Нынешний метод служит для идентификации изоформы специфичные Ингибиторы гистоновых комплексы (HDAC) в клетки HeLa UHPLC-MS анализ нескольких субстратов. Это антитела, свободной метод разработан для отражения активности HDAC1 и HDAC6 в живых клеток окружающей среды, в отличие от одного изоформы клеток бесплатные анализы.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Одновременное измерение HDAC1 и HDAC6 активности в НеЬа клетки с помощью UHPLC-MS
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Поиск новых Ингибиторы гистоновых деацетилаз (ГДАЦ) имеет повышенный интерес в лекарственных препаратах. Избирательность изоформы был в центре внимания после утверждения romidepsin, класс я HDAC ингибиторов для терапии рака и клиническое исследование HDAC6-специфические ингибиторы множественной миеломы. Нынешний метод используется для определения ингибиторная активность соединений тест на HDAC1 и HDAC6 в клетках. Изоформы активность измеряется с помощью жидкостной хроматографии ультра-высокой производительности – масс-спектрометрия (UHPLC-МС) анализ конкретных субстратов, инкубировали с обработанных и необработанных НеЬа клетки. Этот метод имеет преимущество отражающие действие эндогенного HDAC в среде клетки, в отличие от свободных клеток биохимических анализов, проведенных на отдельных изоформ. Кроме того потому что он основан на количественной оценке синтетических субстратов, метод не требует признания антитела эндогенного ацетилированный белков. Он легко адаптируется к несколько клеточных линий и автоматизированный процесс. Этот метод уже оказался полезным в поиске HDAC6-селективные соединений в нейробласты. Представитель результаты отображаются здесь с стандартным HDAC ингибиторов трихостатин (неспецифические), MS275 (HDAC1-специфические), и tubastatin (HDAC6-специфические) с использованием клеток HeLa.
Введение
Гда принадлежат к семейству ферментов, возможность deacetylate гистонами в структуре хроматина. Они также имеют другие белковых субстратов в цитозоле и расположены в различных клеточных компартментов. В общей сложности 18 HDAC изоформ до настоящего времени были определены и были связаны с нескольких клеток механизмов, включая регулирование факторов транскрипции и экспрессии генов, а также сигнализации ячейки и транспорта1,2,3,4,5,6,7. Кат....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. клеточная культура
Примечание: Следующие шаги выполняются в стандартной культуры ткани капюшоном. Знакомство с стерильных ожидается.
- Культура клетки HeLa в 80% confluency в колбе культуры клеток T75 в MEM, дополнена 10% плода бычьим сывороточным, пенициллина G (100 ед/мл) и стрептомицин (100 мг/мл).
Примечание: Культуры клеток, лечение и лизис шаги проводятся под ламинарным потоком, с шагов инкубации клеток при 37 ° C, в атмосфере увлажненные 5% CO2 в стерильных условиях. - Вымыть клетки дважды с 5 мл DPBS, аспирационная DPBS и добавьте 1 mL реагента диссоциации клеток. Инкубируйте при 37 ° C за 5 мин до....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Чтобы продемонстрировать применение метода для выявления неизбирательной и выборочной ингибиторов для HDAC1 (класс I) и HDAC6 (класс IIb), клетки НеЬа были относиться с известных стандартных соединений: трихостатин A (неизбирательной между HDAC1 и HDAC6)18, MS275 (HDAC1-селективный ингибитор)19и tubastatin (HDAC6-селективный ингибитор)20. При использовании нынешнего метода (рис. 1), IC
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Ингибирование HDAC является горячей темой в лекарственных препаратах, с текущей упором на HDAC6-селективных ингибиторов для рака терапии21. HDAC селективность обычно оценивается серия высокой пропускной способностью, клетки бесплатные анализы, которые намерены определить ингибирующее потенции к отдельных изоформ HDAC21. Однако, избирательность ингибитор должна быть дополнительно подтверждена в живых клетках оценки состояния ацетилирования эндогенного белка субстратов, напри.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Авторы признают стоимость действий CM1406 (эпигенетическими химической биологии). Исследования в этой публикации была поддержана Фондом Пьер Мерсье.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| BATCP | Sigma-Aldrich | B4061 | |
| MAL | Sigma-Aldrich | SCP0168 | Синоним: BOC-Ac-Lys-AMC |
| MOCPAC | Sigma-Aldrich | M2195 | |
| MS275 | Sigma-Aldrich | EPS002 | |
| Трихостатин A | Sigma-Aldrich | T8552 | |
| Тубастатин A | Sigma-Aldrich | SML0044 | |
| Ацетонитрил, ВЭЖХ класса | Fisher Scientific | 10660131 | |
| Муравьиная кислота, LC/MS класса | Fisher Scientific | 10596814 | |
| H2O, дистиллированный ВЭЖХ | дистиллированный H2O, отфильтрованный через систему очистки Milli-Q | ||
| HeLa клетки | ATCC | ATCC CRM-CCL-2 | |
| Диссоциация клеток реактив TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12604013 | |
| DMSO, клеточная культура сорта | Applichem | 146463 | |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| Фетальная бычья сыворотка | Biowest | S1810 | |
| MEM | ThermoFisher Scientific | 22561021 | |
| Пенициллин-стрептомицин | Bioconcept | 4-01F00-H | |
| 10x RIPA буфер | Abcam | ab156034 | |
| SigmaFast таблетки ингибитора протеазы | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| 96-луночные планшеты, стерильные, плоскодонные, обработанные культурой тканей Corning | VWR | 29442-058 | |
| 96-луночные планшеты, нестерильные, V-образное дно Corning | VWR | 29442-404 | используемые на этапе центрифугирования |
| 96-луночный планшет, коническое дно, Nunc | ThermoFisher Scientific | 249944 | совместимый с системой Acquity UHPLC |
| T75 колбы для клеточных культур Corning | Sigma-Aldrich | CLS430641 | |
| Отслаиваемая термосвариваемая фольга | Waters | 186002789 | |
| Acquity UPLC система | Waters | ||
| Eppendorf Centrifuge 5810 R | Fisher Scientific | 05-413-323 | |
| Интеграционное программное обеспечение: MassLynx V4.1 | Воды | Каталожный номер отсутствует | |
| Термогерметик Combi SP-0669/240 | Воды | Каталожный номер отсутствует | |
| Quattro micro API Tandem Quadrupole System | Каталожный номер | воды |
Ссылки
- Arrowsmith, C. H., Bountra, C., Fish, P. V., Lee, K., Schapira, M. Epigenetic protein families: a new frontier for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 11 (5), 384-400 (2012).
- Henikoff, S., Greally, J. M. Epigenetics, cellular memory and gene regulation. Curr Biol. 26 ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
