Method Article

Кучность биоактивные белки или пептидов на гидрогеля с помощью фотохимии биологических приложений

DOI:

10.3791/55873

⸱

September 15th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Rensselaer Polytechnic Institute, 2Center for Biotechnology and Interdisciplinary Studies, Rensselaer Polytechnic Institute, 3Department of Bioengineering, Northeastern University, 4Department of Bioengineering, University of Texas at Arlington

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом методе мы используем фотополимеризации и нажмите химических методов для создания белка или пептида узоры на поверхности полиэтиленгликоля (PEG) гидрогели, обеспечивая иммобилизованных биологически активных сигналов для изучения клеточных реакций в пробирке .

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Существует множество биологических раздражители, которые могут влиять на поведение и клеточной дифференцировки клеток. Общие клетки культуры подходы полагаются на растворимых факторов в рамках среднесрочной поведение ячейки элемента управления. Однако растворимые дополнения нельзя имитировать определенные сигнализации мотивы, как факторы роста матрица привязкой, ячейке сигнализации и пространственной биохимических подсказки, которые являются общее влияние на клетки. Кроме того биофизические свойства матрицы, таких как субстрат жесткость, играют важную роль в судьбе ячейки, которая не является легко манипулировать, используя обычные ячейки, культивирование практики. В этом методе мы опишем простой протокол предоставлять узорной биоактивные белков на синтетических полиэтиленгликоля (PEG) гидрогели, используя фотохимии. Эта платформа позволяет для независимого управления субстрата жесткости и биохимические пространственными аллюзиями. Эти гидрогели может достичь большого диапазона значений физиологически соответствующей жесткости. Кроме того поверхности этих гидрогели может быть photopatterned с биоактивные пептиды, или белков через тиоловых Эне нажмите химии реакций. Эти методы были оптимизированы для сохранения функции белка после поверхности иммобилизации. Это универсальный протокол, который может быть применен к любому белка или пептида, представляющие интерес для создания различных моделей. Наконец клетки посеян на поверхности этих биологически активных гидрогели может контролироваться со временем, как они реагируют на пространственно определенных сигналов.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Есть много стимулов, которые влияют на поведение клеток. Как правило типичных клеток культивирования методы полагаются на растворимых факторов для получения клеточных реакций; Однако существуют ограничения на этот подход. Эти методы не могут точно отображать все сигнализации мотивы встречаются в vivo. Такие сигнальных механизмов относятся поглощенных факторы роста, ячейке сигнализации и пространственно специфические биохимические подсказки. Кроме того подложка жесткости могут играть важную роль в поведение и клеточной дифференцировки клеток и не является легко манипулировать, используя общую ячейку культивирования практики1,2. Биоматериал подходы предлагают новую платформу для начала изучения этих сигнальных механизмов. В частности гидрогели являются отличным кандидатами для настройки субстрата жесткость3,4, иммобилизации белков и пептидов5,6и создание пространственно определенных шаблонов7, 8.

Гидрогели обычно используются как строительные леса в тканевой инженерии, благодаря их биофизических и биохимических сходства с внеклеточного матрикса (ECM)9,10. Полимеры природные являются общий выбор для леса, как они биосовместимых и находятся во многих тканях организма. Ограничение использования природных полимеров в качестве субстратов является, что они не легко манипулировать химических постановление для bioconjugation. С другой стороны синтетические гидрогели, как таковой как КОЛЫШЕК, являются отличным платформ для целевых химия11,12. Кроме того гидрогели PEG не вызывают клеточного ответа и поэтому используются в качестве инертного магистралей для создания биоактивные подмостей.

Для создания биоактивные гидрогели, фотополимеризации и тиоловых Эне нажмите химии, которые заняты реакции. Эти photoreactions требуют фотоинициатора и источник ультрафиолетового света. Когда фотоинициаторы вводятся к ультрафиолету, облигации перерыв в форме радикалов. Диссертации радикалов необходимы для инициирования реакции, но может отрицательно повлиять на белками биологическую12,13. Таким образом крайне важно оптимизировать фотоинициатора и УФ облучения раз сохранить биологическую белка.

В этом методе гидрогели синтезируются путем фотополимеризации роста цепи акрилат акрилат. ПЭГ diacrylate (PEGDA) мономеров реагируют друг с другом в форме разветвленных полимеров сети отвечает за структуры гидрогеля. Концентрация PEGDA мономеров в рамках решения гелем прекурсоров будет контролировать жесткость субстрата. Из-за небольшой размер гидрогеля пор, ECM белки, например фибронектин могут быть легко включены в пределах гидрогеля с целью вложения ячейки. Наконец эти гидрогели может быть с биоактивные пептиды узором поверхности или белков через тиоловых Эне нажмите химии реакций. Здесь непрореагировавшего бесплатно акрилатов в системе гидрогеля будет реагировать с бесплатным тиолов, расположенный на белка или пептида при воздействии УФ света. После того, как белки и пептиды лишенных подвижности на поверхности гидрогеля, гидрогеля может храниться при температуре 4 ° C в течение нескольких недель без потери биологическую. Это обеспечивает удобство, гибкого планирования экспериментальных и возможности для сотрудничества между лабораториями. В целом эта платформа позволяет биомеханических и пространственной биохимических управления, независимые друг от друга, за возможность влиять на поведение сотовых.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка материалов для синтеза Гидрогель

  1. подготовка запасов решения PEGDA, литий фенил-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (круг) и фибронектин в стерильных условиях и на основе расчеты (таблица 1А).
    1. Весят и распустить соединений в фосфат амортизированное saline (PBS). Как правило поддерживают PEGDA рабочей концентрации раствора между 50 и 200 мг/мл (5-20% вес/объем). Пипетка раствор PEGDA через фильтр шприц 0,22 мкм для стерилизации.
      Примечание: Держите PEGDA решения, покрытые пленкой, Упаковка для защиты их от света. Готовить свежий раствор PEGDA (рекомендуется) для каждого эксперимента.
    2. Воссоздать фибронектин белка порошок на основе производителя ' s рекомендации. Поддерживать фибронектин Стоковый раствор на 1 мг/мл, аликвота его в 60-100 мкл аликвоты и хранить их при-20 ° C до использования. Размораживание аликвоты на 4 ° C на несколько часов или на ночь перед использованием. Если белок запасов уже не предоставляется в стерильных условиях, используйте фильтр шприц 0,22 мкм для стерилизации.
      Примечание: Фибронектин используется для вложения клеток. Может быть заменен другими ECM белки.
    3. Весят, круг для Стоковый раствор и растворить его в PBS; Типичная концентрация запасов 25 мг/мл. Sonicate, если есть какие-либо проблемы с растворения. Решение пройти 0,22 мкм фильтром для стерилизации. Охватывают круг с обертыванием фольги и держать его на 4 ° C до нескольких месяцев.
      Примечание: Круг-фотоинициатора, используемые для фотохимии.
  2. Подготовить стерильных стеклянных слайд формы для формирования гидрогеля. Лист
    1. автоклав полиэстера; один необходима для каждой формы гель. Замочите два стеклянных скольжениях и три элементы дистанционные пластиковые (толщиной 0,5 мм) для каждой формы гель в 70% этанола для по крайней мере 2 h, но обычно позволяют им замочить на ночь. Замочите в этанол 70% за 10 мин до использования пяти зажимы для каждой формы гель.
    2. Место стекла слайды, распорки и зажимы на небольшой лист газобетона в капотом культуры клеток, чтобы дать им высохнуть на несколько часов.
    3. Подготовка гидрогеля плесени, поставив пластиковые прокладки вокруг края на стеклянное скольжение. Место на второй слайд стекла на вершине. Обеспечения опоры плотно рядом друг с другом с зажимы, два на каждой длинной стороне и один на вершине.
      Примечание: Если это не собран правильно, решения гелем будет просачиваться.
    4. Поверхность стерилизуйте плесень с клеточной культуры капот УФ света за 30 мин до использования. На полпути через, флип плесень подвергать обеих поверхностей.

2. Модификация белков с бесплатным тиоловых

  1. подготовить фондовых решений с помощью вычисления из электронной таблицы для преобразования аминов в тиоловых на белки (таблица 1А).
    1. Сделать буфер реакции, отрегулируйте PBS до pH 8 и добавление 5 мм ЭДТА. Буфер реакции пипеткой, в 0,22 мкм фильтром шприц для стерилизации.
      Примечание: ЭДТА имеет важное значение, как он защищает тиолы от формирования дисульфидными облигаций. Тиоловых групп должны оставаться в их сокращенной форме для реакции происходят.
    2. Весят, 2-iminothiolane (Траут ' s реагент) и растворить его в буфер реакции для Стоковый раствор концентрация 2 мг/мл (14 мм). Решение пройти через фильтр шприц 0,22 мкм для стерилизации. Хранят раствор при температуре 4 ° C для до нескольких месяцев.
      Примечание: 2-iminothiolane-это молекула, которая реагирует с растворителем облученных бесплатные аминов на белки и преобразует их в свободный тиолы.
    3. Восстановить белка в буфере реакции в концентрации между 0,1 и 1 мг/мл. Если ранее стерильные, Пипетка это решение через фильтр шприц 0,22 мкм для стерилизации.
      Примечание: Этот белок является биохимическая сигнал, который будет рисунком на поверхность гидрогеля. Кроме того, хотя концентрации белка может варьироваться, более высокие концентрации идеальны для сильнее белка шаблонов.
  2. Реагируют белка с 2-iminothiolane, смешивая оба акций решения вместе; используйте Таблица 1B для расчета коэффициента правильный объем. Как правило, используют молярное соотношение 8:1-2-iminothiolane белком.
    Примечание: Для крупных белков или более разбавлять концентрации, использовать выше молярное соотношение 2-iminothiolane. Обратитесь к производителю ' s протокол 15.
  3. Инкубировать реакции на 1 ч при комнатной температуре. Опреснительной спин микро столбец использовать для удаления thiolated белковый продукт из оставшихся реактивы, после производитель ' s протокол 16.
    Примечание: Исключение этой смолы ограничено 5 кДа.
  4. Использование Эллман ' s Assay количественно измерить количество свободного тиолы за белка. Следуйте производитель ' s протокол assay 17.

3. Гидрогель образования

  1. создать решения гелем прекурсоров на основе значений вычисляется из таблицы 1 c. Смешайте PEGDA, фибронектин и коленях томов. Пипетка решение энергично обеспечить однородный раствор, но не создавать пузыри. Держите решение, защищенном от света.
  2. Пипетка решение прекурсоров гель тщательно между двух стеклянных скольжениях гель плесени. Как правило добавьте тома между 800 и 1000 мкл на плесень. Разоблачить гель решение в форме УФ света (длина волны: 365 Нм, мощность: 3-4 МВт/см 2) для 1-2 мин сформировать гидрогеля.
    Примечание: Не подвергайте Гидрогель для длительного УФ-излучения, как он будет ограничивать поверхности белка, кучность возможности.
  3. Снимать зажимы и аккуратно удалить слайд верхнего стекла, применяя напротив давления для двух боковых распорок.
  4. Использование подходящего размера биопсии удара вырезать образцы гидрогеля. Выбивать несколько гидрогели из прямоугольника гель служить реплицирует и контролировать образцы.

4. Гидрогель жесткость измерения

  1. удар, гидрогели с 8 мм в диаметре биопсии пуансон для параллельных пластины Реометр 8 мм. Загрузить один образец Гидрогель в Реометр (см. Таблицу материалы).
  2. Нижней параллельной пластине геометрии это 8 мм в диаметре до изготовления контакт с поверхностью геля. Сохранить зазор расстояние 0,5 мм для образца 0,5 мм толстой гидрогеля.
  3. Выполнение время зачисток за 5 мин при 0,1% деформации, частотой 0,1 Гц и 37 ° C. среднем G ' значения через каждый раз развертки. Запуск независимых гидрогели для реплицирует каждой композиции.
    Примечание: G ' значения должны быть стабильными во времени точки; Если они не являются, % напряжения и частоты зачисток должно выполняться для выбора соответствующего значения 14.

5. Кучность белка

  1. подготовить требуемый шаблон для фотошаблонов, с помощью программы автоматизированного проектирования (САПР). Печатайте photomask на прозрачный лист с помощью принтере с высоким разрешением. Замочите photomask в этанол 70% за 10 мин до использования. Дайте высохнуть в капюшоне культуры клеток перед использованием photomask воздуха.
  2. Добавить решение белка thiolated, подготовленный на шаге 2 на поверхности Гидрогель для поверхности патронирования. Пипетка 1-2 мкл/см 2 thiolated раствора белка на поверхности каждого вырежьте из геля.
    Примечание: Важно свести к минимуму объем белка; добавить только достаточно, чтобы равномерно покрыть всю поверхность образца гидрогеля.
  3. Тщательно место photomask на поверхности гидрогеля. Не позволяйте пузырьки воздуха между photomask и поверхностью гидрогеля. Аккуратно надавите на маску, чтобы удалить любые пузыри формы.
  4. Предоставляют гидрогеля на второй раунд Ультрафиолета (длина волны: 365 Нм, мощность: 3-4 МВт/см 2) за 30-60 s.
    Примечание: Важно для воздействия шаблон достаточно УФ света для создания сильной шаблона не вызывая потери функции протеина.
  5. Мыть гидрогели с PBS для удаления непрореагировавшего видов и место каждой Гидрогель в рамках хорошо пластины. Будьте внимательны при размещении гели в каждой скважине; Убедитесь, что узорной поверхность является лицом вверх. Вымойте гели в PBS на 4 ° C; гели являются стабильными для по крайней мере две недели на 4 ° C.

6. Подготовка гидрогели для заполнения ячейки

  1. инкубировать гели в базальной среднего за 5-10 мин при 37 ° C до посева. Для человека пупочную вену эндотелиальных клеток (HUVECs) используйте ЭГМ-2 средних без факторов роста. Минимизировать объем среднего добавлен к каждому хорошо для предотвращения плавающей гидрогеля. Для 48-ну плиты, используйте объемом 250 мкл среднего.
    2. G
  2. спин вниз пластину на 300 x 3 мин для обеспечения что гидрогели расположены в нижней части скважины и не плавают. Сделать это немедленно, до заполнения ячеек.

7. Сотовый посев на гидрогели

  1. использования стандартных стерильные mammalian клетки культуры процедуры для заполнения ячейки и экспериментальной процедуры. Удалите HUVECs из фляги культуры ткани, с использованием стандартной ячейки отряд протоколов. Вымойте тканевой культуры блюдо с стерильных PBS и инкубировать трипсином для 3-5 мин на 37 ° C.
  2. Утолить подвеска trypsinized ячейки среднего или трипсина раствором избыток клеток нейтрализатор.
  3. Спина вниз суспензию клеток в центрифуге на 300 x g 5 мин тщательно удалить супернатант и сохранить клетки Пелле.
  4. Ресуспензируйте Пелле клеток базальной ЭГМ-2 с без факторов роста. Используйте Горяева для подсчета клеток.
  5. Добавить 75000 клеток/см 2 для каждого гидрогеля поверхности медленно дозирование в центр каждого хорошо так, чтобы не нарушить гели. Место хорошо пластины в инкубатор культуры клеток при 37 ° C. За несколько дней, периодически удалять блюдо для наблюдения в.

8. Оценка отпорности

  1. культуры е. coli на ночь в виде суспензии в LB отвара в орбитальной подвеска при 37 ° C и 200 об/мин. Спин вниз культуры е. coli, декантируют и воссоздать ячейку Пелле в минимальный объем PBS. Весят, лизоцима и воссоздания на 1 мг/мл для Стоковый раствор.
  2. Пипетка небольшой объем (25 мкл) акций решения лизоцима в microcentrifuge трубы. Добавить различные уровни LAP фотоинициатора (0-12 мм) и подвергать образцы в 1 мин УФ света. В отдельную группу, добавить такое же количество круг (2 мм) лизоцима решение и предоставить образцы для различной УФ света раз (0-4 мин). Включать репликация для каждого лечения.
  3. Добавить одинаковый объем концентрированной E. coli решение каждого лизоцима образца для окончательного лизоцима белка концентрацию 0,5 мг/мл. Инкубировать смешанные растворы для 4 ч при комнатной температуре.
    Примечание: Это позволяет время для функциональных лизоцима лизируют клеточной стенки бактерий и выпустить протеины в раствор.
  4. Использовать необработанные лизоцима, инкубировали с кишечной палочки для позитивного управления; считайте, что это 100% биологически активные измерения. Используйте решение лизоцима, инкубировали с PBS только как отрицательный контроль.
  5. Спин вниз образцы удалить ячейки мусор и держать супернатант. Запуск assay Брадфорд количественно оценить общую концентрацию белка в надосадке измерить количество бактериальных lysate.
  6. Запуск assay Брадфорд после производитель ' s протокол 18. Рассчитать раз изменения концентрации белка по сравнению с отрицательного контроля в.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол для создания биоактивных структур на поверхности PEG гидрогели иллюстрируется на рисунке 1. Таблица была разработана для расчета объема и концентрации для каждого штока решения (Таблица 1а). Белки, чтобы быть иммобилизованным на поверх...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол предоставляет метод для создания шаблонов биоактивные белка для биологических приложений. Есть несколько изменений, которые могут быть сделаны адаптировать этот протокол для различных экспериментов. Во-первых требования вложение ячейки будет варьироваться для различн...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было главным образом при поддержке грантов от Американской ассоциации сердца ученый развития Грант (12SDG12050083 г.д.), национальные институты здравоохранения (R21HL102773, R01HL118245 к г.д.) и Национальный научный фонд (CBET-1263455 и CBET-1350240 г.д.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PEG-диаакрилат (PEGDA)Laysan BioACRL-PEG-ACRL-3400также может быть синтезирован или приобретен у других продавцов. Можно использовать различные молекулярные массы.
Литий Фенил-2,4,6-триметилбензоилфосфинат (LAP)Синтезирован в лаборатории
ФибронектинCorning356008Могут использоваться другие белки прикрепления клеток, такие как ламинин, матригель
Фосфатно-солевой буфер (PBS)SigmaD8537-500ML
ФотошаблонFineLine Imagingn/aCustom печатает на прозрачных листах с высоким разрешением DPI.
Связующие зажимыРазличные поставщики
Компактный источник ультрафиолетового света (365 нм)UVPUVP-21Можно использовать другие источники ультрафиолетового света, требуется калибровка мощности.
2-иминотиолан (Пирс Траут ThermoSci.26101
Эллман s Реагент: DTNB; 5,5-дитио-бис(2-нитробензойная кислота)Thermo Sci.22582
эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVECs)Вчисло пассажей Lonza
EGM-2 MediaLonzaCC31-56, CC-3162EGM-2 без факторов роста. Для поддержания клеток использовалась полная среда EGM-2
0,25% трипсин, ЭДТАLife Tech25200-056
нейтрализатор трипсинаLife TechR-002-100
центрифугаразличные вендеры
гемоцитометрHausser Sci. Bright-line
этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)Sigma AldrichE6758
0,22&микро; m фильтрCell Treat229743
1 мл шприц
стеклянный микроскоп слайдыFisher Sci.12-550C
Пластиковые прокладкиРазличные вендерытолщиной 0,5 мм 70
% ЭтанолBICCA2546.70-1
Био-щитБио-щит19-150-0010
Брэдфорд Реагент BIO-RAD
Обессоливающая смола - Sephadex G-25GE Healthcare95016-754
Микроспиновые колонныThermo Sci.
AR-G2 rehometerTA Instruments
В экспериментах использовали экспериментах использовали между 6-10: , , , , , , PI69725

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yao, S., et al. Co-effects of matrix low elasticity and aligned topography on stem cell neurogenic differentiation and rapid neurite outgrowth. Nanoscale. 8 (19), 10252-10265 (2016).
  2. Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur Cells Mater. 18, 1-13 (2009).
  3. Ye, K., et al. Matrix Stiffness and Nanoscale Spatial Organization of Cell-Adhesive Ligands Direct Stem Cell Fate. Nano Lett. 15 (7), 4720-4729 (2015).
  4. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  5. Sridhar, B. V., Doyle, N. R., Randolph, M. A., Anseth, K. S. Covalently tethered TGF-beta1 with encapsulated chondrocytes in a PEG hydrogel system enhances extracellular matrix production. J Biomed Mater Res A. 102 (12), 4464-4472 (2014).
  6. Salinas, C. N., Anseth, K. S. Decorin moieties tethered into PEG networks induce chondrogenesis of human mesenchymal stem cells. J Biomed Mater Res A. 90 (2), 456-464 (2009).
  7. Joddar, B., Guy, A. T., Kamiguchi, H., Ito, Y. Spatial gradients of chemotropic factors from immobilized patterns to guide axonal growth and regeneration. Biomaterials. 34 (37), 9593-9601 (2013).
  8. Wylie, R. G., Ahsan, S., Aizawa, Y., Maxwell, K. L., Morshead, C. M., Shoichet, M. S. Spatially controlled simultaneous patterning of multiple growth factors in three-dimensional hydrogels. Nat Mater. 10 (10), 799-806 (2011).
  9. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
  10. Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nat Biotechnol. 23 (1), 47-55 (2005).
  11. Saik, J. E., Gould, D. J., Keswani, A. H., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic hydrogels with immobilized ephrinA1 for therapeutic angiogenesis. Biomacromolecules. 12 (7), 2715-2722 (2011).
  12. McCall, J. D., Anseth, K. S. Thiol-ene photopolymerizations provide a facile method to encapsulate proteins and maintain their bioactivity. Biomacromolecules. 13 (8), 2410-2417 (2012).
  13. Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 29 (6), 997-1003 (2009).
  14. Zuidema, J. M., Rivet, C. J., Gilbert, R. J., Morrison, F. A. A protocol for rheological characterization of hydrogels for tissue engineering strategies. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 102 (5), 1063-1073 (2014).
  15. Truat's Reagent Instructions. Thermo Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/.../MAN0011238_Trauts_Reag_UG.pdf (2017).
  16. Ellman's Reagent Instructions. Thermo Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011216_Ellmans_Reag_UG.pdf (2017).
  17. Desalting Columns. GE Life Sciences. , Available from: https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1478781880316/litdoc52130800_2016111034421.pdf (2017).
  18. Quick State Bradford Reagent Protein Assay, Instruction Manual. Bio-Rad. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4110065A.pdf (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

127photopatterningbioconjugation

Related Articles