Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Спасение и характеристика рекомбинантного вируса из нового мира Инфекционный клон вируса Зика

9.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55857

⸱

7 июня 2017 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology, and Pathology, Colorado State University, 2Division of Vector-Borne Diseases, Centers for Disease Control and Prevention

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает восстановление инфекционного вируса Зики из двух плазмидного инфекционного кДНК-клона.

Аннотация

Инфекционные кДНК-клоны позволяют генетически модифицировать вирус, тем самым облегчая работу с вакцинами, патогенезом, репликацией, передачей и развитием вируса. Здесь мы описываем создание инфекционного клона для вируса Зика (ZIKV), который в настоящее время вызывает взрывную вспышку в Северной и Южной Америке. Чтобы предотвратить токсичность бактерий, которые обычно наблюдаются с помощью плазмид, полученных из флавивируса, мы создали двухплазмидную систему, которая разделяет геном у NS1-гена и более стабильна, чем полноразмерные конструкции, которые не могут быть успешно восстановлены без мутаций. После переваривания и лигирования для соединения двух фрагментов полноразмерная вирусная РНК может быть получена транскрипцией in vitro с помощью РНК-полимеразы Т7. После электропорации транскрибируемой РНК в клетки был выделен вирус, который проявлял сходную кинетику роста in vitro и вирулентность и инфекционные фенотипы in vivo у мышей и москитов соответственно.

Введение

Вирус Zika (ZIKV; Family Flaviviridae : Genus Flavivirus ) - это флавивирус вируса комаров, который прибыл в Бразилию в 2013-14 годах и впоследствии был связан с массовой вспышкой фебрильной болезни, которая распространилась по всей Америке 1 . Кроме того, ZIKV был связан с тяжелыми последствиями заболевания, такими как синдром Гийена-Барре у взрослых и микроцефалия у плодов и новорожденных 2 . Мало что известно о ZIKV до его быстрого распространения в западном полушарии. Это включало отсутствие молекулярных инструментов, что препятствовало механистическим исследованиям. Молекулярные инструменты для вирусов, такие как клоны кДНК, способствуют развитию вакцины и антивирусных препаратов, а также позволяют оценить вирусные генетические факторы, связанные с дифференциальным вирусным патогенезом, иммунным ответом и эволюцией вируса.

Известно, что инфекционные клоны флавивируса очень нестабильны у бактерий из-за crВ их геномах присутствуют промотирующие проариотические промоторы 3 . Для облегчения этой проблемы были использованы несколько подходов; Включая введение тандемных повторов перед вирусными последовательностями 4 , мутацию предполагаемых прокариотических промоторных последовательностей 5 , расщепление генома на множественные плазмиды 6 , векторы с небольшим числом копий (включая бактериальные искусственные хромосомы) 7,8 и введение интронов в вирусном геноме 9 , Для ZIKV была описана одна полноразмерная система без модификаций; Однако этот клон, по-видимому, ослабляется в клеточной культуре и у мышей 10 . Другие группы сконструировали интроны в геноме ZIKV, что позволило нарушить неустойчивые последовательности в бактериях, которые могут быть сплавлены в клетках млекопитающих in vitro для производства инфекционного вируса 11, 12 . Кроме того, была успешно использована система на основе ПЦР, озаглавленная «Инфекционно-субгеномные ампликонны», для спасения штампа MR776 прототипа ZIKV 13 . Описанный здесь подход не требует никаких посторонних последовательностей, а скорее разрушает геном в области высокой нестабильности с использованием множества плазмид, которые ранее успешно использовались с желтой лихорадкой 6 , вирусами лихорадки денге 14 , 15 и западного Нила 16 . Кроме того, добавление последовательности рибозима гепатита D на вирусных геномных концах облегчает создание аутентичного 3'-конца без необходимости добавления сайта линеаризации. Кроме того, обе плазмиды сконструированы в низкокопированном числовом векторе (pACYC177, ~ 15 копий на ячейку) для уменьшения любой остаточной токсичности 17 . Выбранный вирус отображает профиль роста, сопоставимый сРодительского вируса в кривых роста in vitro в 8 клеточных линиях, содержащих множество клеточных типов, полученных как от млекопитающих, так и от насекомых, и выявил идентичные патогенные профили у мышей и инфекции, скорости распространения и передачи у комаров 18 .

Здесь подробно описан протокол, описывающий, как выращивать инфекционные клоновые плазмиды, генерировать полноразмерную вирусную РНК (вирусный геном) in vitro и восстанавливать инфекционный вирус в культуре клеток. Во-первых, мы описываем распространение плазмид в бактериях или без бактерий амплификации с использованием усиления кругового круга (RCA). Затем мы покажем, как две плазмиды расщепляются, а затем лигируются вместе для генерации полноразмерного вируса. Наконец, мы описываем производство транскрибируемой РНК и ее последующей электропорации в клетки Vero с последующим титрованием восстановленного вируса ( рис. 1 ). Описанный подход является быстрым, что позволяетR восстановление запасов инфекционных вирусов через 1-2 недели.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Трансформирование и восстановление плазмид инфекционных клонов

  1. Преобразуйте обе плазмиды (отдельно) с использованием коммерческого протокола преобразования ( например , протокола NEB 5 Minute Transformation Protocol) с некоторыми изменениями. Обе плазмиды содержат ген, кодирующий устойчивость к ампициллину, поэтому для отбора используют ампициллин или карбенициллин. Предпочтительным является карбенициллин, поскольку он более стабилен.
    1. Удалите ячейки (см. Таблицу материалов) с морозильной камеры -80 ° C и оттепель на льду в течение 5-10 мин. Предварительно нагретый лизогенный бульон (LB) (содержащий 10 г / л NaCl и 25 мкг / мл карбенициллина, называемый LB-карб), и бульон с подавлением катаболита (SOC (без антибиотиков) - при приближении к клеткам) при 37 ° C.
    2. Добавьте от 100 мкг-10 нг в 1 мкл плазмидной ДНК к пробирке, содержащей 50 мкл компетентных клеток; Осторожно перемешайте трубку.
    3. Инкубируйте пробирки на льду в течение 5 мин.
    4. Трубы с тепловым шоком при 42 ° C в течение 30 сВ водяной бане. Вернитесь на лед в течение 2 минут сразу после теплового шока.
    5. Пипетируют 950 мкл комнатной температуры SOC в каждую пробирку и перемешивают пипетированием. Распределите 100 мкл бактериальной смеси на пластине LB-карбюратора и инкубируйте в течение ночи при 37 ° C (примерно 12-14 часов).
  2. Удалите пластины из инкубатора с температурой 37 ° C после 12-14 ч инкубации. Поместите пластины в темный ящик при комнатной температуре, чтобы колонии продолжали расти (примерно 8-9 часов).
  3. Используя 5 мл Terrific бульона (TB, содержащего 25 мкг / мл карбенициллина, называемого TB-carb), выращивают 5-10 небольших колоний для каждой плазмиды в течение ночи при 30 ° C в бактериальном шейкере (примерно 14-16 часов).
    ПРИМЕЧАНИЕ. Маленькие колонии являются индикатором того, что плазмида не повреждена; Колонии с плазмидами, содержащие делеции, перегруппировки или мутации (здесь называемые событиями нестабильности), будут расти быстрее и, следовательно, быть больше. Поэтому следует попытаться выбрать самые маленькие колонии на тарелке, в частности, нетT выбрать самые большие колонии. Некоторые полноразмерные колонии также могут быть выбраны для полноты. При использовании более низкой температуры вероятность того, что клетки перерастут (OD 600 больше 0,6-0,8). Поскольку большинство исследователей выполняют ночной рост, это позволяет больше контролировать и уменьшать вероятность разрастания.
  4. Проверьте жидкие культуры на мутность (примерно OD 600 0,6-0,8). Поместите любые мутные трубы при температуре 4 ° C и дайте другим трубам стать мутными, увеличиваясь дольше.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Не увеличивайте количество бактерий до значений OD 600 больше, чем рекомендуется, поскольку могут произойти события нестабильности плазмиды.
  5. Экстрагируют плазмидную ДНК из бактерий с помощью коммерческого набора минипрепаратов плазмиды (см. Таблицу материалов). Элюировать в 15 мкл предварительно нагретого (до 70 ° C в нагревательном блоке) элюирующего буфера. Разрешить элюирующий буфер инкубировать на колонке в течение 5 мин перед центрифугированием.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Сохраняйте не менее 1 мл этой стартовой культуры при 4 ° C дляДальнейшее использование на следующем этапе.
  6. Дайджест 10 мкл восстановленных плазмид для оценки того, произошли ли события культивирования плазмиды во время культивирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Дайджест p1 с SalI / NheI и p2 с BamHI / HindIII при 37 ° C в течение 1 часа. Подтвердите наличие правильных полос после пищеварения ( рис. 2a ) с помощью гель-электрофореза и перейдите к шагу 2. При приготовлении плазмидной ДНК путем амплификации скользящего круга (RCA) зарезервируйте некоторый элюат miniprep, чтобы служить в качестве шаблона.

2. Получение достаточной плазмидной ДНК для лигирования

ПРИМЕЧАНИЕ. Лигирование и последующая электропорация требуют достаточного количества ДНК плазмиды, которая должна генерироваться либо с помощью maxiprep, либо с помощью RCA. В то время как maxiprep является традиционно используемым подходом, RCA предлагает преимущество, не требующее бактерий, таким образом устраняя потенциал для индуцированной плазмидой токсичности в бактериях, которая может привести к событиям нестабильности.

  1. Выполните следующую процедуру maxiprep.
    1. Для каждой плазмиды, которая продемонстрировала правильную схему расщепления рестрикционным ферментом в предыдущем разделе, добавьте 500 мкл исходной культуры к 1 л бульона TB-Carb (25 мкг / мл карбенициллина) и встряхните в течение ночи при 30 ° C (примерно 14-16 часов) , Примерно OD 600 0,6-0,8).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Не позволяйте культуре расти над этим значением OD 600 . Это потенциально может привести к событиям нестабильности внутри плазмид.
    2. Убирайте бактерии и выполняйте maxipreps по протоколу производителя (см. Таблицу материалов).
  2. Используя сохраненный miniprep с шага 1.6, выполните следующие действия для процедуры RCA.
    1. Перенесите 1 мкл плазмидной ДНК в пробирку, содержащую 50 мкл буфера для образцов.
    2. Денатурируют образец при 95 ° С в течение 3 мин, а затем инкубируют при 4 ° С до готовности к использованию.
    3. Подготовьте коммерческое усилениеПремикс (см. Таблицу материалов ). Объединить 50 мкл реакционного буфера с 2 мкл ферментной смеси в пробирке, установленной на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Премикс амплификации следует хранить на льду до готовности к использованию. Удобно приготовить основную смесь путем объединения достаточных реагентов для необходимого количества реакций амплификации. Любые неиспользованные премиксы должны быть отброшены.
    4. Перенесите 50 мкл готовой амплификации премикса к денатурированному образцу.
    5. Инкубируйте реакционные трубки при 30 ° C в течение 18 часов.
    6. Инкубируйте пробирки при 65 ° C в течение 10 минут, чтобы инактивировать ДНК-полимеразу ø29.
    7. Хранить реакционные трубки при температуре 4 ° C или -20 ° C до готовности к использованию.
      ПРИМЕЧАНИЕ. В этот момент плазмидную ДНК, полученную с помощью обоих методов, следует количественно оценить (используя абсорбцию при 260 нм), а геном ZIKV должен быть полностью секвенсером, чтобы подтвердить отсутствие событий нестабильности (делеции и перегруппировки) во время подготовки.
Имя праймера Последовательность (5 '- 3')
ZIKV PRVABC59 1For. AGTTGTTGATCTGTGTGAATCAGAC
ZIKV Сохранено 632For. GCCCTATGCTGGATGAGG
ZIKV Сохранено 692Rev. GGTTCCGTACACAACCCAAGTTG
ZIKV Conserved 1313Rev. CTCCCTTTGCCAAAAAGTCCACA
ZIKV Conserved 1201For. CCAACACAAGGTGAAGCCTAC
ZIKV Conserved 1663For. GCAGACACCGGAACTCCACACT
ZIKV Conserved 2008For. CAGATGGCGGTGGACATGC
ЗИКВ Сохранено 2350Рев. GTGAGAACCAGGACATTCCTCC
ZIKV Сохранено 2605For. TACAAGTACCATCCTGACTCCC
ЗИКВ Сохранено 3499Rev. GCCTTATCTCCATTCCATACCA
ZIKV Сохранено 3961Rev. TTGCCAACCAGGCCAAAG
ZIKV Сохранено 4132For. CATTTGTCATGGCCCTGG
ZIKV Завершено 4561Rev. CTATTGGGTTCATGCCACAGAT
ZIKV Сохраняется 4665For. GACCACAGATGGAGTGTACAGAGT
ЗИКВ Сохранено 5189Реев. AAGACAGTTAGCTGCTTCTTCTTCAG
ZIKV Задержанный 5219For. GAGAGTTCTTCCTGAAATAGTCCGTGA
ЗИКВ Сохранено 6086Реев. CTTGCTTCAAGCCAGTGTGC
ZIKV Conserved 6119For. GCCTCATAGCCTCGCTCTATCG
ZIKV Conserved 6721Rev. CCATTCCAAAGCCCATCTTCCC
ZIKV Сохранено 6769For. CCAGCCAGAATTGCATGTGTCC
ZIKV Conserved 7209Rev. ATCATTAGCAGCGGGACTCCAA
ZIKV Сохранено 7343For. GTTGTGGATGGAATAGTGGT
ZIKV Conserved 8243For. TGCCCATACACCAGCACTATGA
ZIKV PRVABC59 8893Rev. TGCATTGCTACGAACCTTGTTG
ZIKV сохранен 9133For. AGCCCTTGGATTCTTGAACGAGGA
ZIKV PRVABC59 9673Rev. AACGCAATCATCTCCACTGACT
ZIKV Сохранено 9686For. GATGATAGGTTTGCACATGCC
ZIKV Conserved 10321Rev. GTCCATGTACTTTTCTTCATCACCTAT
ZIKV Conserved 10455For. CAGGAGAAGCTGGGAAACC
ZIKV Сохранено 10621Rev. CAGATTGAAGGGTGGGGAAGGTC

Таблица 1: Грунты для секвенирования клонов кДНК. Плазмиды можно полностью секвенировать с перечисленными праймерами. Грунты, обозначенные как «консервативные» индиЧто они, вероятно, способны последовательно / амплифицировать все генотипы ZIKV. Грунты, обозначенные как «PRVABC59», специфичны для этого штамма, но могут также работать для других штаммов генотипа Азии и, возможно, других генотипов.

3. Получение транскрибируемой РНК in vitro

  1. Настройте реакцию пищеварения либо с помощью препарата максипрепа, либо с помощью RCA.
    1. Для расщепления p1 смешать 10 мкл 10-кратного реакционного буфера, 3 мкл ApaLI, 3 мкл BamHI-HF, 3 мкл rSAP или CIP и 3,3 мкг ДНК p1. Добавьте ddH 2 O до 100 мкл.
    2. Для переваривания p2 смешать 10 мкл 10-кратного реакционного буфера, 3 мкл ApaLI, 3 мкл EcoRI-HF и 13,3 мкг ДНК p2. Добавьте ddH 2 O до 100 мкл.
    3. Инкубируйте при 37 ° C в течение 1-2 часов.
    4. Очистите, используя коммерческий гель и набор для очистки ПЦР (см. Таблицу материалов). Элюат в 30 мкл буфера для элюирования, предварительно нагретого до 70 ° C в нагревательном блоке (инкубируйтеКолонку в течение 5 мин перед вращением).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Храните 1 мкл для последующего использования на геле.
  2. Подготовьте реакцию лигирования.
    1. Объединить 10 мкл 10x T4-ДНК-лигирующего реакционного буфера, 3 мкл ДНК-лигазы T4 (400 U / мкл), 29 мкл очищенного p1 и 29 мкл очищенного p2. Добавьте ddH 2 O до 100 мкл.
    2. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 2 ч или 16 ° С в течение ночи.
    3. Очистите, используя коммерческий гель и набор для очистки ПЦР (см. Таблицу материалов). Элюировать в 10 мкл буфера для элюирования, предварительно нагретого до 70 ° C в нагревательном блоке (инкубируйте колонку в течение 5 минут перед вращением).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Храните 1 мкл для последующего использования на геле.
  3. Проводят непереваренные плазмиды, расщепленные плазмиды и лигирование на агарозном геле. Продукт лигирования должен иметь более высокую молекулярную массу (около 11 т.п.н.), чем сама переваренная плазмида, что указывает на успешность лигирования ( рисунок 2b ).
  4. Настроить реакцию транскрипции in vitro T7.
    1. Объединить 10 мкл 2x ARCA / NTP Mix, 2 мкл смеси РНК-полимеразы T7 и 8 мкл очищенной реакции лигирования для конечного объема 20 мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ. ARCA, входящая в состав смеси, представляет собой аналог крышки, который включен исключительно в правильную ориентацию. Стандартные колпачные аналоги могут привести только к ~ 50% транскриптов, имеющих колпачок в правильной ориентации.
    2. Инкубируйте в течение 4 часов при 37 ° C.
    3. Измерьте концентрацию РНК через УФ-спектрофотометр. По желанию, запустите денатурирующий агарозный гель, чтобы подтвердить длину транскрипта РНК.

4. Спасение инфекционного вируса электропорацией

  1. Дней до электропорации, готовят 1 колбу T182 клеток Vero (между T150 и T182 приемлемо, выращивают в DMEM + 10% фетальной бычьей сыворотке (FBS)) на каждую подлежащую восстановлению конструкцию. Включите 1 T182 в качестве контроля над трансфекцией. CeLls следует использовать при слиянии 70-80%.
  2. Когда клетки готовы, поместите 12 мл / реакцию DMEM + 15% FBS + 10 мМ HEPES на водяной бане, нагретой до 37 ° C.
  3. Отсоединяйте клетки путем трипсинизации со стандартным протоколом и восстанавливайте клетки в средах с 10% FBS для инактивации трипсина; Центрифужных клеток при 150 × g в течение 5 мин при 4 ° С.
  4. Промывают клетки в 1х фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS), гранулируют клетки при 150 × g в течение 5 мин при 4 ° C. Повторите этот шаг дважды, в общей сложности три промывки.
  5. Ресуспендируют клетки в 200 мкл RPMI 1640 + 10 мМ HEPES (стерильные) на 1 образец. Передайте 200 мкл клеточной суспензии в стерильную пробирку. Клетки должны составлять ~ 0,5 × 10 7 клеток / мл.
  6. Добавьте 20 мкл воды (mock neg. Control) или 20 мкл РНК (предпочтительно 5-10 мкг), полученных на этапе 3.4, в каждый набор клеток. Смешайте осторожно, щелкнув трубку и перенесите содержимое трубки в кювету для электропорации с зазором 2 мм.
  7. Установите электр.Oporator до 170 V LV, омега (сопротивление) при 0 и 950 мкФ (примерно до 625 В / см и постоянная времени 20 мс для других машин). Установите сопротивление на самую низкую доступную настройку, либо 0, либо ∞, если она доступна.
  8. Импульс один раз и сразу добавляют 600 мкл DMEM + 15% FBS + 10 мМ HEPES, который нагревается на шаге 4.2. Тщательно промойте внутри кюветы, чтобы удалить все клетки. Добавить клетки в колбу для тканевой культуры T75, содержащую 10 мл предварительно нагретой среды. Удалите дополнительный носитель из кюветы с помощью капельницы, которая входит в кювету. Будьте осторожны, чтобы поддерживать бесплодие.
  9. Вихревую колбу для смешивания среды и клеток и помещения в инкубатор 37 ° C.
  10. Проверьте на следующий день жизнеспособность клеток и делайте это каждый день до тех пор, пока не будет наблюдаться клеточная смерть 50-75%. Смертность клеток наблюдается по сравнению с макетным электропористым контролем.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Цитопатический эффект ZIKV (CPE) довольно выражен в клетках Vero, что приводит к округлению клеток, которые отделяются и плавают в культуральной среде. У нас естьНаблюдал диапазон 8-10 дней как идеальный для сбора урожая.
  11. Убирают супернатант в конической трубке и центрифугируют для удаления клеточного мусора при> 3000 мкг в течение 10 мин при 4 ° С.
  12. Удалите осветленный супернатант в новую пробирку и добавьте конечную концентрацию 20% FBS (из 100% запаса). Кроме того, добавьте стерильный HEPES при конечной концентрации 10 мМ в качестве буферного агента для сохранения вирусной инфекционности при замораживании (из 1 М стерильного фонда).
  13. Смешать вирус путем встряхивания и аликвоты в флаконы с крышкой. Хранить при температуре -80 ° C для дальнейшего использования.

5. Титрование восстановленного вируса

  1. Выделите соответствующее количество 6- или 12-луночных планшетов клеток Vero за день до титрования.
  2. Удалите вирус из морозильника и сделайте серийные 10-кратные разведения в DMEM + 2% FBS в пробирках или 96-луночных планшетах.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Ожидаемый титр из восстановленных клонов составляет от 1 × 10 6 до 5 × 10 7 ПФУ / мл.
  3. Добавить 200 oR 400 мкл каждого разведения в дубликате до лунки 12- или 6-луночного планшета, соответственно.
  4. Поместите пластины в 37 ° C инкубатор и скалу каждые 15 минут, в течение всего 1-1,5 часа адсорбции.
  5. Удалите вирусный инокулят и добавьте 1 мл (12-луночных) или 2 мл (6-луночный) DMEM-трагакантовая накладка в каждую лунку.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Здесь можно использовать агарозу, агар, метилцеллюлозу или другие оверлейные среды.
  6. Инкубируйте клетки в инкубаторе 37 ° C в течение 5 дней. Время для правильного формирования бляшек будет зависеть от используемого наложения.
  7. Чтобы исправить клетки, удалите пластины из инкубатора и осторожно наложите на дезинфицирующее средство.
  8. Добавьте достаточное количество 20% этанола / 0,1% кристаллического фиолетового (CV) в каждую лунку для покрытия и завихрения для смешивания.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Многие другие фиксаторы существуют и могут быть использованы здесь. Кроме того, при использовании наложения агарозы или агара можно использовать второй наложение в сочетании с нейтральным красным для визуализации бляшек без фиксации. Показано, что 20% этанолаЭффективные при инактивации окутанных вирусов в предыдущих исследованиях; Не используйте эту сумму для незараженных вирусов, так как они не будут инактивированы 19 .
  9. Инкубируйте планшеты в течение 30-60 мин при комнатной температуре (в шкафу биобезопасности класса II); Отказаться от CV (в соответствии с местными правилами) и вымыть плиты водопроводной водой.
  10. Позвольте плитам высохнуть и вручную посчитайте бляшки.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Ссылка 20 может использоваться в качестве дополнительной справки для проведения анализов на бляшек.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Протокол, описанный здесь, позволяет восстанавливать вирус Zika, зараженный вирусом. Манипулирование системой двух плазмид-инфекционных клонов является простым, когда выполняется с осторожностью, по сравнению с полноразмерными версиями, которые очень нестабильны (данные не показаны). После переваривания и лигирования двух разных кусочков укороченная РНК продуцируется с использованием in vitro транскрипции с полимеразой Т7, которая затем электропорируется в клетки Vero (

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В данной работе мы описываем метод восстановления двусторонней инфекционной системы клонирования кДНК для вируса ZIKV. Ранее описанные клоны ZIKV страдают либо от ослабления, либо требуют добавления интронов, что делает плазмиды больше и препятствует спасению в клетках насекомых. Инфекционный вирус может быть восстановлен с помощью системы двухплазмидных клонов в клетках млекопитающих или насекомых (данные не показаны). Кроме того, вирус, выделенный из этой системы, ведет себя аналогично вирусу дикого типа в нескольких к...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Кристен Буллард-Фейбельман, Милену Веселинович и Клаудию Рюкерт за помощь в описании вируса, полученного клонированием. Эта работа была частично поддержана грантами Национального института аллергии и инфекционных болезней NIH по грантам AI114675 (BJG) и AI067380 (GDE).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
NEB Stable CompetentE. coliNew England BioLabsC3040H
Карбенициллин, динатриевая сольразличные
Zyppy Plasmid Miniprep KitZymo ResearchD4036
ZymoPURE Plasmid Maxiprep KitZymo ResearchD4202
SalI-HFNew England BioLabsR3138S20 000 единиц/мл
NheI-HFNew England BioLabsR3131S20 000 шт./мл
ApaLINew England BioLabsR0507S10 000 шт./мл
EcoRI-HFNew England BioLabsR3101S20 000 шт./мл
BamHI-HFNew England BioLabsR3136S20 000 шт./мл
HindIII-HFNew England BioLabsR3104S20 000 шт./мл
illustra TempliPhi 100 Amplification KitGE Healthcare Life Sciences25640010
NucleoSpin Gel and PCR Clean-upMacherey-Nagel740609.5
Щелочная фосфатаза креветок (rSAP)New England BioLabsM0371S1 000 единиц/мл
щелочной фосфатазы, теленковый кишечник (CIP)New England BioLabsM0290S10 000 единиц/мл
T4 ДНК LigaseNew England BioLabsM0202S400 000 единиц/мл
HiScribe T7 ARCA mRNA KitNew England BioLabsE2065S
Vero cellsATCCCCL-81
ECM 630 High Throughput Electroporation SystemBTX45-0423Другие машины приемлемы.
LB Бульон с агаром (Miller)SigmaL3147Можно приготовить и домашним.
Потрясающий бульон SigmaT0918можно приготовить и в домашних условиях.
Чашка ПетриCelltreat229693
пробирки для культурVWR International60818-576
T75 колбыCelltreat229340
T182 колбыCelltreat229350
1x PBSCorning21-040-CV
RPMI 1640 с L-глутаминомCorning10-040-CV
DMEM с L-глютамином и 4,5 г/л глюкозыCorning10-017-CV
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS)Atlas BiologicalsFP-0500-A
ТрагакантПорошок MPBio MP 104792
кристаллической фиалкойAmresco0528-1006
Этанол денатурированныйVWR InternationalBDH1156-1LP
6-луночный планшетCelltreat229106
12 луночных планшетовCelltreat229111
секвенирования OligosIDTсм. таблицу 1
Qubit 3.0ThermoFisherQubit 3.0методы приемлемы.
Допустимы Qubit dsDNA BR Assay KitThermoFisherQ32850другие методы.
Допустимы Qubit RNA HS Assay KitThermoFisherQ32852другие методы.
Класс II Шкаф биобезопасностиВарьируетсяН/ДЭто необходимо для работы с живым вирусом.
другие , ,

Ссылки

  1. Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. S., Dye, C. Zika: the origin and spread of a mosquito-borne virus. Bull World Health Organ. 94 (9), 675C-686C (2016).
  2. Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome--case report, French Polynesia, December 2013. Euro Surveill. 19 (9), (2014).
  3. Li, D., Aaskov, J., Lott, W. B. Identification of a cryptic prokaryotic promoter within the cDNA encoding the 5' end of dengue virus RNA genome. PLoS One. 6 (3), e18197(2011).
  4. Pu, S. Y., et al. A novel approach to propagate flavivirus infectious cDNA clones in bacteria by introducing tandem repeat sequences upstream of virus genome. J Gen Virol. 95 (Pt 7), 1493-1503 (2014).
  5. Pu, S. Y., et al. Successful propagation of flavivirus infectious cDNAs by a novel method to reduce the cryptic bacterial promoter activity of virus genomes. J Virol. 85 (6), 2927-2941 (2011).
  6. Rice, C. M., Grakoui, A., Galler, R., Chambers, T. J. Transcription of infectious yellow fever RNA from full-length cDNA templates produced by in vitro ligation. New Biol. 1 (3), 285-296 (1989).
  7. Yun, S. I., Kim, S. Y., Rice, C. M., Lee, Y. M. Development and application of a reverse genetics system for Japanese encephalitis virus. J Virol. 77 (11), 6450-6465 (2003).
  8. Gualano, R. C., Pryor, M. J., Cauchi, M. R., Wright, P. J., Davidson, A. D. Identification of a major determinant of mouse neurovirulence of dengue virus type 2 using stably cloned genomic-length cDNA. J Gen Virol. 79 (Pt 3), 437-446 (1998).
  9. Johansen, I. E. Intron insertion facilitates amplification of cloned virus cDNA in Escherichia coli while biological activity is reestablished after transcription in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (22), 12400-12405 (1996).
  10. Shan, C., et al. An Infectious cDNA Clone of Zika Virus to Study Viral Virulence, Mosquito Transmission, and Antiviral Inhibitors. Cell Host Microbe. 19 (6), 891-900 (2016).
  11. Schwarz, M. C., et al. Rescue of the 1947 Zika Virus Prototype Strain with a Cytomegalovirus Promoter-Driven cDNA Clone. mSphere. 1 (5), (2016).
  12. Tsetsarkin, K. A., et al. A Full-Length Infectious cDNA Clone of Zika Virus from the 2015 Epidemic in Brazil as a Genetic Platform for Studies of Virus-Host Interactions and Vaccine Development. MBio. 7 (4), (2016).
  13. Gadea, G., et al. A robust method for the rapid generation of recombinant Zika virus expressing the GFP reporter gene. Virology. 497, 157-162 (2016).
  14. Kapoor, M., Zhang, L., Mohan, P. M., Padmanabhan, R. Synthesis and characterization of an infectious dengue virus type-2 RNA genome (New Guinea C strain). Gene. 162 (2), 175-180 (1995).
  15. Messer, W. B., et al. Development and characterization of a reverse genetic system for studying dengue virus serotype 3 strain variation and neutralization. PLoS Negl Trop Dis. 6 (2), e1486(2012).
  16. Kinney, R. M., et al. Avian virulence and thermostable replication of the North American strain of West Nile virus. J Gen Virol. 87 (Pt 12), 3611-3622 (2006).
  17. Chang, A. C., Cohen, S. N. Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the P15A cryptic miniplasmid. J Bacteriol. 134 (3), 1141-1156 (1978).
  18. Weger-Lucarelli, J., et al. Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone. J Virol. 91 (1), (2017).
  19. Roberts, P. L., Lloyd, D. Virus inactivation by protein denaturants used in affinity chromatography. Biologicals. 35 (4), 343-347 (2007).
  20. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. J Vis Exp. (93), e52065(2014).
  21. Weger-Lucarelli, J., et al. Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone. J Virol. , (2016).
  22. Grubaugh, N. D., et al. Genetic Drift during Systemic Arbovirus Infection of Mosquito Vectors Leads to Decreased Relative Fitness during Host Switching. Cell Host Microbe. 19 (4), 481-492 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Vero
Спасение и характеристика рекомбинантного вируса из нового мира Инфекционный клон вируса Зика
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.