Method Article

Новые методы изучения кодирования вкуса

DOI:

10.3791/55868

⸱

June 29th, 2017

 ,  ,  , 
1National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institutes of Health (NIH), 2Max Planck Institute for Brain Research

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем три новых метода изучения вкусового кодирования . Используя простое животное, моль Manduca sexta ( Manduca ) , мы описываем протокол вскрытия, использование внеклеточных тетродов для регистрации активности множественных вкусовых рецепторных нейронов и систему для доставки и мониторинга точно синхронизированных импульсов тантанов.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чувство вкуса позволяет животным обнаруживать химические вещества в окружающей среде, вызывая поведение, критичное для выживания. Когда Hustator Receptor Neurons (GRNs) обнаруживают дегустационные молекулы, они кодируют информацию об идентичности и концентрации вкуса как модели электрической активности, которые затем распространяются на последующие нейроны в головном мозге. Эти шаблоны представляют собой внутренние представления вкуса, которые затем позволяют животному выбирать действия и формировать воспоминания. Использование относительно простых моделей животных было мощным инструментом для изучения основных принципов сенсорного кодирования. Здесь мы предлагаем три новых метода изучения вкусового кодирования с использованием моли Manduca sexta . Во-первых, мы представляем процедуру вскрытия для выявления верхнечелюстных нервов и субэзофагеальной зоны (ОЭЗ), что позволяет регистрировать активность GRN из их аксонов. Во-вторых, мы описываем использование внеклеточных электродов для регистрации активности нескольких GRN путем размещения teТроевые провода непосредственно в верхнечелюстной нерв. В-третьих, мы представляем новую систему доставки и мониторинга с высокой временной точностью, импульсами разных вкусов. Эти методы позволяют характеризовать ответы нейронов in vivo непосредственно из GRN до, во время и после доставки тантанов. Мы приводим примеры следов напряжения, записанных из нескольких GRN, и представляем пример того, как метод сортировки шипов может быть применен к данным для идентификации ответов отдельных нейронов. Наконец, чтобы подтвердить наш подход к записи, мы сравниваем внеклеточные записи, полученные из GRN с тетродами, с внутриклеточными записями, полученными с острыми стеклянными электродами.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Потребительские и обонятельные системы генерируют внутренние представления о химических веществах в окружающей среде, что приводит к восприятию вкусов и запахов, соответственно. Эти химические чувства необходимы для выявления многочисленных поведений, важных для выживания организма, от поиска помощников и приема пищи, чтобы избежать хищников и токсинов. Процесс начинается, когда экологические химические вещества взаимодействуют с рецепторами, расположенными в плазматических мембранах сенсорных рецепторных клеток; Эти клетки, непосредственно или через взаимодействия с нейронами, трансформируют информацию об идентичности и концентрации химических веществ в электрические сигналы. Эти сигналы затем передаются нейронам более высокого порядка и другим структурам мозга. По мере продвижения этих шагов исходный сигнал всегда претерпевает изменения, которые способствуют способности организма обнаруживать, различать, классифицировать, сравнивать и хранить сенсорную информацию и выбирать подходящее действие. Понимание того, как бюстгальтерВ трансформирует информацию об экологических химических веществах, чтобы наилучшим образом выполнять множество задач, является основным вопросом в нейронауке.

Было высказано мнение, что кодирование вкуса является относительно простым: широко распространенное мнение гласит, что каждая химическая молекула, которая вызывает вкус («вкус»), естественно, относится к одному из примерно пяти основных свойств вкуса ( то есть сладкого, горького, кислого , Соленые и умами) 1 . В этом представлении «основного вкуса» задача вкусовой системы состоит в том, чтобы определить, какой из этих основных вкусов присутствует. Кроме того, неврологические механизмы, лежащие в основе представления основного вкуса в нервной системе, неясны и считаются управляемыми либо «помеченной линией» 2 , 3 , 4 , 5 , 6, либо «поперечным рисунком» 7 , 8 . В маркированном штриховом коде каждая сенсорная клетка и каждый ее нейронный последователь реагируют на одно качество вкуса, вместе образуя прямой и независимый канал для более высоких центров обработки в центральной нервной системе, посвященных этому вкусу. Напротив, в кодовом шаблоне с волокнами каждая сенсорная клетка может реагировать на многочисленные вкусовые качества, так что информация о вкусе представлена ​​общей реакцией населения сенсорных нейронов. Является ли вкусовая информация представленными основными вкусами, через маркированные строки или каким-либо другим механизмом, неясна и находится в центре внимания недавних исследований 3 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . Наша собственная недавняя работа предполагает, что система вкуса использует пространственно-временный демографический код для генерацииПредставления индивидуальных вкусов, а не основные категории вкуса. 10 .

Здесь мы предлагаем 3 новых инструмента для помощи в изучении вкусового кодирования. Во-первых, мы предлагаем использование hawkmoth Manduca sexta в качестве относительно простого модельного организма, поддающегося электрофизиологическому исследованию вкуса и описывающего процедуру вскрытия. Во-вторых, мы предлагаем использовать внеклеточные «тетроды» для регистрации активности отдельных GRN. И в-третьих, мы предлагаем новое устройство для доставки и мониторинга точно рассчитанных импульсов вкуса животного. Эти инструменты были адаптированы из методов, которые наша лаборатория и другие использовали для изучения обонятельной системы.

Насекомые, такие как фруктовая муха Drosophila melanogaster , саранча Schistocerca americana , а также моль Manduca sexta, на протяжении десятилетий предоставляли мощные ресурсы для понимания основных принципов о nerVous, включая сенсорное кодирование ( например, обоняние 13 ). У млекопитающих вкусовые рецепторы являются специализированными клетками, которые общаются с нейронами через сложные пути второго мессенджера 1 , 14 . Это проще у насекомых: их рецепторы вкуса - нейроны. Кроме того, пути восприятия млекопитающих вблизи периферии являются относительно сложными, с множеством параллельных нейронных путей, а важные компоненты затрудняют доступ, которые содержатся в небольших костных структурах 15 . По-видимому, тропы наследования насекомых проще. У насекомых GRN содержатся в специализированных структурах, известных как сенсилла, расположенных в антенне, ролях, крыльях и ногах 16 , 17 . GRN непосредственно проектируются в субэзофагеальную зону (ОЭЗ), структуру, роль которой, как считается, в основном является вкусовой 17 , и которая содержит второй порядокВкусовые нейроны 10 . Оттуда информация перемещается в тело, чтобы управлять рефлексами, и к более высоким зонам головного мозга, которые должны быть интегрированы, сохранены и, в конечном счете, способствовать поведенческим выборам 16 .

Необходимо охарактеризовать реакции периферического вкуса, чтобы понять, как информация о вкусе распространяется и трансформируется из одной точки в другую во всей нервной системе. Наиболее часто используемый метод непосредственного контроля за нейронной активностью GRN у насекомых является методикой регистрации наконечника 12 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 . Это связано с размещением электрода непосредственно на сенсиллу, многие из которых относительно легко доступны. Дегустатор входит в электрод, позволяя активировать и использоватьRacellularly измерять нейронные ответы GRNs в сенсиллу. Но поскольку дегустатор содержится в электроде, невозможно измерить активность GRN до того, как тантант будет доставлен или после его удаления, или для обмена вкусовыми добавками без замены электрода 20 . Другой способ, метод записи «боковой стены», также использовался для регистрации активности GRN. Здесь регистрирующий электрод вставляется в основание вкусовой чувствительности 24 , а тантаны доставляются через отдельный стеклянный капилляр на кончике сенсиллу. Оба метода ограничивают запись с GRN на конкретный сенсилл. Здесь мы предлагаем новую методику: запись из случайно выбранных аксонов GRN из разных сенсилл, в то время как отдельно доставляем последовательности хорьков на хоботок. Записи Axon достигаются путем помещения либо острых стеклянных электродов, либо внеклеточных электродных пучков (тетродов) в нерв, который переносит аксоны изGRN в хоботке в ОЭЗ 10 . В Мандуке эти аксоны проходят через верхнечелюстной нерв, который, как известно, является чисто афферентным, что позволяет однозначно регистрировать сенсорные ответы 25 . Этот метод записи из аксонов позволяет более чем на два часа стабильно измерять ответы GRN до, во время и после серии дегустационных презентаций.

Здесь мы описываем процедуру вскрытия для обнажения верхнечелюстных нервов вместе с ОЭЗ, что позволяет одновременно регистрировать ответы нескольких GRN и нейронов в ОЭЗ 10 . Мы также описываем использование внеклеточных записей GRN с использованием специально изготовленного 4-канального тетированного проволочного тетрода, который в сочетании с методом сортировки шипов позволяет проводить анализ нескольких (в наших руках, до шести) GRN одновременно. Мы также сравниваем записи, сделанные с тетродами, с записями, сделанными с резким внутриклеточнымэлектроды. Наконец, мы описываем новый аппарат для подачи вкусных стимулов. Адаптированный из оборудования, давно используемого многими исследователями для доставки одорантов в исследованиях обоняния, наш новый аппарат предлагает преимущества для изучения процесса похудения: улучшая предыдущую многоканальную систему доставки, такую ​​как разработанные Штюрков и его коллегами (см. Ссылки 26 , 27 ), наш аппарат достигает точных Контролировать время доставки по вкусу, обеспечивая при этом считывание напряжения этого времени; И он обеспечивает быструю, последовательную доставку нескольких стимулов вкуса 10 . Аппарат купает хоботок в постоянном потоке чистой воды, в который можно доставлять контролируемые импульсы вкуса. Каждый тонкий импульс проходит через хоботок и затем смывается. Tastants содержат небольшое количество безвкусной пищевой краситель, позволяя цветному датчику контролировать, с точным временем, прохождение дегустацииХоботок.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Осторожно: мелкие порошкообразные чешуи, выпущенные Manduca, могут быть аллергенными, поэтому рекомендуется использовать лабораторные защитные перчатки и маску для лица.

1. Рассечение манкуки секста для выявления верхнечелюстных нервов и ОЭЗ

  1. Выберите подходящую моль любого пола по следующим признакам: через три дня после эклоги с общим здоровым внешним видом (крылья должны быть полностью расширены, а хоботок и усики должны быть неповрежденными).
    1. Поместите моль отдельно в пластиковую чашку для транспортировки.
  2. Вставьте моль в полипропиленовую трубку.
    Внимание: Мы рекомендуем выполнить этот шаг в вытяжном шкафу, чтобы предотвратить распространение порошкообразных чешуек мотыльки.
    1. Трубка должна быть немного длиннее, чем тело моли ( рис. 1А ). Труба может быть изготовлена ​​путем разрезания 15 мл полипропиленовой трубки.
    2. Надавите моли, пока голова не будет открыта, и вставьте плотно закрытую бумагу в другой конец трубки, чтобы сохранить неподвижную моль ( рисунок 1A ).
  • Удалите волосы с обнаженной головы мотыльки (вентральной и спинной), продувая на нее нагнетаемый воздух.
    1. Воздушную струю можно сделать, соединяя шприц (1 мл с иглой, ID около 1,4 мм с удаленным острым наконечником) к источнику воздуха под давлением.
      Примечание. После удаления волос все последующие шаги могут выполняться за пределами вытяжного шкафа.
  • Когда большая часть волос удалена, поместите трубку в удерживающую камеру с дорзальной частью головы вверх, как показано на рисунке 1B .
    1. На чашке Петри используйте модельную глину, чтобы построить треугольную основу длиной около 7 см, высотой 2,5 см ( рис. 1В ).


    • Рисунок 1 : Подготовка камеры вскрытия для мандуки . ( A ) Моль удерживается в трубке. Голова экспонируется на одном конце, а на другом конце - плотная бумага. ( B ) показана камера для вскрытия из чашки Петри и моделирующей глины. Спинная часть головы направлена ​​вверх. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
    1. Защитите антенны и хоботок.
      1. Подготовьте 3 маленьких трубки путем разрезания наконечника пипетки (желтые насадки, 1-200 мкл) с лезвием бритвы на 3 части длиной около 0,5 см. Внутренний диаметр должен быть достаточно большим, чтобы антенна и хоботок могли плотно прилегать.
      2. Подготовьте крючокИзгиб проволоки (22 AWG, длиной около 7 см). Продлите хоботок мотыльки, а затем вставьте его в одну из маленьких трубок, потянув ее проволочным крюком, пока трубка не достигнет проксимальной части хоботка.
      3. Закрепите маленькую трубку твердым батик-воском (используя, например, зубной электрический воск, чтобы расплавить и направить воск) на дорсальную часть головной капсулы моли ( рис. 2А слева).
      4. Поместите каждую антенну в трубку и закрепите трубки батиковым воском, как показано на рисунке 2A (слева). Будьте осторожны, чтобы не повредить антенны горячим воском.
    2. Стабилизируйте мозг против движения, отрезая мышцы, которые покрывают переднюю поверхность мозга ( т.е. мышцу трансбуккального компрессора).
      1. Под рассекающим микроскопом используйте ножницы для микроотсечения или мини-топор, изготовленный из чипа бритвы, приклеенного к зубочистке, чтобы открыть головную капсулу макомС небольшим разрезом чуть ниже хоботка ( рис. 2А , левая верхняя вставка).
      2. Используйте ножницы микроотсекции для срезания щечной мышцы компрессора (иллюстрации см. В ссылке 25 ). Поскольку мышцы не так легко видны, рекомендуется провести следующий поведенческий тест, чтобы подтвердить, что он был разрезан.
      3. Разбавьте сахарозу в дистиллированной воде для достижения 1 М раствора.
      4. Используйте пипетку для доставки около 200 мкл раствора сахарозы к дистальному 2/3 хоботка и наблюдайте хоботок в течение 5 мин. Если мышца была правильно отрезана, насекомое не должно было бы растягивать или перемещать хоботок.
      5. Нанесите слой расплавленного батика, чтобы запечатать отверстие в головной капсуле.
    3. Переверните насекомое, чтобы вентральная сторона головной капсулы теперь была направлена ​​вверх.
    4. Чтобы перфузировать физиологический раствор во время и после процедуры вскрытия, создайте восковую чашку вокруг вентральной стороны головыG электрический воск: под микроскопом рассечения, начните строить чашку, применяя первый ряд воска вдоль передней части головы, двигаясь к спине. Держите хоботок и антенны внутри чашки ( рис. 2А справа).
      1. Продолжайте строить чашку наружу и вверх, пока она не достигнет уровня глаз.
    5. Используйте щипцы, чтобы взять один из двух губных щупиков, затем поместите его на бок и закрепите его в чашку с воском, добавив больше расплавленного воска. Сделайте то же самое с другим верхнечелюстным пальцем ( рис. 2А справа).
    6. Запечатайте любые отверстия в чаше и трубах для воска.
      Примечание: на этом этапе используется эпоксидная смола, потому что она помогает легко запечатывать зазоры в воске и трубах и позволяет избежать любых связанных с нагревом повреждений антенн и хобота.
      1. Используйте зубочистку для смешивания бинарной эпоксидной смолы в пластиковой смесительной чашке. Сохраните смесь.
      2. Используйте зубочистку для нанесения тонкойСлой эпоксидной смолы снаружи и внутри чашки ( фиг. 2В ).
      3. Заполните пустое пространство в пробирках, которые содержат хоботок и антенны с эпоксидной смолой, и заполните часть полипропиленовой трубки, окружающей шею, достаточным количеством эпоксидной смолы, чтобы удерживать ее на месте ( рисунок 2B ).
      4. Оставьте эпоксидную смолу сушить в течение приблизительно 20 мин. Чтобы проверить это, проверьте оставшуюся эпоксидную смолу в пластиковой смесительной чашке, чтобы убедиться, что она твердая и не липкая.
      5. Заполните чашку для воска физиологическим раствором Manduca 28 и подождите пару минут, чтобы убедиться, что утечек нет. Если имеется утечка, попробуйте запечатать ее, нанеся больше горячего воска и / или эпоксидной смолы.

    figure-protocol-1
    Рисунок 2 : Подготовка мандуки </ Em> для рассечения. ( A ) Антенны и хоботок защищены внутри небольших трубок, изготовленных из наконечников пипеток, разрезанных на три части длиной около 0,5 см. (Левая панель, большое изображение) Трубки закреплены расплавленным батик-воском, наносимым вокруг дорзальной части головы. (Левая панель, вставка) Чтобы удалить мышцу щечной компрессии, дорзальную сторону головки капсулы открывают, делая небольшой разрез, как показано пунктирной линией на большом изображении. (Правая панель) Восковая чашка построена вокруг вентральной стороны головы в качестве резервуара для перфузионного солевого раствора во время процедуры вскрытия и проведения экспериментов по записи. ( B ) Эпоксидная смола используется для герметизации зазоров между основанием восковой чаши и дорсальной частью головы (левая панель), а также между воском и трубками, содержащими антенны и хоботок, включая отверстия в трубах (правая панель ). Пожалуйста, нажмите здесь tO просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

    1. Под рассекающим микроскопом используйте ножницы для микроскопии, чтобы обрезать лабиринные лоскуты.
    2. Используйте ножницы микроотсекции или мини-топор, чтобы открыть вентральную сторону головной капсулы, сделав четыре разреза: два разреза вдоль кутикулы, которые окружают каждый глаз от спины кпереди, один разрез на кутикуле вдоль задней части головы, И один разрез на кутикуле вдоль передней части головы около хобота ( рис. 3А ).
    3. Аккуратно вытащите кутикулу с помощью микроразрушающих щипцов, чтобы обнажить мозг.
    4. Используя два острых микроотсектора, медленно и осторожно удалите жировые ткани и трахею, покрывающие ОЭЗ. Избегайте повреждения мозга или нервов (например, верхнечелюстной нерв, зрительный нерв, шейный соединитель). Промойте мозг, часто заменяя солевой раствор, и часто меняйте свет для улучшения видимости. Примечание. Это может быть самая важная часть диssection; Легко случайно повредить верхнечелюстной нерв, потянув его или сокрушив.
      Примечание: на этом этапе ОЭЗ и верхнечелюстные нервы должны быть хорошо видны ( рис. 3B- 3C ). Однако мозг и верхнечелюстные нервы покрыты тонкой оболочкой.
    5. Чтобы удалить оболочку, замените физиологический раствор восковой чашки на 10% (мас. / Об.) Коллагеназу / дозируйте растворенным в физиологическом растворе и оставьте на месте в течение 5 мин. Затем, после полоскания мозга несколько раз физиологическим раствором, аккуратно удалите оболочку с помощью сверхтонких микроразрушающих щипцов, вытащив оболочку из ОЭЗ через верхнечелюстные нервы.
    6. Начните перфузировать чашку с свежим солевым раствором. Поместите трубку из линии солевого раствора в чашку с воском и закрепите ее там, где расплавленный воск.

    figure-protocol-2
    инжирUre 3 : Процедура рассечения Мандуки. ( A ) Удалены губные щупики, головная капсула открывается, выполняя четыре разреза, как показано пунктирной линией. ( B ) Увеличенное изображение головного мозга после открытия головной капсулы и удаления жировой ткани и трахеи, что позволяет визуализировать верхнечелюстные нервы (MxNs) и субэзофагеальную зону (SEZ, термин, относящийся к области мозга под пищевод). Верхнечелюстные нервы переносят аксоны из врожденных рецепторных нейронов (GRN) в хоботок в ОЭЗ. ( C ) Схема мозга Мандуки . Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

    2. Tastant Delivery System

    1. Система подачи тантала состоит из четырех основных элементов: источника воды, коллектора вкуса, датчика цвета и сайта, содержащегоХоботок, все соединенные с жесткой пластиковой трубкой ( рис. 4А- 4В ). Чтобы построить эту систему, выполните шаги, показанные на рисунке 4B . Используйте жесткую пластиковую трубку длиной около 6 см (ID 0,3 см).
    2. Используйте паяльник, чтобы сделать небольшое отверстие в трубке, где хоботок будет размещен ( рис. 4А- 4B ).
    3. Для обеспечения того, чтобы хоботки разных животных всегда располагались в одном месте, прикрепите в трубку пластиковый экранирующий материал (сетка, размер отверстия около 0,1 см) ( рис. 4А- 4В ). С помощью бритвенного лезвия или вращающегося инструмента разрезать жесткую трубку на 5 мм выше отверстия хобота. Поместите сетку между двумя кусками трубки. Закрепите сетку и снова подключите трубки, используя эпоксидную смолу на внешней стороне труб. Оставьте эпоксидную смолу сушить в течение приблизительно 20 мин.
    4. Для доставки по вкусу используйте под давлениемПерфузионная система с таким количеством пробивных трубок по мере необходимости, соединенная с коллектором (см. Ниже). Используйте паяльник, чтобы сделать небольшое отверстие в жесткой трубке примерно на 1 см выше сетки. Вставьте выходную трубку из системы перфузии (ID 0,86 мм) в жесткую трубку и закрепите ее там, используя эпоксидную смолу ( рисунок 4A- 4B ).
    5. Используйте перистальтический насос для подачи постоянного потока (~ 40 мл / мин) дистиллированной воды. Соедините его с силиконовой трубкой с жесткой трубкой ( рис. 4А- 4С ). Подключите другую сторону жесткой трубки к другой силиконовой трубке, чтобы направлять выход в большой контейнер для отходов ( рис. 4А- 4С ).
    6. Чтобы доставить вкус, введите сжатый воздух в коллектор системы перфузии. Это может быть достигнуто, например, с помощью пневматического насоса (10 фунтов / кв.дюйм), управляемого импульсным входным импульсом, для ввода сжатого воздуха в манифест D, содержащей желаемый вкус. Импульс 1s выбрасывает около 0,5 мл вкуса.

    3. Подготовка и мониторинг готовности тантала.

    1. Разбавьте вкус в дистиллированной воде до желаемой концентрации. Имейте в виду, что дегустатор будет далее разбавлен потоком воды. Мы измерили конечную концентрацию, достигающую хоботка, как 77% начальной концентрации (см. Ссылки 10 , 29 ).
    2. Добавьте искусственный пищевой краситель к каждому дегустационному раствору, чтобы определить точное время, в течение которого дегустатор проходит через хоботок. Мы обнаружили, что зеленый краситель (см. Список материалов ) при 0,05% мас. / Об. Не активирует GRUN Manduca .
    3. Используйте датчик цвета (см. Таблицу 1), чтобы обнаружить пищевую окраску в дегустационных растворах. Используйте паяльник, чтобы сделать отверстие рядом с сеткой и на 0,5 см ниже выходной трубки системы перфузии ( S = "xfig"> Рисунок 4A-4B). Подключите датчик к жесткой трубке и закрепите его там, используя наружную поверхность.
      1. Запишите выход напряжения цветного датчика как аналоговый сигнал вместе с физиологическими сигналами (см. Раздел 4). Сигнал напряжения цветного датчика можно усилить с помощью усилителя постоянного тока, подключенного к датчику ( рис. 4A ).
    4. Убедитесь, что датчик цвета работает, подавая вкус и записывая выход напряжения датчика. Сигнал, вызванный красителем, должен превышать уровень шума.
      1. Отрегулируйте постоянный расход воды, чтобы сделать сигнал как можно ближе к квадрату.
        Примечание. При доставке нескольких вкусов в последовательности обратите внимание, что первое испытание с новым вкусом будет состоять из смеси нового и предыдущего вкуса. По этой причине мы не проанализировали эти первые испытания.
    «> figure-protocol-3
    Рисунок 4 : Система доставки тантала. ( A ) Схема устройства, используемого для доставки и мониторинга импульсов импульсов тантанов на хоботок животного. Основные компоненты системы обозначаются красными цифрами. Постоянный поток дистиллированной воды поддерживается через хобот перистальтическим насосом, соединенным с силиконовой трубкой, с жесткой пластиковой трубкой (1), где должен размещаться хобот (6). Таланты, содержащие небольшое количество красителя без вкуса, поставляются с использованием 16-канальной перфузионной системы под давлением. Резервуары, содержащие тантаны, соединены с коллектором (2), который прикреплен к жесткой трубке над отверстием, где должен быть размещен хобот (5). Сжатый воздух из пневматического насоса вводится в систему перфузии, чтобы быстро доставлять вкус, с синхронизацией с помощью специального программного обеспечения.Цветной датчик (3) используется для контроля за точной доставкой. Датчик подключен к жесткой трубке, расположенной рядом с хоботом и ниже выхода из системы перфузии. Сигнал напряжения цветного датчика усиливается усилителем постоянного тока. Красная дорожка на вставке рядом с усилителем иллюстрирует сигнал цвета, записанный с использованием программного обеспечения для сбора данных; Быстрое увеличение и уменьшение сигнала отражают прибытие и вымывание вкуса, соответственно. Хоботок мотыльки помещают в отверстие (5), расположенное чуть ниже цветового датчика. Ячейка (4) помещается над отверстием, чтобы гарантировать, что хоботки разных животных всегда расположены в одном месте. Другая сторона жесткой трубки соединена с другой силиконовой трубкой, чтобы направлять выход в контейнер для отходов (7). ( B ) Изображение, показывающее основные элементы системы подачи тантала, соединенные с жесткой пластиковой трубкой, которые обозначены красными цифрами, как показано на панели A: водаИсточник (6), трубчатый выпускной трубопровод (2) коллектора, датчик цвета (3), сетка (4) и отверстие, в которое должен быть вставлен хоботок (5), все соединены в жесткую пластиковую трубку (1) , ( C ) Отображается размещение препарата Manduca в настройке. Дистальный t2 / 3 хоботка моли введен в отверстие (5) в жесткой пластиковой трубке (1). Хоботок закреплен на месте с помощью зубного воска и эпоксидной смолы, как показано на вставке. Ввод воды в жесткую трубу и ее выход в контейнер для отходов обозначены цифрами 6 и 7 соответственно. Число 2 указывает на выпускную трубу коллектора. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

    4. Внеклеточная запись Tetrode для мониторинга активности, вызванной тантаном, из GRN

    1. Место приготовления моли на платформе под стереомикроскоп на вибрации( Рисунок 4C ).
    2. Поместите дистальную две трети хоботка мотыльки в жесткую трубку системы доставки вкуса ( рисунок 2B ). Для этого удлините хоботок мотыльки, а затем вставьте его в отверстие жесткой трубки, осторожно проталкивая его с помощью зажимных щипцов. Закрепите хоботок на месте мягким зубным воском, а затем слой эпоксидной смолы, чтобы избежать утечек ( рисунок 4C , вход).
    3. Соедините линию перфузии солевого раствора с головной капсулой и установите перфузионный поток с постоянной скоростью около 0,04 л / ч.
    4. Погрузите заземляющий электрод ( например, хлорированную серебряную проволоку) в солевую ванну ( рис. 5А ).
    5. Используйте изготовленную на заказ витую проволочную тетроду, построенную в соответствии с процедурой изготовления, описанной в 30 (предлагается 4 провода электродов для достижения хорошо изолированных блоков и длянерв). Перед экспериментом гальванизируйте электрод, следуя этапам, описанным в 30 .
    6. Используйте ручной микроманипулятор, чтобы поместить тетрод близко к верхнечелюстному нерву. Продвиньте тетрод, пока он не начнет проникать в нерв ( рис. 5 ).
    7. Подождите не менее 10 минут после установки тетрода, чтобы он мог стабилизироваться внутри нерва перед записью.
    8. Усильте сигнал (3000x) и используйте полосовой фильтр, установленный между 0,3-6 кГц. Приобретите сигнал с частотой дискретизации 40 кГц с использованием программного обеспечения для сбора данных.
    9. После окончания эксперимента поместите мольную композицию в морозильник.

    figure-protocol-4
    Рисунок 5 : Запись Tetrode из GRN. ( A , большое изображение) Микроманипулятор используется для pЗакрутите тетрод витой проволоки в верхнечелюстной нерв (MxN), чтобы записать активность GRN. Поверхностный электрод с хлористым серебром помещают в солевую ванну, как показано. ( A , вставка) Увеличенное изображение мозга, показывающее тетрод в верхнечелюстном нерве. Также указывается субэзофагеальная зона (ОЭЗ). ( B ) Схема мозгового мышления Мандуки, как в A. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

    Results

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Активность GRN может быть записана с использованием внеклеточного тетродного электрода до, во время и после допинга ( рис. 6A и 6C ). На рисунке 6А (средняя и нижняя панели) показаны отфильтрованные (300-6000 Гц) следы напряжения, записанные каждым из четырех проводов, помещенных в верхнечелюстной нерв, где могут наблюдаться сигналы разных амплитуд, отражающих потенциалы действия (стрелки). Импульс 1 с tastant (1 M сахароза) был доставлен 2 с после начала эксперимента; Начальное и смещение стимула контролировалось датчиком цвета ( рис. 6А , верхняя панель). Тантальные индуцированные всплески, которые можно наблюдать в каждом из четырех каналов ( рис. 6А , средняя панель). GRN можно идентифицировать и отличать от механосенсоров (не показано здесь), когда они реагируют на некоторые вкусы, а не другие

    Чтобы идентифицировать и изолировать отдельные реакции нейронов от записей тетрода, мы выполнили сортировку по шипу в автономном режиме с использованием набора пользовательских функций, основанных на методах Pouzat's 31 и Kleinfeld's 32 , 33 (эти методы описаны в этих цитатах: 10 , 29 ). На фиг.6В показан пример сортировки шипов, примененный к данным, показанным на фиг.6А , в которых были обнаружены три хорошо изолированных блока.

    Растровые графики на рис. 6C изображают ответы трех изолированных единиц на рисунке 6B на шесть разных вкусов (1 м сахароза, мальтоза и NaCl, 100 мМ кофеина и 10 мМ берберина и лобинелина), доставленные последовательно (4 испытанияS / tastant). Как показано на рисунке 6C , зарегистрированные GRN имеют разные уровни базовой активности, начиная от тихих (GRNs 1) до низких или умеренных (GRN 2 и 3). После дегустационного начала GRN демонстрируют разнообразные формы активности и демонстрируют различную селективность вкусов. Например, GRN 1 отвечал только на сахарозу, тогда как GRN 2 отвечал на мальтозу и NaCl всплеском всплесков и на лобелин с пиками только в начале стимула. Кроме того, некоторые ответы блокируются по времени стимула ( например, ответ GRN 1 на сахарозу), тогда как другие ответы превышают продолжительность стимула ( например, ответ GRN 3 на берберин) или содержат как возбуждающие, так и ингибирующие компоненты ( например, рисунок 7 GRN 2 ответы на NaCl и сахарозу). Для получения дополнительной информации о различных особенностях и характеристиках GRN см. Ссылку 10 .

    рис. 7 ). Трассировки напряжения в зеленой коробке на панели А регистрировались внутриклеточно из GRN 1 в течение 5 последовательных испытаний представления сахарозы, а одни и те же ответы показаны как растровые графики в панели B. (Обратите внимание, что этот тип ответов соответствует таковым, полученным с тетродами и Показанный на рис. 6C .) GRN 2, записанный с острыми внутриклеточными электродами, показывает более широкую характеристику ответа.

    figure-results-1 Рисунок 6: Репрезентативные результаты регистрации верхнечелюстных нервов с внеклеточными тетродами. ( A ) Отфильтрованные (300-6000 Гц) напряжения, записанные каждым из четырех проводов в верхнечелюстном нерве, показаны (средняя панель). В течение периода времени, обозначенного красным затенением на средней панели, был применен импульс длительностью 1 с. Начало и смещение стимула контролировалось датчиком цвета, как показано красной дорожкой напряжения на верхней панели, и обозначается на средней панели красно-заштрихованной областью. Пунктирные горизонтальные линии обозначают +50 (верхний), 0 (средний) и -50 (снизу) мкВ. Отображается увеличение трасс необработанных напряжений, соответствующих площади внутри вертикальных пунктирных линий (нижняя панель). Примеры спайков обозначены стрелками. ( B ) Пример сортировки шипов, применяемый к данным, показанным на панели A. Формы сигналов, записанные на каждом из четырех внеклеточных проводов (1-4) arE, идентифицированные с тремя различными GRN (единицы 1-3), способствующие записываемым сигналам. Отдельные события (цветные тонкие линии) и средняя (толстая черная линия) показаны для трех единиц. Необходимо учитывать ряд статистических критериев, чтобы надежно идентифицировать независимые единицы, используя метод сортировки шипов (см. Ссылки 10 , 29 ). ( C ) показаны растровые графики, представляющие ответы трех изолированных единиц, на последовательность из шести разных вкусов (4 испытания / вкус). Красная затененная область указывает период времени доставки (1 с). Концентрация тантанов составляла 1 М (сахароза, мальтоза, NaCl), 100 мМ (кофеин) и 10 мМ (бербер и лобелин). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

    figure-results-2 Lass = "xfigimg" src = "/ files / ftp_upload / 55868 / 55868fig7.jpg" />
    Рисунок 7 : Внутриклеточные записи от аксонов GRN. ( A , зеленая рамка). Трассы напряжения, записанные из GRN с острыми стеклянными внутриклеточными электродами (сопротивление 80-120 МОм), помещены в верхнечелюстной нерв, вызванный 5 последовательными стимуляциями с 1 М сахарозой (Suc). ( B ) Растровые графики ответов двух GRN, включая ответы, показанные на панели A (панель зеленого ящика), до двух разных вкусов, поставленных в последовательности (100 мМ серого цвета шрифта, 1 M черного цвета шрифта), записанных с помощью острых стеклянных внутриклеточных электродов Помещенных в верхнечелюстной нерв (7 проб / опытов и 3 испытания / вода показаны). Время доставки тантата обозначается красно-затененными участками обеих панелей. Начальное и смещение стимула контролировалось цветовым датчиком, о чем свидетельствуют красные следы напряжения в нижней части каждой панели.Es / ftp_upload / 55868 / 55868fig7large.jpg "target =" _ blank "> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

    Discussion

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Описанные здесь способы позволяют регистрировать in vivo от относительно простого животного Manduca sexta , чтобы характеризовать активность множественных, случайно выбранных GRN в течение длительных длительностей (более 2 часов), до, во время и после дегустации. Эти методы также позволяют быстро, последовательно передавать множественные стимулы вкуса с точным временным контролем, преимущества, которые полезны для изучения нейронных механизмов, лежащих в основе дегустационного представления. Этот протокол был использован для изучения того, как реакции GRN на дегустации трансформируются, когда они передаются в их постсинаптические целевые нейроны ( например, в ОЭЗ) путем мониторинга GRN одновременно с моносинхронно связанными интернейронами 10 . Кроме того, эти методы могут быть адаптированы к потребностям экспериментатора, позволяя выполнять сложные парадигмы для изучения фундаментальных аспектов вкусового кодирования.

    Когда начинаешьВ наших исследованиях одной технической проблемой, которую мы иногда приходилось решать, была неспособность обнаружить сигналы от верхнечелюстного нерва с проводами тетрода. Возможные причины этого разнообразны, поскольку протокол вскрытия является сложным, и для получения хорошей подготовки необходима определенная практика. Во-первых, во время вскрытия мотыля верхнечелюстные нервы легко повреждаются, особенно при удалении оболочки, окружающей нервную ткань. Во-вторых, если оболочка полностью не удалена, тетродные провода могут не иметь доступа к нерву. В обоих случаях начало новой подготовки часто является самым простым способом решения этих проблем. В-третьих, может возникнуть проблема с проводами из тетрода. Это можно проверить, измеряя импеданс проводов, который должен быть ~ 270 кОм на 1 кГц. Если значение импеданса превышает ~ 300 кОм, закрепите провода золотом для достижения желаемого импеданса (см. Ссылку 30 ). В-четвертых, часть оборудования может быть неправильно связанаИли плохое поведение.

    Другая возможная проблема заключается в том, что пиковые сигналы записываются, но нейрон (ы) не реагирует на вкус. Это может быть связано с тем, что записанные нейроны нечувствительны к набору поданных тантанов. Кроме того, важно помнить, что в дополнение к аксонам GRN верхнечелюстной нерв также несет механосенситивные волокна. Таким образом, можно записывать из механосенсорных нейронов вместо или в дополнение к GRN. Тем не менее, система подачи тантала предназначена для обеспечения постоянного механического ввода в течение всего эксперимента, что делает маловероятным, что ответы на вкусность будут сбиты с ответами на механический компонент его доставки. Нейроны, которые реагируют на некоторые, но не другие вкусы, или по-разному на разные вкусы, могут быть однозначно классифицированы как GRN. Мы рекомендуем использовать свежезаваренные разбавители, чтобы избежать изменения концентрации или состава вкуса из-за разложения или испарения соединенияРастворителя. Мы также рекомендуем регулярно чистить систему, чтобы избежать загрязнения трубопроводов и / или препятствий.

    Другой возможной технической проблемой является невыгодное отношение сигнал / шум. Эту проблему часто можно решить путем повторного хлорирования или регулировки положения заземляющего электрода ванны. Другим решениям может потребоваться экранирование и минимизация длины каждого электрического соединения в аппарате.

    Наконец, важно отметить, что для правильного анализа данных, полученных с использованием записей в тетроде, требуется тщательная сортировка всплесков. Мы обнаружили, что полностью автоматизированные методы обычно неадекватны. Мы рекомендуем ознакомиться с литературой по сортировке шипов, прежде чем анализировать данные тетрода 10 , 29 , 31 , 32 , 33 .

    Альтернативы нашей специализацииTocol может использоваться. Здесь мы описали вскрытие через вентральную часть головки мотыля, обеспечивающее доступ к верхнечелюстным нервам и ОЭЗ, но также можно получить доступ к этим структурам, рассекая через дорзальную сторону. Мы обнаружили, что подготовка дорзальной стороны не является оптимальной для записи из этих вкусовых структур из-за их глубокого местоположения, но этот препарат дает преимущество, позволяя записывать записи из структур более высокого порядка, таких как тело гриба, область, которая была связана с несколькими -сенсорная интеграция, ассоциативное обучение и обработка памяти 34 . Мы сосредоточились на использовании тетродных электродов для записи из верхнечелюстного нерва, но, как мы показали, для этой цели также могут использоваться стандартные внутриклеточные острые электроды. Кроме того, обе методики могут комбинироваться для одновременной записи из нескольких зон мозга 10 . В литературе по нейробиологии представлены многочисленные примеры iКоторые оказались мощными инструментами для выявления фундаментальных принципов сенсорной обработки, таких как обонятельное кодирование, которые применимы как к насекомым, так и к позвоночным 35 , 36 , 37 , 38 , 39 . Мы надеемся, что наши методы приведут к фундаментальным новым представлениям о вкусовом кодировании.

    Disclosures

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Авторам нечего раскрывать.

    Acknowledgements

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Эта работа была поддержана интрамуральным грантом от NIH-NICHD до MS. Мы благодарим Дж. Дольда и Т. Тэлбота из Core Facility Core NIH-NIMH за помощь в разработке системы доставки таланта.

    Materials

    List of materials used in this article
    NameCompanyCatalog NumberComments
    <сильно>Препарирование и подготовка образцов>
    полипропиленовая трубка, 15 мл игла FalconFisher Scientific14-959-53A
    , короткая фаска, 19 г x 1 - 1/2"   MONOJET888200144Для подачи воздуха для удаления волос от моли.
    Лепка Клэй-Ван Акен Пласталина DickBlick33268
    Чашка Петри -100 x 15 мм VWR International89000-304
    Наконечник для пипетки (1 - 200 &; L)США Scientific1111-0806
    Лезвие бритвыTechni EdgeTE05-071
    22 Стандартный соединительный провод AWGAlphaWire1551Для вставки хоботка в наконечник пиппея.
    Батик воскЖаккард7946000
    Электрический ваксерAlmore International66000
    Стерео МискроскопLeicaMZ75
    Dumont #1 щипцы (грубые)World Precision Instruments500335для удаления жира и ненервной ткани.
    Титановые щипцы Dumont #5 (тонкие) World Precision Instruments14096Для удаления жира и ненервной ткани.
    Щипцы Dumont #5SF (сверхтонкие)World Precision Instruments500085Для дешипонирования нервной ткани.
    Ножницы Vannas (тонкая)World Precision Instruments500086для удаления кутикулы.
    Коллагеназа/диспазаСигма-Олдрич11097113001
    эпоксидная смолаперматекс84101
    Название<>Company>Номер в каталогеКомментарии
    Система перфузии солевым раствором
    Комплект удлинителей с регулятором расхода  B Braun Medical Inc.V5200
    Набор для внутривенного введения с местом Y-образной инъекции  B Braun Medical Inc.V1402
    Название<strong>Company>Номер в каталогеКомментарии
    Tastant Delivery System
    белый полупрозрачный нейлоновый тюбинг OD 1/4", ID 1/8"Small Parts Inc.B001JJT4SAЖесткая труба, которая соединяет четыре основных элемента системы.
    ПаяльникCircuit SpecialistsZD200BK
    Роторный инструмент - DremelDremel4200
    Полипропиленовая сетка, размер отверстия (размер отверстия 0,1 х 0,13 см)Промышленная сеткаXN5170Для обеспечения того, чтобы пробозы разных животных размещались в одном и том же месте.
    Напорная 16-канальная перфузионная система Бионаучные инструментыPS-16HДля доставки вкусов. Эта система включает в себя пережимные клапаны, трубки, коллектор, цилиндры раствора, контроллер клапанов и фитинговые аксессуары.
    Трубки полипропиленовые, ID 0.034", ID 0.050"Becton, Dickinson & Co427421Выходная трубка от системы перфузии.
    Пневматический PicoPumpWorld Precision InstrumentsSYS-PV820Для управления выходным каналом системы перфузии.
    Программный комплекс сбора данных LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ cardNational InstrumentsLabVIEW 2011Для управления пиконасосом для подачи данных и для записи сигналов с датчика цвета.
    Compulab 3 Manostat перистальтический насосSigmaP1366Для перекачки воды.
    Силиконовая трубка, ID 1/16" OD 1/8"Cole-ParmerWU-95802-02Для подключения источника воды к перистальтической трубке насоса, а выпускной трубки насоса - к жесткой трубке системы нагнетания.
    Датчик цвета - цифровой волоконно-оптический датчикKeyence  FS-V31MДля контроля доставки тастантов. 
    Датчик цвета - отражающий волоконный блокKeyenceFU35-FZДля подключения устройства датчика цвета.
    Стоматологическая периферия WaxHenry-Schein Dental6652151Для фиксации хоботка в жесткой трубке.
    объемом 3,7 лДля подачи воды в систему и сбора отработанной воды.
    Быстрый зеленый FCF SigmaF7258
    Щипцы для повязки 25,5 смWPI500364Для введения хоботка от моли в отверстие хоботка в жесткой трубке.
    Name<strong>CompanyНомер в каталогеКомментарии
    Электрофизиологическое оборудование
    . усилительBrown-Lee440
    LampSchott SchottFostec Light Source DCR 2
    Ручной микроманипуляторLeicaДляточного введения тетродов в мозг животного. Манипулятор должен допускать мелкие и грубые движения по осям x, y и z.
    СтереомикроскопLeicaMZ75
    Виброизоляционный стол (лабораторный стол MICRO-g)TMC63-541
    ОсциллографTektronix 
    16-канальный предусилитель и усилитель16-канальный усилитель MA-800 Amplifier System B.E.S 2013
    КомпьютерDelloptiplex 780Ниже приведены минимальные рекомендуемые требования. Оперативная память: 3,32 ГГц, 3 ГБ. Процессор: Intel Core  2 Дуо. Графическая карта: встроенная Intel GMA X4500.
    Программный комплекс сбора данных, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ cardNational InstrumentsLabVIEW 2011Для управления пиконасосом для подачи тастанта и для записи сигналов от датчика цвета и электрода.
    NameCompanyНомер в каталоге>Комментарии
    Tastants
    KAcSigma-AldrichP5708
    LiClSigma-AldrichL9650
    NaClSigma-Aldrich73575
    СахарозаСигма-Олдрич84097
    strongДва контейнера DCTDS2014

    References

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. The receptors and cells for mammalian taste. Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).">Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. The receptors and cells for mammalian taste. Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).
    2. A Gustotopic Map of Taste Qualities in the Mammalian Brain. Science. 333 (6047), (2011).">Chen, X., Gabitto, M., Peng, Y., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. A Gustotopic Map of Taste Qualities in the Mammalian Brain. Science. 333 (6047), (2011).
    3. Common Sense about Taste: From Mammals to Insects. Cell. 139 (2), 234-244 (2009).">Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. Common Sense about Taste: From Mammals to Insects. Cell. 139 (2), 234-244 (2009).
    4. The receptors and coding logic for bitter taste. Nature. 434 (7030), 225-229 (2005).">Mueller, K. L., Hoon, M. A., Erlenbach, I., Chandrashekar, J., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. The receptors and coding logic for bitter taste. Nature. 434 (7030), 225-229 (2005).
    5. The receptors for mammalian sweet and umami taste. Cell. 115 (3), 255-266 (2003).">Zhao, G. Q., Zhang, Y., et al. The receptors for mammalian sweet and umami taste. Cell. 115 (3), 255-266 (2003).
    6. The cells and logic for mammalian sour taste detection. Nature. 442 (7105), 934-938 (2006).">Huang, A. L., Chen, X., et al. The cells and logic for mammalian sour taste detection. Nature. 442 (7105), 934-938 (2006).
    7. The afferent code for sensory quality. Am Psychol. 14 (5), 226-232 (1959).">Pfaffmann, C., Carl, The afferent code for sensory quality. Am Psychol. 14 (5), 226-232 (1959).
    8. The neural processing of taste. BMC Neurosci. 8 (Suppl 3), (2007).">Lemon, C. H., Katz, D. B. The neural processing of taste. BMC Neurosci. 8 (Suppl 3), (2007).
    9. The neural representation of taste quality at the periphery. Nature. 517 (7534), 373-376 (2015).">Barretto, R. P. J., Gillis-Smith, S., et al. The neural representation of taste quality at the periphery. Nature. 517 (7534), 373-376 (2015).
    10. Spatiotemporal Coding of Individual Chemicals by the Gustatory System. J Neurosci. 35 (35), 12309-12321 (2015).">Reiter, S., Campillo Rodriguez, C., Sun, K., Stopfer, M. Spatiotemporal Coding of Individual Chemicals by the Gustatory System. J Neurosci. 35 (35), 12309-12321 (2015).
    11. Bitter Taste Stimuli Induce Differential Neural Codes in Mouse Brain. PLoS ONE. 7 (7), e41597(2012).">Wilson, D. M., Boughter, J. D., et al. Bitter Taste Stimuli Induce Differential Neural Codes in Mouse Brain. PLoS ONE. 7 (7), e41597(2012).
    12. Contribution of different taste cells and signaling pathways to the discrimination of "bitter" taste stimuli by an insect. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 22 (16), 7281-7287 (2002).">Glendinning, J. I., Davis, A., Ramaswamy, S. Contribution of different taste cells and signaling pathways to the discrimination of "bitter" taste stimuli by an insect. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 22 (16), 7281-7287 (2002).
    13. Information processing in the olfactory systems of insects and vertebrates. Semin Cell Dev Biol. 17 (4), 433-442 (2006).">Kay, L. M., Stopfer, M. Information processing in the olfactory systems of insects and vertebrates. Semin Cell Dev Biol. 17 (4), 433-442 (2006).
    14. Peripheral Coding of Taste. Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).">Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. Peripheral Coding of Taste. Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).
    15. Coding in the Mammalian Gustatory System. Trends Neurosci. 33 (7), 326-334 (2010).">Carleton, A., Accolla, R., Simon, S. A. Coding in the Mammalian Gustatory System. Trends Neurosci. 33 (7), 326-334 (2010).
    16. The organization of the chemosensory system in Drosophila melanogaster: a rewiew. Cell Tissue Res. 275 (1), 3-26 (1994).">Stocker, R. F. The organization of the chemosensory system in Drosophila melanogaster: a rewiew. Cell Tissue Res. 275 (1), 3-26 (1994).
    17. Peripheral and central structures involved in insect gustation. Microsc Res Tech. 47 (6), 401-415 (1999).">Mitchell, B. K., Itagaki, H., Rivet, M. P. Peripheral and central structures involved in insect gustation. Microsc Res Tech. 47 (6), 401-415 (1999).
    18. Labellar taste organs of Drosophila melanogaster. J Morphol. 150 (2), 327-341 (1976).">Falk, R., Bleiser-Avivi, N., Atidia, J. Labellar taste organs of Drosophila melanogaster. J Morphol. 150 (2), 327-341 (1976).
    19. Physiology of a primary chemoreceptor unit. Science. 122 (3166), 417-418 (1955).">Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. Physiology of a primary chemoreceptor unit. Science. 122 (3166), 417-418 (1955).
    20. Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla. J Vis Exp. (84), e51355(2014).">Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla. J Vis Exp. (84), e51355(2014).
    21. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila). Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).">Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila). Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
    22. Electrophysiological responses of gustatory sensilla of Mamestra brassicae (Lepidoptera, Noctuidae) larvae to three ecdysteroids: ecdysone, 20-hydroxyecdysone and ponasterone. A. J Insect Physiol. 45 (10), 871-876 (1999).">Descoins, C., Marion-Poll, F. Electrophysiological responses of gustatory sensilla of Mamestra brassicae (Lepidoptera, Noctuidae) larvae to three ecdysteroids: ecdysone, 20-hydroxyecdysone and ponasterone. A. J Insect Physiol. 45 (10), 871-876 (1999).
    23. Function and central projections of gustatory receptor neurons on the antenna of the noctuid moth Spodoptera littoralis. J Comp Physiol. 199 (5), 403-416 (2013).">Popescu, A., Couton, L., et al. Function and central projections of gustatory receptor neurons on the antenna of the noctuid moth Spodoptera littoralis. J Comp Physiol. 199 (5), 403-416 (2013).
    24. Generator potential of insect chemoreceptor. Science. 130 (3380), 922(1959).">Morita, H., Yamashita, S. Generator potential of insect chemoreceptor. Science. 130 (3380), 922(1959).
    25. Neuroanatomy of the sucking pump of the moth, Manduca sexta (Sphingidae, Lepidoptera). Arthropod Struct Dev. 35 (1), 15-33 (2006).">Davis, N. T., Hildebrand, J. G. Neuroanatomy of the sucking pump of the moth, Manduca sexta (Sphingidae, Lepidoptera). Arthropod Struct Dev. 35 (1), 15-33 (2006).
    26. The Neurons in the Labellar Nerve of the Blow Fly. Z Vergl Physiol. 54, 268-289 (1967).">Stürckow, B., Adams, J. R., Wilcox, T. A. The Neurons in the Labellar Nerve of the Blow Fly. Z Vergl Physiol. 54, 268-289 (1967).
    27. Stürckow, B. Electrophysiological studies of a single taste hair of the fly during stimulation by a flowing system. Proceed 16 Intern Contr Zool. 3 (8), 102-104 (1963).
    28. Male-specific, sex pheromone-selective projection neurons in the antennal lobes of the moth Manduca sexta. J Comp Physiol A. 160, 553-569 (1987).">Christensen, T. A., Hildebrand, J. G. Male-specific, sex pheromone-selective projection neurons in the antennal lobes of the moth Manduca sexta. J Comp Physiol A. 160, 553-569 (1987).
    29. Gustatory Information Processing. , https://repository.library.brown.edu/studio/item/bdr:386235/PDF/?embed=true (2014).">Reiter, S. Gustatory Information Processing. , https://repository.library.brown.edu/studio/item/bdr:386235/PDF/?embed=true (2014).
    30. Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits. J Vis Exp. (71), (2013).">Saha, D., Leong, K., Katta, N., Raman, B. Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits. J Vis Exp. (71), (2013).
    31. Using noise signature to optimize spike-sorting and to assess neuronal classification quality. J Neurosci Methods. 122 (1), 43-57 (2002).">Pouzat, C., Mazor, O., Laurent, G. Using noise signature to optimize spike-sorting and to assess neuronal classification quality. J Neurosci Methods. 122 (1), 43-57 (2002).
    32. Quality Metrics to Accompany Spike Sorting of Extracellular Signals. J Neurosci. 31 (24), 8699-8705 (2011).">Hill, D. N., Mehta, S. B., Kleinfeld, D. Quality Metrics to Accompany Spike Sorting of Extracellular Signals. J Neurosci. 31 (24), 8699-8705 (2011).
    33. Automatic sorting of multiple unit neuronal signals in the presence of anisotropic and non-Gaussian variability. J Neurosci Methods. 69 (2), 175-188 (1996).">Fee, M. S., Mitra, P. P., Kleinfeld, D. Automatic sorting of multiple unit neuronal signals in the presence of anisotropic and non-Gaussian variability. J Neurosci Methods. 69 (2), 175-188 (1996).
    34. Mushroom body memoir: from maps to models. Nat Rev Neurosci. 4 (4), 266-275 (2003).">Heisenberg, M. Mushroom body memoir: from maps to models. Nat Rev Neurosci. 4 (4), 266-275 (2003).
    35. Odorant-induced oscillations in the mushroom bodies of the locust. J Neurosci. 14, 2993-3004 (1994).">Naraghi, M., Laurent, G. Odorant-induced oscillations in the mushroom bodies of the locust. J Neurosci. 14, 2993-3004 (1994).
    36. Temporal representations of odors in an olfactory network. J Neurosci. 16, 3837-3847 (1996).">Laurent, G., Wehr, M., Davidowitz, H. Temporal representations of odors in an olfactory network. J Neurosci. 16, 3837-3847 (1996).
    37. Oscillations and sparsening of odor representations in the mushroom body. Science. 297, 359-365 (2002).">Perez-Orive, J., et al. Oscillations and sparsening of odor representations in the mushroom body. Science. 297, 359-365 (2002).
    38. Odor identity vs. intensity coding in an olfactory system. Neuron. 39, 991-1004 (2003).">Stopfer, M., Jayaraman, V., Laurent, G. Odor identity vs. intensity coding in an olfactory system. Neuron. 39, 991-1004 (2003).
    39. Olfactory network dynamics and the coding of multidimensional signals. Nature Re Neurosci. 3, 884-895 (2002).">Laurent, G. Olfactory network dynamics and the coding of multidimensional signals. Nature Re Neurosci. 3, 884-895 (2002).

    Reprints and Permissions

    Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

    Request Permission

    Tags

    Gustatory Receptor NeuronsManduca sextaExtracellular RecordingsTetrode RecordingsTastant Delivery SystemSubesophageal ZoneMaxillary Nerve ExposureSpike Sorting TechniqueIn Vivo RecordingsGustatory Coding Methods

    Related Articles