 5% CO2. После достижения 24 и 72 h в культуре, механически агитируйте настой отделить типы non сторонник клеток, нейронов и олигодендроциты.
    14. Впоследствии на каждой из этих timepoints, выполните изменение средств массовой информации. Держите флакон вертикально так СМИ культуры лежит на дне колбы, покрывающие не придерживался клетки. Аспирационная питательной среды с пипетка Пастера, нажатие кончиком пипетки против в нижнем углу Колб, чтобы избежать извлечения клетки. Фляга в исходное горизонтальное положение и аккуратно добавить 10 мл экзоцитоз среды над клетки с Серологические Пипетки.
    15. Возвращение колбы в инкубатор после каждого изменения средств массовой информации. После того, как достичь 90% confluency, механически агитируйте настой еще раз, чтобы удалить любые оставшиеся без соблюдения клетки.
    16. Проход астроциты, беря питательной среды с вакуумом и пипетки Пастера. Добавьте 5 мл 0,25% трипсина-ЭДТА с серологические пипетки над придерживался клетки. Аккуратно агитировать Фляга для обеспечения что трипсин охватывает все клетки и инкубировать Фляга для 5-7 минут при 37 ° C и 5% CO2.
    17. Утолите трипсина, добавив 1 мл среды экзоцитоз клетки с Серологические Пипетки. Извлечение клеток решение из колбу с Серологические Пипетки и перенести его на стерильную 15 мл пластиковых пробирок. Центрифуга трубки на 200 g x 3 мин.
    18. Удалить супернатант с Серологические Пипетки и Ресуспензируйте в 1 мл экзоцитоз питательной среды. Агитируйте трубки, чтобы убедиться, что клетки решение однородной. Подсчитать количество ячеек в растворе с Горяева или счетчик автоматический клеток.
      Примечание: Настой, который обычно составляет 90% притока дает около 3 миллионов астроциты.
    19. Добавьте 10 мл экзоцитоз питательной среды в T-75 колбу. Выполните разбавления 1:4, передав 250 мкл раствора клеток (шаг 2.1.18) с микропипеткой T-75 колбу, уже содержащий питательной среды. Аккуратно агитируйте обеспечить распределение однородной ячейки по всей поверхности колбы.
    20. Повторите шаги 2.1.16-2.1.19 каждый раз, когда 90% confluency достигается для прохода клетки.
  2. Корковых нейронов изоляции от плодов крысы
    1. Выполните аналогичные препараты как шаги 2.1.1 и 2.1.2, за исключением, что подогретую СМИ является сопредседатель культуры средств массовой информации, состоящей из Neurobasal средний + дополнение B-27 2% (для нейронов) + 1% G-5 сыворотки бесплатные дополнения (для астроциты) + 0,25% L-глютамина.
    2. Усыпить приурочен беременных эмбриональных день 18 Sprague-Dawley крыс с двуокиси углерода удушья и подтвердить смерть, обезглавливание.
    3. Экстракт плодов крысы и вскрыть коре от остальной части мозговой ткани в чашках Петри, содержащий HBSS на поверхности блока охлажденные гранита, используя стереоскоп для визуальной ориентации и стерилизовать ножницы, microscalpel и щипцы53 . После последовательных рассечение головы мозга, полушарий и коре, передачи каждой ткани в новой заполнены HBSS Петри блюдо.
    4. Фарш кортикального слоя ткани на более мелкие фрагменты увеличить площадь поверхности для трипсина. Передача 4-6 коре с Пастер Пипетка в трубку с 5 мл подогретую трипсина-ЭДТА и поддерживать при 37 ° C, чтобы отделить ткани. В 5-7 мин вручную агитируйте трубки смешивать и предотвращения слипания ткани.
    5. Снять трубку от 37 ° C после 10 мин. Как описано ранее в шаге 2.1, экстракт трипсина ЭДТА и заменить с 1.8 мл 0,15 мг/мл раствора DNAse. Впоследствии вихревой ткани до решения появляется однородной, без фрагментов тканей, плавающие в жидкости.
    6. Центрифуга диссоциированных ткани решение на 200 g x 3 мин. После удаления супернатанта, Ресуспензируйте в 2 мл Сопредседатель питательной среды. Подсчитать количество ячеек в этом растворе с Горяева или счетчик автоматический клеток.
      Примечание: Обычно урожайность-3.0-5.0 x 106 клеток/коры полушария.
    7. Подготовьте новое решение ячейки с плотностью 2.0-4.0 x 105 клеток/мл в средствах массовой информации Сопредседатель культуры, определенных выше.

3. Разработка Астроцитарная кабели внутри микро столбцы

  1. Изготовление основных ECM
    Примечание: ECM должен быть добавлен к интерьеру гидрогеля микро колонки в тот же день, в котором будет выполняться заполнение ячейки.
    1. Внутри шкафа биобезопасности, подготовить 1 мг/мл решение крысы хвост типа I коллагена в среде совместно культуры в стерильных microcentrifuge трубку. Поддерживать пробки microcentrifuge с решения ECM на льду все время, за исключением тех случаев, когда в использовании.
    2. Передача 1-2 мкл раствора ECM с микропипеткой на полосе лакмусовой бумаги для оценки ее рН. 1 мкл 1 N гидроокиси натрия (NaOH) или соляной кислоты (HCl) с микропипеткой для увеличения или уменьшения рН раствора ECM, соответственно и Пипетка вверх и вниз для гомогенизации. Проверьте новый pH с полосой лакмусовая бумага и добавить больше кислоты или основания, при необходимости, до тех пор, пока pH стабилен в пределах 7,2-7,4.
    3. Переместить Петри с шагом 1,2 рассечение капот и передачи 4-5 микро столбцы или лодку пинцетом стерильную тонкой пустой, стерильные 35 или 60 мм Петри. С помощью стереоскоп для руководства, расположить 10 мкл кончик микропипеткой на одном конце каждой микро колонки и всасывания очистить Люмене DPBS и воздушные пузырьки. Подтвердите отсутствие воздушных пузырьков с стереоскоп обеспечить что ECM, добавлен в следующем шаге может свободно течь через просвет.
    4. Обвинение P10 микропипеткой решение ECM, место 10 мкл наконечник против один конец гидрогеля микро колонки и доставить достаточно раствор для заполнения люмен (примерно 3-5 мкл), наблюдения за вступление ECM с стереоскоп. Пипетка небольшое водохранилище (2-4 мкл) решения ECM на любом конце микро колонки.
      Примечание: Всегда управлять 4-5 микро столбцы или одна лодка, в то время для предотвращения длительной сушки конструкции, как это может привести к комкая микро столбец структуры. Полностью высохшей микро столбцы прочно прикрепить к поверхности чашки Петри, которая предотвращает их использование для заполнения ячейки. Чрезмерное количество совместно культуры средств массовой информации (как мера гидратации) нельзя добавить в микро столбцы, потому, что это может привести к ECM стеканию во время инкубационного периода, описанные ниже.
    5. Пипетка Сопредседатель культуры средств массовой информации в кольцо вокруг Петри для обеспечения влажности раковина для предотвращения столбцы от пересыхания во время инкубации. Инкубируйте Петри, содержащие ECM-содержащих микро столбцы при 37 ° C и 5% CO2 для 1 h способствовать полимеризации коллагена перед добавлением нейронов и/или астроциты.
      Примечание: ECM должны образуют слой покрытия внутренней поверхности полой люмен, вместо твердого сердечника ECM, охватывающих интерьер, оба из которых можно наблюдать с помощью стереоскоп. Если ECM формирует ядро, продолжайте инкубационный период до тех пор, пока остается только слой. С этого слоя сформированные экзоцитоз клеток решение может заполнить интерьер микро-в столбце действия покрытия.
    6. Инкубационный период Подготовьте решение клеток экзоцитоз (как описано ниже).
  2. Экзоцитоз и нейрон посева в микро столбцы
    1. Проход покрытием астроциты (между четвертой и двенадцатой проход), как описано в шагах 2.1.16-2.1.19. После подсчета количества ячеек в колбу, приготовляют раствор клеток на плотности 9,0-12,0 x 105 клеток/мл раствора в культуре клеток СМИ приостановлена.
    2. С помощью стереоскоп, поместите кончик микропипеткой P10 на одном конце микро-столбцов и передачи достаточно клеток решение (~ 5 мкл) в Люмене полностью заполнить его. Как это сделано выше с ECM, добавьте небольшие водоемы ячейки решения к обоим концам каждого микро столбца.
    3. Инкубируйте покрытием микро столбцы на чашки Петри при 37 ° C и 5% CO2 за 1 ч до поощрения приверженности астроциты ECM. Если нейроны не будут добавляться к микро столбцы, переходите к шагу 3.2.5.
    4. После первоначального инкубационный период, добавить 1-2 мкл раствора корковых нейронов, полученный на шаге 2.2.7 в обоих концах микро колонок с микропипеткой, отметив под стереоскоп. Убедитесь, что достаточные средства в блюда, чтобы избежать высыхания и снова Инкубируйте 40 минут при 37 ° C и 5% CO2 для адгезии нейронов.
      Примечание: Корковых нейронов решения также могут быть добавлены 1-2 дней после формирования комплекта, выполняя шаг 3.2.4 после тщательно удаление Петри с микропипеткой культуры средств массовой информации.
    5. После инкубационного периода, тщательно заполните Петри, содержащие покрытием микро колонок с 3 или 6 мл Сопредседатель культуры средств массовой информации для 35 или 60 мм Петри, соответственно. Поддержание позолоченный микро столбцы в культуре при 37 ° C и 5% CO2 для содействия самостоятельной сборки из унифицированных Астроцитарная связки, которые должны стать комплекте, кабель как структура после 6-10 ч.
  3. Стабилизация экзоцитоз кабель архитектуры
    Примечание: После формирования пачек, приблизительно 6-12 ч культивирования конструкции, выполните следующие действия для предотвращения распада унифицированной структуры Астроцитарная леса.
    1. В стерильные microcentrifuge трубку, подготовить коллагена хвост крысы 3 мг/мл я решение в сотрудничестве культуры средств массовой информации. Отрегулируйте рН раствора до 7,2-7.4 следуя указаниям, приведенным в шаге 3.1.2. Поддерживать коллагена фондовых и Сопредседатель культуры средств массовой информации на льду когда не в пользе и место подготовленные коллагена раствор на льду во все времена.
    2. Удалите средства массовой информации из Петри, содержащие Астроцитарная леса с микропипеткой, оставляя некоторые средства массовой информации по бокам блюдо для создания влажности приемника, который обеспечивает увлажнение микро столбцы. Поместите блюдо под стереоскоп для оказания помощи в визуализации.
    3. С микропипеткой принимать 2-3 мкл раствора коллагена и разгрузки для каждого конца микро столбцов, используя стереоскоп для визуальной ориентации. Убедитесь, что блюдо имеет достаточные средства массовой информации вокруг сторон действовать в качестве поглотителя влаги по краям блюдо. Проинкубируйте чашки Петри с микро столбцы для 30 минут при 37 ° C и 5% CO2 в увлажненные инкубатор для содействия гелеобразования добавленный коллагена.
    4. Медленно добавьте 3 или 6 мл Сопредседатель культуры средств массовой информации (для 35 или 60 мм Петри блюда, соответственно) для Петри блюда с пипеткой и культура блюда в увлажненные инкубатор на 37 oC и 5% CO2.

4. Добыча Астроцитарная пучки из гидрогеля интерьер

  1. Стерилизуйте coverslips стекла в автоклаве. Подготовьте 20 мкг/мл раствора поли L-лизин (PLL) в стерильных клетки культуры класс воды.
  2. Внутри шкафа биобезопасности вручную передать стерильные 10 см Петри coverslips стерилизованные стеклянные и добавить достаточно PLL решение для покрытия coverslips.
  3. Инкубируйте coverslips, покрытые PLL решением, для 30 минут при 37 ° C для покрытия поверхности. Удаление решения PLL с пипетка Пастера после 30 минут промыть три раза путем добавления воды класса культуры клеток в coverslip и его удаления с пипетка Пастера.
  4. После формирования унифицированных глиальных расслоение тонко передать микро колонки стерильных Петри пинцетом стерильную тонкой и добавить небольшой бассейн 10 мкл СМИ культуры совместно с микропипеткой для предотвращения обезвоживания и обеспечения здоровья расслоение. Экстракт Астроцитарная пучок из гидрогеля микро колонки, осторожно потянув от одного конца пинцетом стерильные хирургические, используя стереоскоп для визуальной ориентации.
  5. Проведение Астроцитарная расслоение с щипцами, смонтируйте его на coverslip PLL-покрытием. Исправить и пятна с протоколом ниже.

5. Immunocytochemistry для исследования In Vitro

Примечание: Для этого исследования, первичного антитела были кролик анти глиальных кислой фибриллово белка (СВМС) (1: 500), мышь анти β-тубулина III (1: 500), кролик анти коллаген I (1: 500), анти Нестин мыши (1: 200) и кролик анти виментин (1: 100). Вторичные антитела были осла анти мыши 568, осел анти кролик 568, осел анти кролик 488 и осел анти мышь 568 (1: 500 для всех). Во всех случаях добавьте достаточный объем каждого решения, чтобы полностью покрыть микро столбцы.

  1. Приготовляют раствор формальдегида 4% Объем/объем (v/v) в 1 x DPBS внутри химического зонта.
    Предупреждение: Формальдегид является токсичные соединения, известный канцерогенами и должны утилизироваться в отдельном контейнере. Всегда манипулировать это соединение внутри Химический вытяжной шкаф и использовать средства индивидуальной защиты (СИЗ) как лаборатории пальто, защитные очки и перчатки.
  2. В случае микро колонки отказаться от культуры СМИ от Петри, содержащие конструкции с пипетка Пастера без случайно отсасывание гидрогеля цилиндров. Добавьте достаточно раствора формальдегида для покрытия навесные coverslips (оба из которых остаются на чашки Петри) или микро столбцы и инкубировать в течение 35 минут при температуре 18-24 ° C.
  3. Извлечь 4,0% формальдегида раствор из фиксированной микро столбцы или coverslips с Серологические Пипетки. Промойте фиксированной микро столбцы три раза с PBS, быстро добавляя и удаляя PBS дважды и затем давая им замочить на 10 мин в третий раз.
  4. Растворяют нормальной лошадь сыворотки (NHS) в PBS для концентрации 4% v / v. подготовить раствор с неионных моющего средства в концентрации 0,3% v/v используя ГСЗ решение в качестве растворителя.
  5. Удалите из Петри, содержащие микро столбцы или coverslips с пипеткой PBS. Добавьте достаточно 0,3% раствором моющего средства для покрытия микро столбцы/coverslips 60 мин при температуре 18-24 ° C для разрушения клеток.
  6. Вывезти моющего раствора и промыть быстро два раза с PBS и три раза путем замачивания на 5 мин рассчитать необходимый объем 4% ГСЗ и каждой из первичных антител для приготовления раствора с концентрацией желаемого антитела.
  7. Удаление PBS из чашки Петри и добавить достаточно основное антитело (разводят в 4% ГСЗ-DPBS) решение для покрытия микро столбцы или извлеченные Астроцитарная связки. Инкубируйте на ночь (12-16 ч) при 4 ° C.
  8. Принять решение основное антитело и быстро промыть два раза с PBS и три раза путем замачивания за 5 мин. Приготовляют раствор вторичного антитела, в темноте, с каждого антитела присутствуют при разбавлении 1: 500 в 4,0% NHS решения.
  9. Инкубировать клетки с решением вторичное антитело втечение 2 ч при температуре 18-24 ° C. На протяжении всего времени инкубации покрывают Петри, содержащий микро колонок с алюминиевой фольгой, чтобы избежать воздействия света.
  10. Удаление решения вторичного антитела и добавьте Hoechst раствор (1:10, 000) для 10 мин на 18-24 ° C до пятно ядер.
    Предупреждение: "Хёхст" является известным мутаген, что должно рассматриваться как канцероген. Таким образом, его необходимо утилизировать в отдельном контейнере и СИЗ должны быть использованы в любое время при обработке этого агента.
  11. Промойте с PBS пять раз, каждый раз на 5-10 минут, потом, хранить окрашенных микро столбцы при температуре 4 ° C в PBS и накрыть алюминиевой фольгой. В случае навесные Астроцитарная связки добавить каплю водный монтажа средних расслоение, место другой стекла coverslip над фиксированной расслоение и уплотнение обоих coverslips с Лак для длительного хранения и последующей обработки изображений.

6. жизнеспособность Assay с Live мертвых (Флуорексон-AM/ethidium Антуану) окрашивания

  1. Подготовка раствора реагента, добавив 5 мкл Флуорексон AM (4 мм в безводный диметилсульфоксида (ДМСО)) и 20 мкл ethidium Антуану-1 (EthD-1) (2 мм в ДМСО/H2O 1:4 v/v) до 10 мл 1 x DPBS. Охватывать решение с алюминиевой фольгой или хранить в темноте, чтобы защитить его от света.
  2. Аспирационная СМИ от Петри, содержащие покрытием микро колонок с пипетка Пастера и добавить достаточно решение (подготовлен выше) для покрытия конструкций. Инкубируйте 30 минут при 37 ° C и 5% CO2, сохраняя Петри, покрыты для защиты от света решение.
  3. Удаление решения с микропипеткой или пипетка Пастера. Промыть 2 - 3 раза с DPBS, как описано в шаге 5.3. Наводнение Петри с DPBS по размеру блюдо. Сразу же изображение клетки после этого с помощью эпифлуоресцентного или конфокальная томография.
    Примечание: Преобразование проницаемой мембраны Флуорексон утра чтобы Флуорексон метаболически активные клетки дает зеленый флуоресценции Флуорексон. Мертвые клетки, помечаются как под угрозой мембраны клеток, которые позволяют вход EthD-1 в ячейку и ее привязку к нуклеиновых кислот, вызывая красной флуоресценцией.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Первоначально, фазово контрастной микроскопии был использован для контролировать прогрессирование экзоцитоз адгезии и расслоение формирования и общей стабильности cytoarchitecture как функцию от времени. В 1 ч после покрытия астроциты были найдены во всем люмен микро колонок с сферически морфологии (рис. 2A). В 5 ч астроциты начал расширение процессов и контрактов, от 8 h клетки выставлены полный процесс подшипник морфологии и сформировали кабель подобных стр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

По сравнению с более благоприятной среды ПНС, ЦНС в обработке негативные последствия нейротравма и нейродегенеративные особенно ограничено. После серьезным оскорблением млекопитающих ЦНС глиальный рубец образуется, состоящий из основного фиброзных и воспалительных клеток, окруженный плотной сети дезорганизованы реактивной астроциты, которые выделяют аксона ингибирующих нарост протеогликаны14. Этот шрам действует как физических и биохимических непроходимость против регенерации аксона окончаний

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Финансовая поддержка была оказана национальных институтов здравоохранения [U01-NS094340 (Каллен) & F31-NS090746 (Katiyar)], Майкл Джей Фокс фонд [Лечебный конвейер программа #9998 (Каллен)], Пенн медицины нейробиологии центра пилот Award (Каллен), Национальный научный фонд [выпускник исследовательских стипендий DGE-1321851 (Struzyna)], Департамент по делам ветеранов [ОР & D заслуги обзор #B1097-я (Каллен)] и США армия медицинских исследований и техники команда [#W81XWH-13-207004 (Каллен) & W81XWH-15-1-0466 (Каллен)].

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Акупунктурная игла (300 & микро; m diameter)Lhasa MedicalHS.30x40Диаметр может быть изменен в зависимости от желаемого размера просвета микроколонны.
Чашка ПетриFisher08772B
Фосфатный буферный раствор Дульбекко (DPBS)Invitrogen14200075
Полистирол одноразовая серологическая пипеткаFisher13-678-11D
AgaroseSigmaA9539-50G
Микролитровая стеклянная капиллярная трубка (701 &; m)Fisher21-170JДиаметр может быть изменен в зависимости от желаемого размера оболочки микроколонны.
Диспенсер для микроколпачков Fisher21-170JBulb поставляется с трубками с микроколпачками.
Нагревательная пластинаFisherSP88857200
Магнитный стерженьFisher1451352
МикропипеткаSigmaZ683884-1EA
25 мм калибрFisher14-826-49
МикроскальпельRoboz Хирургическиеножницы RS-6270
Fine Science Tools14081-09
ЩипцыWorld Precision Instruments501985
Стерилизатор горячих шариковSigmaZ378550-1EA
СтереоскопNikonSMZ800N
МикрошпательFisherS50821
Крысиный хвост тип I коллагенCorning354236поддерживать на уровне 4 º C и снимать только при необходимости. Используйте лед, чтобы сохранить его температуру во время использования.
Микроцентрифужная пробиркаFisher02-681-256
Гидроксид натрия (NaOH)FisherSS2661
Соляная кислота (HCl)FisherSA48-1
Лакмусовая бумагаFisher09-876-18
Сбалансированный раствор соли Хэнка (HBSS)Инвитроген14170112Хранить при 4 °C.
0,25% Трипсин-ЭДТАИнвитроген25200056хранить при -20 °Ордм; C и тепло при 37 º C перед использованием.
Дезоксирибонуклеаза поджелудочной железы крупного рогатого скота (Dnase) ISigma10104159001хранить при -20 º C и тепло при 37 º C перед использованием.
Модифицированная среда Dulbecco's Eagle (DMEM) с питательной смесью Ham's F-12Gibco11330-032хранить при 4 ºC.
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Atlanta BiologicalsS11195хранить при -20°C.
Послеродовой день 0 или день 1 Крысы Sprague DawleyШтаммCharles River Штамм 001
Нейробазальный эмбриональный нейрон базальная средаInvitrogen21103049Хранить в 4º C и тепло при 37 º C перед использованием.
В-27 безсывороточная добавкаInvitrogen12587010Хранить при -20 º C и тепло при 37 º C перед использованием.
L-глютаминInvitrogen35050061хранить при -20 º C и тепло при 37 º C перед использованием.
G5 астроцитарная добавкаИнвитроген17503012
Спрэг Доули эмбриональный день 18 крысЧарльз РиверШтамм 001
Пастеровская пипеткаФишер22-042816
15 мл центрифужная пробиркаEMESCO1194-352099
VortexFisher02-215-414
ЦентрифугаФишера05-413-115
ГемоцитометрFisher02-671-6
ИнкубаторFisher13 998 076
Формальдегид 40%FisherF77P-4Формальдегид является токсичным соединением, известным как канцероген, и должен быть утилизирован в отдельном контейнере.
Защитная крышка стекла Fisher12-548-5M
Лак для ногтейЭлектронная микроскопия Sciences (EMS)72180
Флюормонт монтажная средаSouthern Biotech0100-01
Поли-L-лизинSigmaP4707
Фосфат буферный физиологический FisherBP3994
Triton X-100SigmaT8787
Нормальная лошадиная сывороткаGibco16050-122
Кролик против глиального кислого фибриллярного белка (GFAP) первичное антителоMilliporeAB5804Хранить при -20°С.
Мышиное первичное антитело к бета-тубулину IIISigmaT8578хранить при -20°С.
Кролик антиколлаген I первичное антителоAbcamab34710хранить при -20°С.
Кролик анти-виментинMilliporeAB3400хранить при -20°С.
Мышиный антинестинMilliporeAB5326хранить при -20°С.
Donkey anti-mouse 568 вторичное антителоInvitrogenA10037хранить при 4ºC.
Donkey anti-rabbit 568 вторичное антителоInvitrogenA10042хранить при 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 вторичное антителоInvitrogenA21206хранить при 4ºC.
Hoechst 33342, ТригидрохлоридИнвитрогенH3570Хранить при 4ºC. Hoechst является известным мутагеном, который следует рассматривать как канцероген. Поэтому его необходимо утилизировать в отдельную емкость.
Кальцеин AMSigmaC13594 мМ в безводном ДМСО
Гомодимер этидия-1Life TechnologiesE11692 мМ в DMSO/H2O 1:4 (v/v)
Диметилсульфоксан (ДМСО)Sigma276855
A1RSI Лазерный сканирующий конфокальный микроскопNikonИспользуется для проведения конфокальных реконструкций иммуномеченых конструкций.
Микроскоп Eclipse Ti-Sот Nikonиспользуется для получения фазово-контрастных изображений. При получении цифровых изображений с помощью фотокамеры QiClick, подключенной к программному обеспечению Nikon Elements Basic Research (4.10.01).
игла

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Horner, P. J., Gage, F. H. Regenerating the damaged central nervous system. Nature. 407 (6807), 963-970 (2000).
  2. Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 7 (8), 617-627 (2006).
  3. Montani, L., Petrinovic, M. M. Targeting Axonal Regeneration: The Growth Cone Takes the Lead. J. Neurosci. 34 (13), 4443-4444 (2014).
  4. Struzyna, L. A., Harris, J. P., Katiyar, K. S., Chen, H. I., Cullen, D. K. Restoring nervous system structure and function using tissue engineered living scaffolds. Neural Regen. Res. 10 (5), 679-685 (2015).
  5. Li, X., Katsanevakis, E., Liu, X., Zhang, N., Wen, X. Engineering neural stem cell fates with hydrogel design for central nervous system regeneration. Prog. Polym. Sci. 37 (8), 1105-1129 (2012).
  6. Lie, D. C., Song, H., Colamarino, S. A., Ming, G., Gage, F. H. Neurogenesis in the Adult Brain: New Strategies for Central Nervous System Diseases. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 44, 399-421 (2004).
  7. Gao, Y., Yang, Z., Li, X. Regeneration strategies after the adult mammalian central nervous system injury-biomaterials. Regen. Biomater. 3 (2), 115-122 (2016).
  8. Huebner, E. A., Strittmatter, S. M. Axon Regeneration in the Peripheral and Central Nervous Systems. Results Probl. Cell Differ. 48, 339-351 (2009).
  9. Benowitz, L. I., Yin, Y. Combinatorial Treatments for Promoting Axon Regeneration in the CNS: Strategies for Overcoming Inhibitory Signals and Activating Neurons’ Intrinsic Growth State. Dev. Neurobiol. 67 (9), 1148-1165 (2007).
  10. Kyungsuk, K., Liu, K., et al. Promoting Axon Regeneration in the Adult CNS by Modulation of the PTEN / mTOR Pathway. Science. 322 (5903), 963-966 (2008).
  11. Khakh, B. S., Sofroniew, M. V. Diversity of astrocyte functions and phenotypes in neural circuits. Nat. Neurosci. 18 (7), 942-952 (2015).
  12. Cregg, J. M., DePaul, M. A., Filous, A. R., Lang, B. T., Tran, A., Silver, J. Functional regeneration beyond the glial scar. Exp. Neurol. 253, 197-207 (2014).
  13. Buffo, A., Rolando, C., Ceruti, S. Astrocytes in the damaged brain: Molecular and cellular insights into their reactive response and healing potential. Biochem. Pharmacol. 79 (2), 77-89 (2010).
  14. Silver, J., Miller, J. H. Regeneration beyond the glial scar. Nat. Rev. Neurosci. 5 (2), 146-156 (2004).
  15. Toy, D., Namgung, U. Role of Glial Cells in Axonal Regeneration. Exp. Neurobiol. 22 (2), 68-76 (2013).
  16. Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).
  17. East, E., de Oliveira, D. B., Golding, J. P., Phillips, J. B. Alignment of astrocytes increases neuronal growth in three-dimensional collagen gels and is maintained following plastic compression to form a spinal cord repair conduit. Tissue Eng. Part A. 16 (10), 3173-3184 (2010).
  18. David, S., Aguayo, A. J. Axonal Elongation into Peripheral Nervous System "Bridges" after Central Nervous System Injury in Adult Rats. Science. 214 (4523), 931-933 (1981).
  19. Benfey, M., Aguayo, A. J. Extensive elongation of axons from rat brain into peripheral nerve grafts. Nature. 296 (11), 150-152 (1982).
  20. Fry, E. J., Chagnon, M. J., López-Vales, R., Tremblay, M. L., David, S. Corticospinal tract regeneration after spinal cord injury in receptor protein tyrosine phosphatase sigma deficient mice. Glia. 58 (4), 423-433 (2010).
  21. Lin, B., Xu, Y., Zhang, B., He, Y., Yan, Y., He, M. -C. MEK inhibition reduces glial scar formation and promotes the recovery of sensorimotor function in rats following spinal cord injury. Exp. Ther. Med. 7 (1), 66-72 (2014).
  22. Bradbury, E. J., Carter, L. M. Manipulating the glial scar: Chondroitinase ABC as a therapy for spinal cord injury. Brain Res. Bull. 84 (4-5), 306-316 (2011).
  23. Vadivelu, S., Stewart, T. J., et al. NG2+ Progenitors Derived From Embryonic Stem Cells Penetrate Glial Scar and Promote Axonal Outgrowth Into White Matter After Spinal Cord Injury. Stem Cells Transl. Med. 4, 401-411 (2015).
  24. Nishimura, Y., Natsume, A., et al. Interferon-beta delivery via human neural stem cell abates glial scar formation in spinal cord injury. Cell Transplant. 22 (12), 2187-2201 (2013).
  25. Guo, Z., Zhang, L., Wu, Z., Chen, Y., Wang, F., Chen, G. In vivo direct reprogramming of reactive glial cells into functional neurons after brain injury and in an Alzheimer's disease model. Cell Stem Cell. 14 (2), 188-202 (2014).
  26. Tam, R. Y., Fuehrmann, T., Mitrousis, N., Shoichet, M. S. Regenerative therapies for central nervous system diseases: a biomaterials approach. Neuropsychopharmacology. 39 (1), 169-188 (2014).
  27. Cullen, D. K., Tang-Schomer, M. D., et al. Microtissue engineered constructs with living axons for targeted nervous system reconstruction. Tissue Eng. Part A. 18 (21-22), 2280-2289 (2012).
  28. Cullen, D. K., Wolf, J. A., Vernekar, V., Vukasinovic, J., LaPlaca, M. C. Neural tissue engineering and biohybridized microsystems for neurobiological investigation in vitro (Part 1). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39 (3), 201-240 (2011).
  29. Irons, H. R., Cullen, D. K., Shapiro, N. P., Lambert, N. A., Lee, R. H., Laplaca, M. C. Three-dimensional neural constructs: a novel platform for neurophysiological investigation. J. Neural Eng. 5 (3), 333-341 (2008).
  30. Morrison, B. I. III, Cullen, D. K., LaPlaca, M. In Vitro Models for Biomechanical Studies of Neural Tissues. Stud. Mechanobiol. Tissue Eng. Biomater. 3, 247-285 (2011).
  31. Vukasinovic, J., Cullen, D. K., Laplaca, M. C., Glezer, A. A microperfused incubator for tissue mimetic 3D cultures. Biomed. Microdevices. 11 (6), 1155-1165 (2009).
  32. Cullen, D. K., Lessing, M. C., Laplaca, M. C. Collagen-dependent neurite outgrowth and response to dynamic deformation in three-dimensional neuronal cultures. Ann. Biomed. Eng. 35 (5), 835-846 (2007).
  33. LaPlaca, M. C., Vernekar, V. N., Shoemaker, J. T., Cullen, D. K. Three-dimensional neuronal cultures. Methods Bioeng. 3D Tissue Eng. , (2010).
  34. Chwalek, K., Tang-Schomer, M. D., Omenetto, F. G., Kaplan, D. L. In vitro bioengineered model of cortical brain tissue. Nat. Protoc. 10 (9), 1362-1373 (2015).
  35. Struzyna, L. A., Katiyar, K., Cullen, D. K. Living scaffolds for neuroregeneration. Curr. Opin. Solid State Mater. Sci. 18 (6), 308-318 (2014).
  36. Stiles, J., Jernigan, T. L. The basics of brain development. Neuropsychol. Rev. 20 (4), 327-348 (2010).
  37. Kaneko, N., Marín, O., et al. New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain. Neuron. 67 (2), 213-223 (2010).
  38. Hidalgo, A., Booth, G. E. Glia dictate pioneer axon trajectories in the Drosophila embryonic CNS. Development. 127 (2), 393-402 (2000).
  39. Chotard, C., Salecker, I. Neurons and glia: Team players in axon guidance. Trends Neurosci. 27 (11), 655-661 (2004).
  40. Wang, C., Liu, F., et al. Identification and characterization of neuroblasts in the subventricular zone and rostral migratory stream of the adult human brain. Cell Res. 21 (11), 1534-1550 (2011).
  41. Peretto, P., Giachino, C., Aimar, P., Fasolo, A., Bonfanti, L. Chain formation and glial tube assembly in the shift from neonatal to adult subventricular zone of the rodent forebrain. J. Comp. Neurol. 487 (4), 407-427 (2005).
  42. Zukor, K. A., Kent, D. T., Odelberg, S. J. Meningeal cells and glia establish a permissive environment for axon regeneration after spinal cord injury in newts. Neural Dev. 6, (2011).
  43. Reier, P. J. Penetration of grafted astrocytic scars by regenerating optic nerve axons in xenopus tadpoles. Brain Res. 164 (1-2), 61-68 (1979).
  44. Lee-Liu, D., Edwards-Faret, G., Tapia, V. S., Larraín, J. Spinal cord regeneration: Lessons for mammals from non-mammalian vertebrates. Genesis. 51 (8), 529-544 (2013).
  45. Goldshmit, Y., Sztal, T. E., Jusuf, P. R., Hall, T. E., Nguyen-Chi, M., Currie, P. D. Fgf-Dependent Glial Cell Bridges Facilitate Spinal Cord Regeneration in Zebrafish. J. Neurosci. 32 (22), 7477-7492 (2012).
  46. Struzyna, L. A., Wolf, J. A., et al. Rebuilding Brain Circuitry with Living Micro-Tissue Engineered Neural Networks. Tissue Eng. Part A. 21 (21-22), 2744-2756 (2015).
  47. Harris, J. P., Struzyna, L. A., Murphy, P. L., Adewole, D. O., Kuo, E., Cullen, D. K. Advanced biomaterial strategies to transplant preformed micro-tissue engineered neural networks into the brain. J. Neural Eng. 13 (1), 16019-16037 (2016).
  48. Huang, J. H., Cullen, D. K., et al. Long-Term Survival and Integration of Transplanted Engineered Nervous Tissue Constructs Promotes Peripheral Nerve Regeneration. Tissue Eng. Part A. 15 (7), 1677-1685 (2009).
  49. Winter, C. C., Katiyar, K. S., et al. Transplantable living scaffolds comprised of micro-tissue engineered aligned astrocyte networks to facilitate central nervous system regeneration. Acta Biomater. 38, 44-58 (2016).
  50. Alexander, J. K., Fuss, B., Colello, R. J. Electric field-induced astrocyte alignment directs neurite outgrowth. Neuron Glia Biol. 2 (2), 93-103 (2006).
  51. Hsiao, T. W., Tresco, P. A., Hlady, V. Astrocytes alignment and reactivity on collagen hydrogels patterned with ECM proteins. Biomaterials. 39, 124-130 (2015).
  52. Alekseeva, T., Katechia, K., Robertson, M., Riehle, M. O., Barnett, S. C. Long-term neurite orientation on astrocyte monolayers aligned by microtopography. Biomaterials. 28 (36), 5498-5508 (2007).
  53. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J. Vis. Exp. (63), (2012).
  54. Conway, A., Schaffer, D. V. Biomaterial microenvironments to support the generation of new neurons in the adult brain. Stem Cells. 32 (510), 1220-1229 (2014).
  55. Barry, D., McDermott, H. Differentiation of radial glia from radial precursor cells and transformation into astrocytes in the developing rat spinal cord. Glia. 50 (3), 187-197 (2005).
  56. Pertusa, M., Garcia-Matas, S., Rodriguez-Farre, E., Sanfeliu, C., Cristofol, R. Astrocytes aged in vitro show a decreased neuroprotective capacity. J. Neurochem. 101 (3), 794-805 (2007).
  57. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -L. Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  58. Balgude, A. P., Yu, X., Szymanski, A., Bellamkonda, R. V. Agarose gel stiffness determines rate of DRG neurite extension in 3D cultures. Biomaterials. 22 (10), 1077-1084 (2001).
  59. Smeal, R. M., Tresco, P. A. The influence of substrate curvature on neurite outgrowth is cell type dependent. Exp. Neurol. 213 (2), 281-292 (2008).
  60. Smeal, R. M., Rabbitt, R., Biran, R., Tresco, P. A. Substrate curvature influences the direction of nerve outgrowth. Ann. Biomed. Eng. 33 (3), 376-382 (2005).
  61. Jain, A., Kim, Y. -T., McKeon, R. J., Bellamkonda, R. V. In situ gelling hydrogels for conformal repair of spinal cord defects, and local delivery of BDNF after spinal cord injury. Biomaterials. 27 (3), 497-504 (2006).
  62. Katiyar, K. S., Winter, C. C., Struzyna, L. A., Harris, J. P., Cullen, D. K. Mechanical elongation of astrocyte processes to create living scaffolds for nervous system regeneration. J. Tissue Eng. Regen. Med. , (2016).
  63. McCarthy, K. D., De Vellis, J. Preparation of Separate Astroglial and Oligodendroglial Cell Cultures from Rat Cerebral Tissue. J. Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
  64. Cullen, D. K., Stabenfeldt, S. E., Simon, C. M., Tate, C. C., LaPlaca, M. C. In Vitro Neural Injury Model for Optimization of Tissue-Engineered Constructs. J. Neurosci. Res. 85, 3642-3651 (2007).
  65. Kim, S. U., Stern, J., Kim, M. W., Pleasure, D. E. Culture of purified rat astrocytes in serum-free medium supplemented with mitogen. Brain Res. 274 (1), 79-86 (1983).
  66. Morrison, R. S., de Vellis, J. Growth of purified astrocytes in a chemically defined medium. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78 (11), 7205-7209 (1981).
  67. Stopak, D., Harris, A. K. Connective tissue morphogenesis by fibroblast traction. I. Tissue culture observations. Dev. Biol. 90 (2), 383-398 (1982).
  68. Hsiao, T. W., Swarup, V. M., Kuberan, B., Tresco, P. A., Hlady, V. Astrocytes specifically remove surface-adsorbed fibrinogen and locally express chondroitin sulfate proteoglycans. Acta Biomater. 9 (7), 7200-7208 (2013).
  69. Phillips, J. B., Bunting, S. C. J., Hall, S. M., Brown, R. A. Neural tissue engineering: a self-organizing collagen guidance conduit. Tissue Eng. 11 (9), 1611-1617 (2005).
  70. Cullen, D. K., Simon, C. M., LaPlaca, M. C. Strain rate-dependent induction of reactive astrogliosis and cell death in three-dimensional neuronal-astrocytic co-cultures. Brain Res. 1158, 103-115 (2007).
  71. Filous, A. R., Miller, J. H., Coulson-Thomas, Y. M., Horn, K. P., Alilain, W. J., Silver, J. Immature astrocytes promote CNS axonal regeneration when combined with chondroitinase ABC. Dev. Neurobiol. 70 (12), 826-841 (2010).
  72. Johansson, S., Strömberg, I. Guidance of dopaminergic neuritic growth by immature astrocytes in organotypic cultures of rat fetal ventral mesencephalon. J. Comp. Neurol. 443 (3), 237-249 (2002).
  73. Jiang, Z., Han, Y., Cao, X. Induced pluripotent stem cell (iPSCs) and their application in immunotherapy. Cell. Mol. Immunol. 11 (1), 17-24 (2014).
  74. Wang, L., Cao, J., et al. Immunogenicity and functional evaluation of iPSC-derived organs for transplantation. Cell Discov. 1, (2015).
  75. Wolmer-Solberg, N., Cederarv, M., Falci, S., Odeberg, J. Human neural stem cells and astrocytes, but not neurons, suppress an allogeneic lymphocyte response. Stem Cell Res. 2 (1), 56-67 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Tissue Engineered ScaffoldsHydrogel Micro columnAstrocyte Self assemblyCollagen CoatingConfocal ImagingGFAP ExpressionNeurite ExtensionCNS RegenerationLiving Scaffolds

Похожие статьи