Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Исследование взаимодействий протеин протеина в Autophagy исследований

8.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55881

⸱

9 сентября 2017 г.

 ,  ,  , 
1Molecular Biology, Genetics and Bioengineering Program, Sabanci University, 2Information Center, Sabanci University, 3EFSUN, Center of Excellence for Functional Surfaces and Interfaces for Nano Diagnostics, Sabanci University

В этой статье

Краткое содержание

Представленные здесь являются два методы исследования взаимодействия на основе антител протеин: иммунофлюоресценции и иммунопреципитации. Эти методы подходят для изучения физических взаимодействий между белками для обнаружения новых компонентов клеточной сигнальных путей и понимание динамики белков.

Аннотация

Белок белковых взаимодействий являются важными для понимания сотовой сигнальных каскадов и выявления роман путь компонентов и динамики белков. Большая часть клеточной деятельности требует физических взаимодействий между белками. Для анализа и сопоставления этих взаимодействий, были разработаны различные экспериментальные методы, а также инструментов биоинформатики. Autophagy является сотовых рециркуляции механизм, который позволяет справиться с различными раздражители, включая лишение питательных веществ, химических веществ и гипоксии клетки. Чтобы лучше понять сигнализации событий, связанных с autophagy и обнаружить новые факторы, которые регулируют белковых комплексов в autophagy, мы провели экранов взаимодействия протеин протеина. Проверка этих результатов скрининга требует использования иммунофлюоресценции и методы иммунопреципитации. В этой системе, были протестированы конкретных связанных с autophagy белок белковых взаимодействий, которые мы обнаружили в Neuro2A (N2A) и HEK293T клеточных линий. Подробная информация о технических процедур, используемых описаны в этом документе визуализированных эксперимент.

Введение

Macroautophagy (autophagy, здесь) представляет собой механизм клеточного стресса характеризуется поглощение сыпучих цитоплазмы, белков и органеллы в двойной мембраной пузырьков называется autophagic везикулы. Через слияние внешнего слоя двойной мембраной autophagic везикулы и их грузы доставляются лизосом и деградированных нем1. Autophagy происходит низкими базальный во всех типах клеток и во всех организмах, выполняя гомеостатических функций, таких как деградации белка и органелл (например, митохондрии) оборот. В условиях, ведущих к клеточного стресса, таких, как голод autophagy быстро upregulated и позволяет ячейки для поддержания уровней энергии и основного обмена1,2,3.

Около 30 autophagy гены клонировали от дрожжей и их белковых продуктов были показаны играть роль на различных этапах процесса autophagic, включая везикул нуклеации, расширение, везикул фьюжн конце endosome/Лизосома, и деградация грузов 4 , 5. были выявлены Ортологи большинства этих генов и исследования в различных организмах подтвердил сохранение их клеточных функций6. Исследования в течение последнего десятилетия показали, что несколько autophagy связанных белковых комплексов и белок белковых взаимодействий существуют и что они управляют autophagy пути замысловатые и контролируемым образом. Перекрестки, резервные копии, механизмы обратной связи и прямой существуют, и они позволяют ячейку для координации autophagy с другими мероприятиями (например, везикулярной секреции, лизосома биогенеза, от англ сортировки и транспорта7и т.д.) В беспристрастной дрожжей два гибридных экране с помощью белка autophagy ATG5 как приманку (ATG5 является ключевой autophagy белка участвуют в системе спрягать E2-как, которая опосредует LC3 lipidation в голода индуцированной autophagy), мы определили рецепторов активировано C-киназы 1 (RACK1; GNB2L1) как сильный элемент и Роман autophagy компонент8. Важно отметить, что экран показал, что ATG5-RACK1 взаимодействие незаменимым для индукции autophagy, autophagy классических индукторов (то есть, голода и mTOR торможения).

Методы, основанные на иммунофлюоресценции обычно используются для отслеживания взаимодействий протеин протеина. Эти методы основаны на основном антитела и помочь визуализировать взаимодействие и подтвердить клеточной локализации. В этой технике, флуоресцентные метки конъюгированных антител, которые являются специфическими для протеинов интереса, обычно используются для специфического окрашивания. Каждый белка могут быть помечены с антителами, в сочетании с различными флуоресцентными красителями. С помощью белка специфические антитела, дублирование сигнала при слиянии изображения указывает Сопредседатель Локализация белков под confocal микроскопии. Этот метод применим к клетки или даже ткани. Методы иммунофлуоресценции предоставляют подсказки о взаимодействия динамики и помочь определить размер и распределение белковых комплексов, отслеживая общие изменения в клеточной морфологии под различные условия9. Иммунопреципитация-это другой часто используемый на основе антител метод, который позволяет для анализа взаимодействий между учетом белков10. Используя эту технику, протеинов интереса изолированы от клеток или тканей выдержки, с использованием специфических антител, в результате осаждения белков, которые в комплексе или в контакте с протеином интереса. Co Иммунопреципитация, где обнаружен белок и его Сопредседатель интерактивных, показывает не только взаимодействие между двумя белками, но можно измерить его сила взаимодействия при различных обстоятельствах11.

Этот протокол описывает в детали ключевых методов, которые были использованы для подтверждения и характеризуют ATG5-RACK1 и RACK1-LC3 взаимодействия. Основное внимание уделяется иммунофлюоресценции и иммунопреципитации техники, с уделением особого внимания критических шагов и ловушки для autophagy исследований, а также устранение неполадок предложения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. иммунофлюоресценции

  1. поддерживать HEK293T человеческих эмбриональных почек клеток в среде DMEM высокой глюкозы, и N2A мыши neuroblast клеток в среде DMEM низкий средний глюкозы, 5% CO 2-увлажненные инкубатора 37 ° c. Дополнение к культуре СМИ с 10% тепло инактивированная плода говядину (ФБС) сыворотки, антибиотики (50 ед/мл пенициллин, стрептомицин 50 мкг/мл) и L-глютамин (2 мм).
  2. Отсоедините клетки с помощью трипсин 0.25%. Сначала удалите носители культуры клетки затем вымыть клетки с 10 мл стерильной фосфат амортизированное saline (PBS) и инкубировать 1 мл трипсина при 37 ° C за 5 мин неактивным трипсина, добавив 2 мл DMEM среднего.
  3. Мыть плиты хорошо закупорить. Удаление 10 мкл раствора клеток и смешайте его с 10 мкл Трипановый синий. Подсчитать количество живых клеток с помощью Горяева.
  4. Как HEK293T и N2A адэрентных клеток линии, однако, HEK293T клетки отсоединить от пластины легко. Таким образом, при работе с HEK293T клеточной линии, пальто coverslides с стерильной фильтрации 0,01% поли L-лизин до заполнения ячеек.
    1. Стерильный coverslides место в 10 см Петри. Добавьте соответствующее количество поли L-лизин раствор на каждом coverslide. Инкубировать coverslides раствором поли L-Лизин для 10 мин
    2. Удаление решения поли L-лизин.
      Примечание: Поли-L-лизин многоразового использования; Это необязательно собирать и использовать его для дальнейших экспериментов. Так как поли L-лизин является токсичным, подождать, пока все решения на coverslides полностью испаряется, а затем восстановить поли L-лизин.
    3. Мыть coverslides с стерильных PBS.
  5. Добавьте 1 mL DMEM в каждой скважине 12-ну плиты. Место coverslide в каждой скважине.
  6. 20 000 семян клеток/Ну, по капле при встряхивании пластину в то же время обеспечивает однородность распределения клеток на coverslides. Держите клетки в CO 2 инкубатора при 37 ° C и добавить препарат таким образом, чтобы общая инкубации время не превышает 48 часов, т.е., 3 ч лечения Торин, добавить препарат на 45 h пост посева. Исследования взаимодействия
    1. для RACK1-LC3, Торин 1, rapamycin и голод были использованы в качестве индукторов autophagy. Клетки инкубировали с Торин 1 для 3 h (250 Нм конечная концентрация); с rapamycin для 16 h (200 Нм конечная концентрация); и с Эрл ' s сбалансированный соли раствора (EBSS) за 2 ч для того чтобы голодать клетки.
      Примечание: Инкубации в среде DMEM с 10% FBS была использована как условие управления.
  7. После 48 ч инкубации общего времени, удалите средства массовой информации на coverslides и мыть их с 1 мл PBS.
    8. Инкубировать
  8. исправить клетки, клетки с 1 мл льда холодного стерильного отфильтрованного 4% параформальдегида (PFA) в PBS (рН 7,4), 1 x 20 мин при комнатной температуре без каких-либо агитации.
    Так как PFA чувствительны к свету, держите (важно) пластины в темноте в инкубационный период; пластина с алюминиевой фольги может помочь. Кроме того, PFA является токсичным, таким образом, работать под вытяжной шкаф при фиксации клетки.
    Примечание: Имейте в виду, что фиксация шагом в иммунофлуоресценции эксперименты должны быть оптимизированы, как специфические антитела могут работать лучше с помощью фиксации различных агентов и условий.
  9. После 20 мин PFA инкубации, сначала удалите PFA решения на coverslides и затем вымыть каждый образец 3 раза с 1 мл стерильного отфильтрованного PBS. На этот шаг, (важно) промыть скважин по одному чтобы не позволить им высохнуть. Избегайте сушки, поскольку он будет вмешиваться с последующей реакции клеток, изменить морфологию клеток и увеличить неконкретные сигналы.
  10. После мытья, сохранить образцы в 1 мл PBS на ДВС.
  11. Подготовить блокирующие решение: PBS с 0.1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) и 0,1% сапонинов.
  12. Крышка 6-колодец с парафином фильм. Убедитесь, что нижней пластины гладкой после покрытия фильм парафин. Ярлык пластину 6-а.
  13. С помощью пинцета, передачи coverslides из 12-ну пластины 6-ну пластины покрыты пленкой парафин.
  14. Отменить PBS на coverslides и 100 мкл преграждая разрешение на каждом coverslide для permeabilization. Проинкубируйте образцы на льду на 30 мин
  15. Подготовить основное антитело блокирует решение. До экспериментов, оптимизировать разбавления антитела для определения лучших рабочей концентрации для пятнать.
    Примечание: например, антитела LC3 используется при разбавлении 1: 100 в преграждая разрешение.
  16. После 30 минут инкубации, отказаться от блокирования решения и один раз мыть образцы нежно с 1 мл раствора PBS.
  17. Добавить 100 мкл раствора первичного антитела к каждому coverslide. Проинкубируйте образцы при комнатной температуре за 1 ч, на шейкере.
    Примечание: Время инкубации с основное антитело должны быть оптимизированы. В зависимости от антител ночь инкубации при температуре 4 ° C может быть предпочтительным. Это лучше для инкубации на шейкер мягко (100 вращ. / мин) чтобы равномерно распределить антител на coverslides.
  18. После инкубации с основного антитела, стирать образцы индивидуально, 3 раза с 1 мл PBS.
  19. Подготовить 1: 500 вторичное антитело в блокировании решение (оптимизации разведений вторичные антитела могут потребоваться). Здесь, 568 Fluor Alexa IgG против кролик был использован в качестве вторичного антитела анти кролик.
    1. Проинкубируйте образцы с 100 мкл раствора вторичное антитело для 1 ч при комнатной температуре на шейкер. Поскольку Флюорофор меченых вторичные антитела являются чувствительными к свету, (важно) Держите решение в темноте. Поместите образцы в темноте, во время и после инкубации вторичное антитело.
  20. После вторичное антитело инкубации, промойте пластины 3 раза с PBS.
    Примечание: Baed опыт, некоторые антитела имеют высокий фон сигналы, которые не могут быть устранены путем PBS моет. Если дело с антителом после шага 1.21, сохраняя образцы в PBS на 4 ° C для 6 h может помочь.
    1. В случае необходимости, запятнать клетки с ДНК связывающих красителя, например Hoechst, чтобы отметить ядер.
  21. Пятно более чем одного белка, применить ту же процедуру, начиная с шага 1.16 для второй белок.
    1. Убедитесь, что нет никаких видов реактивности между антител при выполнении окрашивание с более чем одного антитела (например, использование мыши и кролик антител).
      Примечание: Здесь, RACK1 окрашенные как второй белок с помощью первичных антител анти RACK1 и анти мыши вторичные антитела IgG Alexa Fluor 488 же концентрации, упомянутых выше.
  22. Подготовить решение монтажа: 50% глицерина в однократном ПБС. Фильтр через фильтр 22 мкм.
  23. Протрите слайды с этанолом, с помощью безворсовой wipe и добавить 10 мкл монтажа решение для каждого слайда. Используя пинцет, место coverslides на каждый dropso, что сторона с клетками находится в прямом контакте с носителем установки. Отменить решение избыток монтажа, аккуратно с помощью безворсовой салфетки.
  24. Уплотнение coverslides с прозрачным лаком. Во-первых, стабилизировать coverslides, добавляя капли лак по краям 4 и затем запечатать их полностью.
  25. Анализ образцов под люминесцентные или Конфокальный микроскоп как можно скорее, поскольку флуоресцентного сигнала могут отбеливать через несколько часов.
< класс p = «jove_title «> 2. Иммунопреципитация

  1. отсоединения и количество ячеек, как описано в шагах 1.2 и 1.3.
  2. При работе с HEK293T клетками, семян 4 миллионов клеток для каждого условия в чашках Петри 15-см. При работе с N2A клетки, семян 5 миллионов клеток в чашках Петри 15 см. Инкубировать клетки в инкубатор CO 2 при 37 ° C до конца эксперимента.
  3. Лечения клетки с соответствующими препаратами или условия на определенный срок, так что время общая инкубации клеток не превышает 48 ч.
    Примечание: Для иммунопреципитации тестов в этом исследовании, клетки лечили 3 часа с 1 Торин (250 Нм), 16 h с rapamycin (200 Нм) и 2 h с EBSS. DMEM с 10% FBS был добавлен к ячейкам элемента управления.
  4. После 48 ч инкубации общего времени, удалите средства массовой информации и урожай клетки. Поскольку HEK293T клетки легко отсоединить от плиты, мытье пластину с льдом холодной PBS может быть достаточным для уборки. Однако N2A клетки более устойчивы к отряда; использовать ячейки скребки для сбора клеток.
    1. Собрать все клетки в пробирках microcentrifuge.
  5. Образцы центрифуги g 16000 x 15 мин на 4 ° C. удалить супернатант и мыть лепешка с 1 мл PBS приостановив его повторно, закупорить.
  6. Повторите центрифуги, но в самую высокую скорость центрифуги на 4 ° C на 15 мин удалить супернатант.
  7. Подготовить радио иммуно-осадков Assay (RIPA) буфера до начала эксперимента.
    Примечание: Существует 3 типа Буфер RIPA; Выберите по интенсивности взаимодействия белков, расследуются (см. ниже формулы).
    1. Если есть сильный протеин взаимодействия, выбрать регулярные Буфер RIPA.
    2. Если взаимодействие слабых, выбрать мягкий RIPA или мягкий RIPA.
      Примечание: Рецепты этих буферов находятся в следующих шагах. Все буферы, которые используются в иммунопреципитации тесты должны дополняться ингибиторов протеазы.
      1. Готовить регулярные Буфер RIPA, с использованием 1% NP-40, 150 мм NaCl, Дезоксихолат натрия 0,5% и 0,1% натрия Додециловый сульфат 50 мм трис рН 8.
      2. Подготовить мягкая Буфер RIPA, используя Дезоксихолат натрия 1% NP-40, 150 мм NaCl и 0,25% в 50 мм трис pH 7.5.
      3. Подготовить мягче Буфер RIPA, с использованием 1% тритон-X 100, 137 мм NaCl, 1% глицерина и 1 мм Ортованадат натрия в 50 мм трис рН 7,4.
  8. Выбрав соответствующий буфер RIPA, дополнение буфер с ингибиторами протеаз (RIPA +). Затем, Лизируйте клетки с 3 x объем ячейки Пелле в RIPA +.
  9. Водоворот подвеска для 15 s. держать его на льду за 5 мин повторить вихря и обледенения 5 раз и затем Центрифугуйте образцы на 16000 x g 15 мин на 4 ° C.
  10. Передачи супернатант чистой microcentrifuge трубки и центрифуги для удаления остатков клеток мусора. Передавать чистый трубки супернатант.
  11. Развести белка лизатов 1:50 и подготовить 96-луночных пластины с пустым и стандартов. Развести образцы.
    1. Mix образцы с Брэдфорд раствор 1:20. Инкубируйте 15 мин в темноте.
    2. Измеряют оптическую плотность на 595 Нм длины волны. Рассчитать концентрацию протеина, с помощью оптической плотности значений для каждой выборки.
  12. За день до уборки клеток, пара белков плюс бусины с антителами, которые являются специфическими для протеина интереса.
    1. Край кончик 200 мкл, ножницами вырезать и использовать 25 мкл из бисера пульпы для каждого условия.
    2. Мыть бусины с 1 мл PBS, раз с 1 мл Буфер RIPA и один раз с 1 мл RIPA +. Выполнить шаги мыть на 3300 x g, 4 ° C в течение 1 мин
    3. После последнего мыть, 300 мкл RIPA + на бисер и добавить 1,5 мкг антитела, относящиеся к белка, чтобы быть снесены.
    4. Инкубировать трубы на ночь при 4 ° C на вращателе (20 вращ. / мин).
      Примечание: Здесь, ATG5 был immunoprecipitated, с использованием конкретных анти ATG5 антител с.
  13. После ночи инкубации бусы с антителом, мыть бусины раз с PBS, один раз с RIPA и один раз с RIPA +, как описано в шаге 2.12.2.
  14. Добавить 2 мг белка lysate на бусы для каждого состояния и завершить общий объем до 300 мкл с RIPA + трубки буфера. Инкубируйте трубы на ночь на вращателе на 4 ° C.
  15. После инкубации, мыть как описано бусины (шаг 2.12.2).
    1. После последнего мыть, использовать меньше наконечник пипетки для удаления всех супернатант без касатьться бисер.
    2. Добавить 10 мкл 3 x загрузки краска: 6% SDS, 30% глицерина, β-меркаптоэтанол 16% и 0,1% бромфеноловый синий в 1 М трис-HCl pH 6.8.
  16. Подготовить элементы управления вводом, используя по меньшей мере 100 мкг белка lysate для каждого условия. Выравнивают образец томов с помощью воды и добавить соответствующий объем 3 x загрузки красителя.
  17. Образцы кипения при 95 ° C на 10 мин
    Примечание: Обычно при кипячении образцы, колпачки трубы можно открыть спонтанно и образцы будут потеряны. Избежать этого, удерживая шапки, закрыт с блокатор конкретных Кап.
  18. Спин вниз образцов и нагрузки на гелях SDS-PAGE чтобы отделить протеины по их размерам, с использованием стандартных протоколов.
    Примечание: В этом исследовании на RACK1 и ATG5, образцы были запустить через 12% полиакриламидных гелей на 80 V для 30 минут, а затем на 120 V приблизительно 90 мин. Однако, для небольших белки, например LC3, с использованием полиакриламидных гелей на 15% больше подходит.
  19. После завершения, гель работает передача белков на нитроцеллюлозные или PVDF мембраны, либо методом мокрой или полусухой передачи. Затем, блокировать мембраны, инкубации в 5% обезжиренное молоко в PBS с 0,05% анимации 20 (PBST) при комнатной температуре в течение 1 ч. мыть мембраны 3 раза с PBST на 5 мин
  20. Инкубации мембран с первичных антител в рабочих концентрациях за 1 ч при комнатной температуре. Для разведения основное антитело, Используйте BSA, содержащие красный решения (5% BSA Кона V дроби, азид натрия 0,02% в PBST, рН 7,5; добавить фенола Красного добавлены как маркер рН) чтобы разрешить повторное использование антител.
    Примечание: например, развести ATG5 антитела 2000 x в красный решения.
    1. В конце время инкубации, мыть мембраны 3 раза с PBST.
  21. Инкубации мембран с ПХ конъюгированных вторичные антитела, которые были подготовлены в раствор 5% обезжиренное молоко (здесь, анти кролик IgG в также использовался). Затем вымойте мембраны 3 x с PBST на 5 мин
  22. Сделать решение ECL: luminol 25 мм, 9 мм кумариновая кислота, 3 x 10 -4% H 2 O 2 в 70 мм трис-HCl рН 8,8. Используйте свежие H 2 O 2 для каждого эксперимента.
    Примечание: Реакция начинается после H 2 < /sub > O 2 сложения и он продолжает на около 20 мин.
    1. Инкубации мембран и рентгеновские пленки для 20 мин в стэк. Разработать и исправить их в темной комнате.
  23. Для проверки co иммунопреципитация белков с close или перекрывающихся молекулярным весом, может быть необходимо лишить антитела от мембраны, инкубации мембран при 60 ° C на 30 мин в буфере зачистки: (25 мм трис-HCl рН 2 и 1% SDS).
  24. Повторите шаги 2.20 в 2.23 для проверки co иммунопреципитация, с использованием различных антител. Например после обнаружения ATG5 и зачистки мембран, RACK1 белка был протестирован на же мембраны, с использованием основного антитела анти RACK1 (1:1, 000) и вторичные антитела (1:10 000). Β-актина был использован в качестве элемента управления загрузкой; и IgG сигнал был использован как контроль погрузки для образцов immunoprecipitated.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В Рисунок 1 пример совместного локализации отображается результат, полученные с помощью этого протокола. Фигура из нашей недавней работе представлен8. Здесь эндогенного белка RACK1 был окрашенных в зеленый цвет, в то время как эндогенных LC3 был окрашенных в красный цвет. Желтые точки, которые наблюдаются в Объединенном фотографии указывают места перекрытия между зеленый и красный сигналы. Таким образом желтые точки представляют собой частичное совместное локализации ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Методы иммунопреципитации и иммунофлюоресценции имеют решающее значение для изучения взаимодействий протеин протеина. Хотя эти две техники широко используются и устоявшейся, некоторые критерии должны рассматриваться для определения качества экспериментов при использовании этих методов.

Во-первых, первичного антитела, которые используются в этих испытаний должны быть конкретными для протеинов интереса. Для обеспечения этого, используйте индуцируемый нокдаунов или нокаут клетки для тестирования ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана науки и технологических исследований Совет Турции (ТУБИТАК) 1001 Грант 107T153, университета Сабанчи. SEB и НМК поддерживаются TUBITAK BIDEB 2211 стипендии кандидат исследований.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Решение Trypsin EDTA ABiological Industries BI03-050-1A
PBSGE HealthcareSH-30256.01
DMEM (с высоким содержанием глюкозы)Sigma 5671
DMEM (низкий уровень глюкозы)Sigma5546
Trypan BlueSigmaT8154
ГемоцитометрSigmaZ359629-1EA
обложкиJena BioscienceCSL-103
слайдыIsolabI.075.02.005
Поли-L-лизинSigma P8920
Torin Tocris4247
DMSOSigmaVWRSAD2650
EBSSBiological Industries BI02-010-1A
Параформальдегид (PFA)Sigma15812-7
BSASigma  A4503
СапонинSigma84510
LC3 АнтителоSigmaL7543
Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 568  Антитело InvitrogenA11011
RACK1Santa Cruz Biotechnology  sc-17754
Антимышиный IgG Alexa Fluor 488  InvitrogenA11001
NP-40АпплименемA16694.0250
Аппличемхлорида натрияA9242.5000
Дезоксихолат натрияSigma30970
Додецилсульфат натрия (SDS)BiochemikaA2572
Тризма БазаSigmaT1503
Triton-X Апплимен4975
Ортванадат натрияSigma450243
антитело ATG5SigmaA0856
ГлицеринАпличемA4453
&бета;-Меркаптоэтанол АпплименемA1108.0250
Бромфенол синий АпплименемA3640.0005
Обезжиренное молокоАпличемA0830
Tween 20SigmaP5927
Азид натрияRiedel de Haen13412
Phenol red Sigma114537-5G
против кролика IgG, HRP конъюгированныйJackson Immuno.
ЛюминолFluka9253
Кумериновая кислотаSigmaC9008
Перекись водородаMerckK35522500604
антимышиный IgG, HRP конъюгированныйJackson Immuno.115035003
&бета;-Антитела к актинуSigma A5441
Нормальная сыворотка кроликаSanta Cruz Biotechnologysc-2027
РапамицинSigma  R0395
Белок А-агарозные бусиныSanta Cruz Biotechnologysc-2001
фетальная бычья сыворотка BiowestS1810-500
раствор пенициллина/стрептомицинаBiological Industries 03-031-1B
L-глутамин Биологическая промышленность BI03-020-1B
Bradford Solution Sigma6916
Мембрана из нитоцеллюлозыGE HealthcareA10083108
рентгеновские пленкиFujifilm47410 19289
Ингибитор протеазыSigmaP8340
1110305144

Ссылки

  1. Oral, O., Akkoc, Y., Bayraktar, O., Gozuacik, D. Physiological and pathological significance of the molecular cross-talk between autophagy and apoptosis. Histol Histopathol. 31, 479-498 (2016).
  2. Korkmaz, G., Tekirdag, K. A., Ozturk, D. G., Kosar, A., Sezerman, O. U., Gozuacik, D. MIR376A is a regulator of starvation-induced autophagy. PLoS One. 8, e82556(2013).
  3. Itah, Z., et al. Hydrodynamic cavitation kills prostate cells and ablates benign prostatic hyperplasia tissue. Exp Biol Med (Maywood). 238, 1242-1250 (2013).
  4. Gozuacik, D., Kimchi, A. Autophagy as a cell death and tumor suppressor mechanism). Oncogene. 23, 2891-2906 (2004).
  5. Erzurumlu, Y., Kose, F. A., Gozen, O., Gozuacik, D., Toth, E. A., Ballar, P. A unique IBMPFD-related P97/VCP mutation with differential binding pattern and subcellular localization. Int J Biochem Cell Biol. 45, 773-782 (2013).
  6. Kuzuoglu-Ozturk, D., et al. Autophagy-related gene, TdAtg8, in wild emmer wheat plays a role in drought and osmotic stress response. Planta. 236, 1081-1092 (2012).
  7. Longatti, A., Tooze, S. A. Vesicular trafficking and autophagosome formation. Cell Death Differ. 16, 956-965 (2009).
  8. Erbil, S., et al. RACK1 Is an Interaction Partner of ATG5 and a Novel Regulator of Autophagy. J Biol Chem. 291, 16753-16765 (2016).
  9. Gozuacik, D., Yagci-Acar, H. F., Akkoc, Y., Kosar, A., Dogan-Ekici, A. I., Ekici, S. Anticancer use of nanoparticles as nucleic acid carriers. J Biomed Nanotechnol. 10, 1751-1783 (2014).
  10. Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiol Rev. 59, 94-123 (1995).
  11. Uetz, P., et al. A comprehensive analysis of protein-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Nature. 403, 623-627 (2000).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Метод иммунопреципитацииметод иммунофлуоресценцииконфокальная микроскопиявестерн-блот-анализклеточная линия HEK293Tклеточная линия N2Aметод Брэдфордэлектрофорез в ПААГ с SDS
Исследование взаимодействий протеин протеина в Autophagy исследований
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.