Методическая статья

Время-замедление конфокальной визуализации мигрирующих нейронов в органотипической культуре срезов мозга эмбриональной мыши с использованием

11K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55886

⸱

25 июля 2017 г.

 ,  ,  , 
1Institute of Molecular and Cellular Anatomy, Ulm University

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол содержит инструкции по прямому наблюдению радиально мигрирующих кортикальных нейронов. При внутриутробной электропорации органотипическая культура срезов и временная конфокальная визуализация объединяются для непосредственного и динамического изучения эффектов избыточной экспрессии или снижения регуляции генов, представляющих интерес в мигрирующих нейронах, и анализа их дифференциации во время развития.

Аннотация

В утробе электропорация представляет собой быстрый и мощный подход к изучению процесса радиальной миграции в коре головного мозга развивающихся эмбрионов мыши. Это помогло описать различные этапы радиальной миграции и характеризовать молекулярные механизмы, контролирующие этот процесс. Чтобы напрямую и динамически анализировать миграционные нейроны, их нужно отслеживать с течением времени. В этом протоколе описывается рабочий процесс, который сочетается в электропорации с маточно- органическим строением с органотипической культурой срезов и временным конфокальным отображением, что позволяет провести прямой анализ и динамический анализ радиально мигрирующих кортикальных нейронов. Кроме того, возможна подробная характеристика мигрирующих нейронов, таких как скорость миграции, профили скорости, а также изменения радиальной ориентации. Этот метод может быть легко адаптирован для проведения функционального анализа генов, представляющих интерес для радиально мигрирующих корковых нейронов, путем потери и усиления функции, а также спасательных экспериментов. Промежуток времениВизуализация мигрирующих нейронов - это современная техника, которая когда-то была создана, является мощным инструментом для изучения развития коры головного мозга в моделях нейронов миграции мышц.

Введение

Неокортекс является основным сайтом когнитивных, эмоциональных и сенсомоторных функций. Он состоит из шести горизонтальных слоев, ориентированных параллельно поверхности мозга. Во время развития клетки-предшественники в боковой стенке дорсального telencephalon приводят к появлению проекционных нейронов, которые мигрируют радиально к поверхности пиала и приобретают характер нейронов типа типа. После генерации в желудочковых / субвентрикулярных зонах (VZ / SVZ) эти нейроны становятся кратковременно многополярными и замедляют их миграцию. После короткого пребывания в промежуточной зоне (IZ) они переключаются на биполярную морфологию, прикрепляются к радиальному глиальному каркасу и продолжают радиально ориентированную миграцию в кортикальную пластинку (СР). По достижении конечной целевой проекции нейроны отделяются от процессов радиального глиального процесса и приобретают специфическую для слоя идентичность. Мутации в генах, влияющих на различные стадии миграции нейронов, могут вызывать сильную кортикальную мальформацию, такую ​​как lissencEphaly или гетеротопия белого вещества 1 , 2 .

В утробе электропорация является быстрой и мощной методикой для трансфекции нейронных клеток-предшественников в развивающемся мозге эмбрионов грызунов 3 , 4 . С помощью этой методики можно подвергать нокдаун и / или сверхэкспрессировать гены, чтобы изучить их функции в развитии нейронов. Этот метод специально помог описать морфологические детали и характеризовать молекулярные механизмы процесса радиальной миграции 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Радиально мигрирующие нейроны подвергаются динамическим изменениям в форме клеток, скорости миграции, а также миграционному направлению, которые требуют постоянного и непрерывного наблюдения с течением времени. Органотипический кусочекПовторное и временное конфокальное изображение электропористых головных мозгов позволяют непосредственно наблюдать миграционные нейроны с течением времени. Используя этот комбинированный подход, можно проанализировать отдельные особенности мигрирующих нейронов, которые невозможно исследовать в фиксированных участках ткани электропористых головных мозга.

Недавно мы применяли временную конфокальную визуализацию мигрирующих нейронов в срезах культур электропористых головных мозгов для изучения роли фактора ВЛ-лимфомы 11-й клетки (Bcl11a) транскрипции в процессе развития коры 10 . Bcl11a экспрессируется в молодых мигрирующих кортикальных нейронах, и мы использовали условный мутант Bcl11a allele ( Bcl11a flox ) 11 для изучения его функций. Электропорация рекомбиназы Cre вместе с зеленым флуоресцентным белком (GFP) в корковые предшественники мозга Bcl11a flox / flox позволила нам создать мозаичную мутантную ситуацию, в которой только несколько клеток мутировали вВ противном случае фон дикого типа. Таким образом, можно было изучить автономные функции клеток Bcl11a на уровне отдельных ячеек. Мы обнаружили, что мутантные нейроны Bcl11a демонстрируют пониженную скорость, сдвигают их профили скорости, а также случайные изменения ориентации во время их миграции 10 . В описываемом протоколе мы описываем рабочий процесс для успешной электропорации и подготовки культуры среза 12 мозга мыши, а также временную конфокальную визуализацию культур срезов кортикального слоя.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все экспериментальные процедуры были одобрены Комитетом по защите животных (Regierungspräsidium Tübingen) и проводились в соответствии с Законом о благосостоянии Германии и Директивой ЕС 2010/63 / EU.

1. В Утероэлектропорации

  1. Микроинъекционные иглы
    1. Потяните капилляры из боросиликатного стекла (наружный диаметр: 1,0 мм, внутренний диаметр: 0,58 мм, длина: 100 мм) в иглы для микроинъекции с помощью съемника микропипетки с коробчатой ​​нитью (2,5 мм х 2,5 мм) и следующей программой: ТЕПЛО: 540, PULL : 125, VELOCITY: 20 и DELAY: 140. Определите значение HEAT для каждой отдельной нити, выполнив тест RAMP (значение HEAT: RAMP + 25).
    2. Конические иглы под углом 38 ° и скоростью от среднего до высокого оборота с помощью микротрещителя для получения размера наконечника от 20 до 30 мкм для инъекций в эмбриональный день (E) 13,5 или менее и от 30 до 40 мкм для инъекций на более ранних эмбриональныхэтапы. Для хранения, исправьте иглы в коробке или чашке Петри с модельной глиной, чтобы предотвратить повреждение кончиков.
  2. Решение плазмидной ДНК
    1. Подготовьте плазмидную ДНК-конструкцию, содержащую флуоресцентный репортерный белок ( например, GFP), используя комплект для подготовки максимума без эндотоксина в соответствии с инструкциями производителя.
    2. Разбавьте раствор плазмидной ДНК до конечной концентрации 1 - 2 мкг / мкл в бесконтактном буфере Tris-EDTA без эндотоксина, содержащем Fast Green при конечной концентрации 0,01%. Aliquot и хранить при -20 ° C.
  3. Бактериостатический раствор хлорида натрия
    1. Подготовьте бактериостатический раствор хлорида натрия, добавив бензиловый спирт до конечной концентрации 0,9% к изотоническому 0,9% раствору хлорида натрия. Стерильный фильтр сразу перед использованием.
  4. Решение для инъекций Carprofen
    1. Подготовьте раствор для инъекций карпрофенаДобавление карпрофена до конечной концентрации 0,5 мг / мл до стерильного изотонического 0,9% раствора хлорида натрия. Хранить при температуре 4 ° C в течение 28 дней.
  5. Анестезия, инъекция ДНК и электропорация
    1. Взвесьте беременную мышь, рассчитанную на E14.5, и поместите ее в прозрачную камеру для анестезии, соединенную с испарителем и насыщенной 5% изофлураном. Когда животное находится в бессознательном состоянии, перенесите его на обезболивающую маску, прикрепленную к нагревательной пластине 37 ° C, и держите ее под наркозом с 1,8 - 2,2% изофлурана.
      Примечание. Оцените развитие хирургического обезболивания путем потери хвостового пинча и педальных рефлексов (пальцевый контакт).
    2. Для обезболивания вводят 100 мкл раствора для инъекций карпрофена на 10 мг массы тела мыши (5 мг / кг тела) подкожно. Поверните мышь спиной вниз и тщательно накройте глаза вазелином, чтобы они не высыхали.
    3. Мягко разложите конечности и исправьте ихК нагревательной пластине с хирургической лентой. Стерилизуйте брюшную полость с 70% этанолом, а затем раствором йода (7,5 мг / мл) с использованием целлюлозных тампонов. Повторите эту процедуру три раза, чтобы обеспечить надлежащую дезинфекцию.
    4. Накройте брюшко стерильной марлей, в которой разрез разрезан, чтобы освободить поле (диаметр: 2 - 2,5 см) для абдоминального разреза. Смочите марлю бактериостатическим раствором хлорида натрия.
      Осторожно: переоцените развитие хирургической анестезии путем потери педального рефлекса.
    5. Используя щипцы Micro Adson (зубчатые, длина: 12 см) и тонкие ножницы (под углом к ​​боку, длина: 9 см) обрезают кожу примерно на 1,5 см вдоль средней линии живота. Вырежьте основной мышцы вдоль линии альба.
    6. Удалите один рог матки с помощью круглых щипцов (длина: 9 см, наружный диаметр: 3 мм, внутренний диаметр: 2,2 мм) и аккуратно поместите его на смоченную марлю.
      Осторожно: Держите маточный рог с помощью пинцеты только между эмбрионами иD не нарушать плаценты или сосуды снабжения. Держите матку влажной в любое время с бактериостатическим раствором хлорида натрия.
    7. Осторожно поместите эмбрион с пинцетом в кольцо и найдите боковой желудочек, который представляет собой полумесяц в форме тени, параллельной сагиттальному синусу. Место инъекции находится примерно в середине линии между пигментированным глазом и слиянием пазух, где сагиттальный синус отходит на две поперечные пазухи. Вдавите иглу микроинъекции через стенку матки и в боковой желудочек.
      Примечание: Если необходимо, глубина впрыска может быть исправлена ​​путем втягивания иглы.
    8. Внесите от 1 до 2 мкл раствора ДНК в боковой желудочек с помощью микроинъектора, который работает с педалью, используя следующие настройки: 25 фунтов на квадратный дюйм, от 10 до 20 мс на импульс и от 5 до 10 импульсов. Успешная инъекция может контролироваться цветным раствором ДНК, который должен заполнять желудочковую систему.
    9. Поместите пинцетные электроды (диаметр 3 мм для E13.5 или моложе и диаметром 5 мм для E14.5 или старше) таким образом, чтобы «положительный» терминал находился на той же стороне, что и вводимый желудочек, и «отрицательный» Терминал находится на противоположной стороне вводимого желудочка ниже уха головки эмбриона.
    10. Смочите сайт электропорации несколькими каплями бактериостатического раствора хлорида натрия и примените 5 импульсов электрического тока (35 В для E13.5 или младше и 40 В для E14.5 или старше) продолжительностью 50 мс с интервалами 950 мс.
      Примечание: Для успешной электропорации обычно достаточны токи от 60 до 90 мА. Более низкие токи не будут эффективно трансфектировать нейроны, тогда как более высокие токи могут привести к эмбриональной смерти.
    11. Повторите процедуру (см. Шаг 1.5.7 - 1.5.10.) Для каждого эмбриона рога матки и аккуратно поместите его обратно в брюшную полость.
    12. Удалите рог матки с другой стороны и повторите процедуруКоторое описано в шаге 1.5.7. До 1.5.11.
    13. Закройте брюшную полость, наложив мышечный слой, прежде чем накладывать шов с помощью щипцов Micro Adson, держателя иглы Mathieu (карбида вольфрама, длина 14 см) и неабсорбируемого хирургического шва (3/8 круга, 13 мм, точки конуса).
      Осторожно: будьте осторожны, чтобы не запечатлеть матку или другие органы во время шва.
    14. Осторожно продезинфицируйте шов с раствором йода (7,5 мг / мл) и аккуратно удалите периокулярный избыток вазелина с использованием целлюлозных мазков. Поместите мышь под инфракрасную лампу, пока она не проснется. В течение следующих двух дней внимательно следите за мышью. Повторите лечение анальгезией, как описано в шаге 1.5.2 через 12-24 часа.

2. Органотипическая культура среза

  1. Ламининовый раствор
    1. Растворить 1 мг лиофилизированного ламинина в стерильной воде с получением 1 мг / мл исходного раствора ламинина. Подготовьте 50 мкл аликвот аИ хранить при -80 ° C.
  2. Поли-L-лизин
    1. Растворить 50 мг поли-L-лизина в стерильной воде для получения 1 мг / мл раствора поли-L-лизина. Подготовьте аликвоты по 0,5 мл и храните при -20 ° C.
  3. Полное сбалансированное солевое решение Хэнка (полный HBSS)
    1. Подготовьте полный HBSS, объединив 50 мл 10-кратного раствора HBSS, 1,25 мл буфера 1 М HEPES (рН 7,4), 15 мл 1 М раствора D-глюкозы, 5 мл 100 мМ раствора хлорида кальция, 5 мл 100 мМ сульфата магния Раствором и 2 мл 1 М раствора гидрокарбоната натрия. Добавьте стерильную воду до 0,5 л, стерильный фильтр и храните при температуре 4 ° C.
  4. Культура среза
    1. Объединить 35 мл базового среднего орла (BME), 12,9 мл полной HBSS (см. Раздел 2.3.1), 1,35 мл 1 М D-глюкозы, 0,25 мл 200 мМ L-глутамина и 0,5 мл пенициллина-стрептомицина до Получают 50 мл культуры срезасредний. Стерильный фильтр и добавьте лошадиную сыворотку до конечной концентрации 5%. Хранить при температуре 4 ° C в течение 4 недель.
  5. Решение агарозы с низкой точкой плавления (LMP)
    1. Подготовьте 3% раствор ЛАМ-агарозы путем растворения 1,5 г LMP-агарозы в 50 мл полного HBSS путем нагревания в микроволновой печи в течение 1-2 мин при промежуточной мощности.
      Примечание: тщательно нагревайте тепло, чтобы предотвратить переполнение во время кипения.
    2. Разместите раствор на водяной бане при температуре 38 ° C до готовности к использованию. Хранить при температуре 4 ° C и повторно использовать один раз.
  6. Покрытие мембранных вставок
    1. Добавьте одну аликвоту исходного раствора ламинина (см. Этап 2.1.1) и одну аликвоту исходного раствора поли-L-лизина (см. Этап 2.2.1) до 6 мл стерильной воды для получения раствора для покрытия (достаточно для 6 вставок) ,
    2. Поместите мембранные вставки в 6-луночный планшет, содержащий 2 мл стерильной воды в нижней части каждой лунки. Добавить 1 мл раствора для покрытия(См. Шаг 2.6.1.) Поверх каждой мембраны и инкубировать в течение ночи при 37 ° С и 5% атмосфере двуокиси углерода.
      Примечание. Используйте только вставки с оптически прозрачными мембранами, такими как мембрана из политетрафторэтилена (PTFE).
    3. Промывайте мембраны три раза 1 мл стерильной воды и высушите. Используйте покрытые мембраны в тот же день или храните в чистой 6-луночной планшете при 4 ° C в течение четырех недель.
  7. Распространение головного мозга и встраивание
    1. Через два дня после электропорации поместите мышь в прозрачную камеру, соединенную с испарителем и насыщенной 5% изофлураном. Когда животное находится в бессознательном состоянии, удалите его из камеры и пожертвуйте его шейным вывихом.
    2. Удалите матку, содержащую эмбрионы, и поместите ее в 10-сантиметровую чашку Петри с ледяным полным HBSS.
      Примечание: с этого момента вперед все растворы, эмбрионы и мозги на льду.
    3. Используйте стереомикроскоп, тонкие наконечники (прямые,11 см) и пару пружинных ножниц Vannas Tübingen (под углом, длина: 9,5 см), чтобы отделить каждый эмбрион от матки и перенести его на другую чашку Петри, содержащую ледяной полный HBSS.
    4. Сделайте разрез на уровне ствола мозга и разрежьте вдоль сагиттальной средней линии. Очистите кожу и хрящ, покрывающие мозг. Затем отрежьте ствол мозга прямо за полушариями и удалите мозг из черепа. Перенесите мозг с помощью шпателя из микро-ложки (185 мм x 5 мм) на 12-луночный планшет, содержащий ледяную полную HBSS. Соберите все мозги из подстилки в 12-луночном планшете.
    5. Используйте флуоресцентный стереомикроскоп для скрининга мозгов в 12-луночном планшете для яркости флуоресценции, а также размера электропористой области. Выберите от 2 до 4 мозгов с яркими флуоресцентными сигналами в презумптивной соматосенсорной коре для дальнейшей обработки.
    6. Налейте 3% раствор LAR-агарозы, содержащийся при температуре 38 ° C, в одноразовую форму для отслаивания. убрE мозг из 12-луночного планшета с лопаткой с микро-ложкой и аккуратно слить избыток полного HBSS вокруг мозга, используя тонкую бумагу для тканей.
    7. Мягко поместите мозг в раствор агарозы, подтолкните его к нижней части формы и тщательно отрегулируйте свое положение с помощью иглы 20-го калибра. Для корональных срезов ориентируйте мозг с обонятельными луковицами, направленными вверх. Держите форму на льду до тех пор, пока раствор агарозы не затвердеет и продолжит разделение мозга.
  8. Секция вибрации и культивация среза
    1. Удалите блок агарозы из формы и поместите его на крышку стерильной чашки Петри. Отрежьте избыток агарозы чистым бритвенным лезвием, оставляя примерно на 2 - 3 мм ниже обонятельных луковиц и 1 мм агарозы с другой стороны. Закрепите обрезанный блок агарозы обонятельными луковицами, направленными вниз на образец, используя цианакрилатный клей.
      Примечание: стерилизовать инструменты и оборудование с 70% этанономЛ перед разделением.
    2. Перенесите образец образца в камеру для срезания микротома вибрирующего лезвия, содержащего ледяной полный HBSS, и расположите головку с дорзальной стороной к лезвию. Вырезать срединные срезы объемом 250 мкм, содержащие электропористую область с малой и средней амплитудой 0,9 мм и очень медленную скорость среза 0,09-0,12 мм / с. Обычно от каждого успешного электропористого мозга получают от 4 до 6 срезов с ярким флуоресцентным сигналом.
    3. С помощью изогнутой лопатки с микро-ложкой и тонких наконечников, аккуратно передайте срезы мозга с окружающей агарозой на 6-луночный планшет, содержащий ледяной полный HBSS.
      Осторожно: будьте осторожны, чтобы не повредить ткань головного мозга, только касаясь агарозного обода вокруг секций пинцетом во время передачи.
    4. Обработайте все выбранные мозги, как описано в шагах 2.8.1. До 2.8.3.
    5. Смочите мембранные вставки 100 мкл полного HBSS перед тем, как поместить мозг slЛьда на мембраны для облегчения позиционирования срезов. На 1 мембранную вставку можно разместить до 5 срезов.
    6. Аккуратно переместите ломтики на мембраны с помощью изогнутой лопатки с микролопами и тонких наконечников. Осторожно потяните ломтик на шпатель, только прикоснувшись к агарозному краю с помощью щипцов и аккуратно надавите ломтик от шпателя на мембрану. Поместите срез с помощью щипцов и продолжайте переносить оставшиеся фрагменты. Удалите избыток полного HBSS с помощью пипетки.
      Примечание. Не перекрывайте срезы друг с другом.
    7. С помощью щипцов аккуратно поместите мембранные вставки с ломтиками в 6-луночный планшет, содержащий 1,8 мл срединной культуральной среды (см. Этап 2.4.1), и инкубируйте при 37 ° С и 5% атмосфере углекислого газа до истечения времени изображения.

3. Временная съемка

  1. Настройка микроскопа
    1. Установите климатическую камеру, расположенную наПеревернутый конфокальный микроскоп до 37 ° С и 5% атмосферы диоксида углерода. Используйте гибридный детектор, чтобы уменьшить интенсивность лазера и улучшить жизнеспособность клеток. Для детального анализа используйте сверхдлинное рабочее расстояние 40X сухого объекта с числовой апертурой 0,6 или выше.
      Примечание: Все компоненты микроскопа должны быть предварительно разогреты до 37 ° C в течение 2 - 3 часов до получения изображений, чтобы обеспечить стабильную фокусировку во время процесса визуализации.
  2. Изображения срезов
    1. Выберите срез мозга для получения изображений из 6-луночного планшета, содержащего мембранные вставки с использованием инвертированного флуоресцентного микроскопа.
      Предостережение. Избегайте длительного времени воздействия ультрафиолетового света, так как это может вызвать клеточный фотолапаж.
      Примечание. Выберите срез с яркими одиночными нейронами в верхнем SVZ, мигрирующим радиально к поверхности пиала среза. Прекрасные флуоресцентные процессы радиальных глиальных клеток, которые охватывают весь ЦП, указывают на неповрежденный радиальный глиальный каркас, который используетсяD радиально мигрирующими кортикальными нейронами.
    2. Перенесите мембранную вставку срезом, который был выбран для визуализации с временным проходом, в стакан с нижним слоем диаметром 50 мм, содержащий 2 мл срезной культуральной среды с помощью щипцов. Поместите блюдо в климатическую камеру конфокального микроскопа.
    3. Установите разрешение 512 на 512 пикселей и увеличьте скорость сканирования от 400 Гц до 700 Гц, чтобы увеличить частоту кадров от примерно 1,4 до примерно 2,5 кадров в секунду, соответственно. Используйте усреднение не более двух раз. Определите z-стек через электропористую область (обычно 400-100 мкм) с шагом размером 1,5 мкм. В совокупности эти настройки позволяют обеспечить достаточное разрешение и яркость изображения при одновременном сохранении фотопамяти при покупке. Начните серию временного интервала, взяв z-стоп каждые 30 минут.
      Примечание. Длительное воздействие среза на лазерный свет вызовет фотодамодействие, уменьшающее жизнеспособность клеток. Отрегулируйте значение expСоответственно, для лазерного излучения.
    4. Проанализируйте временные ряды, используя программное обеспечение ImageJ (https://imagej.nih.gov/iij/) или аналогичное.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Ранее мы показали, что генетическая делеция Bcl11a при внутриутробной электропорации нарушает радиальную миграцию поздних верхних слоев проекционных нейронов 10 . Электропорация ДНК-плазмидного вектора, содержащего Cre-IRES-GFP, эффективно удаляла Bcl11a в условном мозге Bcl11a flox / flox 11 . Когда мы проанализировали электронодонорные мозги E14.5 через три дня после электропорации, ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Радиальная миграция является ключевым процессом развития неокортекса. Мутации в генах, влияющих на различные этапы этого процесса, могут вызывать сильные корковые пороки развития, в том числе гетеросексуальность lissencephaly и белого вещества 1 , 2 . Недавно мы показали, что Bcl11a, выраженный в молодых мигрирующих проекционных нейронах коры, играет роль в радиальной миграции. Мы использовали временную конфокальную визуализацию мигрирующих нейронов в острых кор...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Жаклин Андрашко, Елену Верле, Сачи Такенаку и Маттиаса Тобера за отличную техническую помощь, а также Виктора Тарабикина за полезные обсуждения. Эта работа была поддержана грантом Deutsche Forschungsgemeinschaft для SB (BR-2215).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
изофлуранAbbott Laboratories 506949Forene
6-луночная пластинаCorning351146
12-луночная пластинаCorning351143
нерассасывающийся хирургический шовный материалEthiconK890H3/8 круг, 13 мм, коническая точка
Микро Адсон ЩипцыFine Science Tools11018-12зубчатые, длина: 12 см
тонкие ножницыFine Science Tools14063-09наклонен в сторону, длина: 9 см
Иглодержатель МатьеFine Science Tools12510-14карбид вольфрама, длина: 14 см
щипцы с тонким наконечникомFine Science Tools11370-40прямой, 11 см
Vannas Tü Пружинные ножницы bingenFine Science Tools15005-08под углом,
кольцевые щипцыFine Science Tools11103-09Внешний диаметр: 3 мм, ID, 2,2 мм, длина: 9 см
HBSS (10X)Gibco14180046
L-глютаминGibco25030081
пенициллин/стрептомицинGibco15140122
лошадиная сывороткаGibco
BMEGibco41010026
капилляры из боросиликатного стеклаHarvard Apparatus30-00161,0 OD x 0,58 ID x 100 L мм
Система анестезииHarvard Apparaus72-6471
анестезирующая камераHarvard Apparaus34-0460
фильтр флюосорбера канистраHarvard Apparaus34-0415
Низкая температура плавления агарозаInvitrogen16520100
вибрационным лезвием микротомомLeicaVT1200 S
флуоресцентный стереомикроскопLeicaM205 FA
стереомикроскопLeicaM125
инвертированный флуоресцентный микроскоп для культуры тканейLeicaDM IL LED
конфокальный лазерный сканирующий микроскопLeicaTCS SP5II
гибридный детекторобъектив LeicaHyD
, 40x/0.60 NALeica11506201
микроскоп система контроля температурыLife Imaging ServicesCube, Brick & Вставка
для клеточных культурMilliporePICM0RG50
микроизмельчителемNarishigeEG-45с использованием угла 38° для снятия фаски
микроинъектораParker Hannifin 052-0500-900Picospritzer III
карпрофенPfizer Animal HealthNDC 61106-8507Римадила
эмдеддинг пресс-формаPolysciences18986-1
макси набор плазмид без эндотоксиновQiagen12362
быстрый зеленыйSigmaF7252
ламининSigmaL2020
поли-L-лизинSigmaP5899
HEPESSigmaH4034
D-глюкозаSigmaG6152
хлорид кальцияSigmaC7902
сульфат магенсияSigmaM2643
бикарбонат натрияSigmaS6297
прямоугольный электропораторSonidelCUY21EDIT
пинцет с платиновым диском 5 мм электродыSonidelCUY650P5
съемник микропипеткиSutter InstrumentP-97
коробка филаментаSutter InstrumentFB255B2,5 мм x 2,5 мм
микроложка шпательVWR231-0191185 мм x 5 мм
стеклянное дно, 50 ммWorld Precision InstrumentsФД5040-100
9,5 см 26050088

Ссылки

  1. Evsyukova, I., Plestant, C., Anton, E. S. Integrative mechanisms of oriented neuronal migration in the developing brain. Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 299-353 (2013).
  2. Kwan, K. Y., Sestan, N., Anton, E. S. Transcriptional co-regulation of neuronal migration and laminar identity in the neocortex. Development. 139 (9), 1535-1546 (2012).
  3. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
  4. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  5. LoTurco, J. J., Bai, J. The multipolar stage and disruptions in neuronal migration. Trends Neurosci. 29 (7), 407-413 (2006).
  6. Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7 (2), 136-144 (2004).
  7. Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. J Neurosci. 23 (31), 9996-10001 (2003).
  8. Pacary, E., et al. Proneural transcription factors regulate different steps of cortical neuron migration through Rnd-mediated inhibition of RhoA signaling. Neuron. 69 (6), 1069-1084 (2011).
  9. Tabata, H., Nagata, K. Decoding the molecular mechanisms of neuronal migration using in utero electroporation. Medical Molecular Morphology. 49 (2), 63-75 (2016).
  10. Wiegreffe, C., et al. Bcl11a (Ctip1) Controls Migration of Cortical Projection Neurons through Regulation of Sema3c. Neuron. 87 (2), 311-325 (2015).
  11. John, A., et al. Bcl11a is required for neuronal morphogenesis and sensory circuit formation in dorsal spinal cord development. Development. 139 (10), 1831-1841 (2012).
  12. Polleux, F., Ghosh, A. The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal development. Sci STKE. (136), pl9(2002).
  13. Greig, L. C., Woodworth, M. B., Galazo, M. J., Padmanabhan, H., Macklis, J. D. Molecular logic of neocortical projection neuron specification, development and diversity. Nat Rev Neurosci. 14 (11), 755-769 (2013).
  14. De Marco Garcia, N. V., Fishell, G. Subtype-selective electroporation of cortical interneurons. J Vis Exp. (90), e51518(2014).
  15. Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. J Vis Exp. (85), (2014).
  16. Venkataramanappa, S., Simon, R., Britsch, S. Ex utero electroporation and organotypic slice culture of mouse hippocampal tissue. J Vis Exp. (97), (2015).
  17. Simon, R., et al. A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis. EMBO J. 31 (13), 2922-2936 (2012).
  18. Youn, Y. H., Pramparo, T., Hirotsune, S., Wynshaw-Boris, A. Distinct dose-dependent cortical neuronal migration and neurite extension defects in Lis1 and Ndel1 mutant mice. J Neurosci. 29 (49), 15520-15530 (2009).
  19. Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O., Pearlman, A. L. Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex. Nat Neurosci. 4 (2), 143-150 (2001).
  20. Higginbotham, H., Yokota, Y., Anton, E. S. Strategies for analyzing neuronal progenitor development and neuronal migration in the developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 21 (7), 1465-1474 (2011).
  21. Stubbs, D., et al. Neurovascular congruence during cerebral cortical development. Cereb Cortex. 19, Suppl 1. i32-i41 (2009).
  22. Ayala, R., Shu, T., Tsai, L. H. Trekking across the brain: the journey of neuronal migration. Cell. 128 (1), 29-43 (2007).
  23. Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи