Методическая статья

Высок объём анализ двигательного поведения в Assay остров дрозофилы

10.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55892

⸱

5 ноября 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Human Genetics, Donders Institute for Brain, Cognition and Behaviour, Radboud University Medical Center, 2Centre for Molecular and Biomolecular Informatics, Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Radboud University Medical Center, 3Department of Neurology, Donders Institute for Brain, Cognition and Behaviour, Radboud University Medical Center

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Assay остров является относительно новой, экономически assay, который может использоваться для оценки основных двигательного поведения Drosophila melanogaster. Эта рукопись описаны алгоритмы для автоматической обработки данных и объективной количественной оценки остров анализа данных, что делает этот assay чувствительных, высок объём индикация для больших экранов генетических или фармакологических.

Аннотация

Достижения в области технологий виртуализации нового поколения способствовать идентификации генов (кандидат) болезни двигательных расстройств и других неврологических заболеваний на увеличение скорости. Однако мало что известно о молекулярные механизмы, которые лежат в основе этих расстройств. Генетические, молекулярной и поведенческих инструментов Drosophila melanogaster делает эту модель организма особенно полезным квалифицировать новые заболевания генов и механизмы в духе высокой пропускной способности. Тем не менее высок объём экраны требуют эффективной и надежной анализов, которые, в идеале, являются экономически эффективными и позволяют для автоматизированного количественного определения черты соответствующих для этих расстройств. Assay остров является экономически эффективным и легко set-up метод для оценки дрозофилы двигательного поведения. В этот assay мух брошены на платформу с фиксированной высоты. Это вызывает врожденные мотор ответ, который позволяет мух убежать от платформы в течение нескольких секунд. В настоящее время количественный анализ снят остров анализов делается вручную, что является трудоемким мероприятием, особенно при выполнении больших экранов.

Эта рукопись описывает «Дрозофилы остров Assay» и «Остров пробирного анализа» алгоритмы для высокой пропускной способности, автоматизированной обработки данных и количественной оценки остров анализа данных. В программе установки простой веб-камеры, подключен к ноутбуку собирает изображения серии платформы, в то время как генотипирования. «Дрозофилы остров Assay» алгоритм, разработанный для программное обеспечение open-source Фиджи обрабатывает эти изображения серии и количественно, для каждого экспериментальные условия, количество мух на платформе с течением времени. «Остров пробирного анализа» сценарий, совместимый с свободного программного обеспечения R, был разработан для автоматической обработки полученных данных и вычисления ли лечение/генотипов статистически отличаются. Это значительно повышает эффективность анализа остров и делает его мощный индикация для основных локомоции и поведение рейса. Таким образом, он может применяться для больших экранов расследование летать опорно-двигательной способности, дрозофила модели двигательных расстройств, и эффективность препарата.

Введение

В последние годы прогресс в области технологий виртуализации нового поколения значительно способствовали идентификации генов, лежащие в основе дегенеративный двигательных расстройств головного мозга (например, мозжечковая атаксия и Паркинсона), периферической нейронов происхождения (например, боковой амиотрофический склероз и Наследственные спастические параплегии) и мышечного происхождения (например, мышечной дистрофии Дюшенна и Миотоническая Дистрофия)1,2,3,4 . Несмотря на это мало что известно о молекулярные механизмы, которые лежат в основе большинства этих расстройств. Более глубокое понимание этих механизмов имеет важное значение для разработки методов лечения.

Как и люди движение в модели организмов, таких как полет и передвижения у дрозофилы, находится под контролем центрального мозга, периферической нервной системы и мышц. Кроме того, Быстрая генерация время и генетических элементов дрозофилы делают эту модель организма особенно подходит для высокопроизводительного скрининга генов участвующих в двигательных расстройств и для наркотиков испытания5,6 . Из-за значительное количество условий, которые должны быть проверены в таких экранов, надежным, экономически эффективным и относительно простых анализов, а также инструменты для количественной оценки результаты вывода в автоматическом режиме являются весьма желательно.

Шмидт и др. (2012) 7 описал лоу кост тест называется «остров assay» для оценки дрозофилы двигательного поведения. Assay остров успешно используется в крупномасштабных показы для идентификации генов с глии конкретных функций7, в оценке моделей дрозофилы интеллектуальной инвалидности8, а для общей оценки покупать моторное поведение9. Принцип дизайн остров assay состоит из повышенных платформа, на которой создаются несколько мух. Это вызывает врожденные мотор поведение, что позволяет здоровой мух убежать от платформы в течение нескольких секунд. Assay измеряет количество мух, оставаясь на платформе за время7,8,9. Все эти особенности указывают, что остров assay может быть мощным скрининга для генов, вовлеченных в движение расстройств.

В настоящее время количественный анализ данных снят остров пробирного делается вручную7,8,9. Для повышения эффективности анализа, был разработан метод лоу кост поддается полуавтоматически побег мухи от платформы. Программа установки использует простой веб-камеры, подключен к ноутбуку для сбора время изображения, серия платформы, с кадрами приобрел каждые 0.1 s. кадров затем обрабатываются с макросом «Дрозофилы остров Assay», который измеряет количество мух на платформе над время. Макрос «Дрозофилы остров Assay» разделен на три независимых вложенные макросы: (I) «Создание стека и проекции,» вложенный макрос определяет различные острова эксперименты, хранящихся в различных подпапках и создает стек и проекции каждого временных рядов. (II) подпункта макрос «Определение платформы» будет последовательно открыть все файлы «Projection_image_name.tif», расположенный в отдельных экспериментальных подпапках, в какой момент пользователя запрашивается вручную определить остров платформы как региона интерес (ROI). (III) «анализ» автоматически измеряет количество мух, оставаясь на платформе во временных рядов. Вложенные макросы могут выполняться последовательно (за один проход) или самостоятельно. Для анализа статистических данных сценарий был разработан для автоматической обработки полученных данных и применять статистический тест, чтобы определить, является ли лечение/генотипов ведут себя значительно отличаются друг от друга (рис. 1). Наконец он продемонстрировал, что эта настройка может использоваться для оценки и количественного определения аберрантных опорно-двигательной способности дрозофилы модели для атаксия телеангиэктазии (AT).

Протокол

1. Строительство коробки Assay острова

  1. подготовить лоток из надежных материалов, таких как поли метилметакрилата (ПММА), содержат слой воды (т.е. ванну). Убедитесь, что материал не является белым.
    Примечание: Размеры 40 x 35 x 2,5 см 3, рекомендуется ( рис. 1A).
  2. Подготовить коробку (42 x 38 x 25 см 3) изготовлены из надежной, прозрачной материала, например, ПММА, вокруг ванны для предотвращения побега в космос лаборатории мух. Место (20 x 30 см 2) отверстие на боковой стороне, что является достаточно большим для экспериментатора легко обрабатывать флаконы с мух и поместите их на острове ( рис. 1A).
  3. Подготовить повышенных платформа 10 x 15 x 2,5 см 3 измерения, сделанные из трудновоспламеняющийся материал (ПММА или пластик), которая является водонепроницаемым.
    Примечание: Эта платформа требуется иметь единую белая поверхность обеспечить хороший контраст для анализа изображений. Размер не является фиксированным обязательно, но она должна быть достаточно большой, чтобы убедиться, что все летит первоначально землю на платформе и получить возможность ходить на это ( Рисунок 1A).
  4. Исправить платформы путем склеивания его в ванну или размещение веса или другие тяжелые предметы внутри поле платформа для предотвращения позиционные изменения платформы во время сессии экспериментальной/съемки.

2. Требования к программному обеспечению и установка

  1. Установка программного обеспечения записи изображений.
    1. Скачать запись изображений программное обеспечение для записи остров изображения серии (см. Таблицу материалов) и установить программное обеспечение на компьютере.
      Примечание: Изображения записи программного обеспечения, указанных в настоящем Протоколе поддерживается только операционной системой Windows. Альтернативой для других пользователей была добавлена в Таблицу материалов.
  2. " Дрозофила остров Assay " макро установки.
    1. Скачать " дрозофила остров Assay " макро и совместимых Фиджи 10 версия (1.4 или выше) на следующем вебсайте: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1.
    2. Переместите курсор, чтобы " остров Пробирная " каталог и нажмите на кнопку " представлении. "
    3. Нажмите на " скачать все. " содержимое папки будет загружен как ZIP-файл, распакуйте скачанный файл.
    4. Копия " дрозофила острова Assay.ijm " файл " Fiji.app/plugins/directory. "
      Примечание: При запуске Фиджи, " дрозофила остров Assay " макрос появится в нижней части раскрывающегося меню плагины.
  3. " Остров пробирного анализа " сценарий установки и загрузить.
    1. Скачать R 11 из следующих веб-сайт: https://cran.rstudio.com. Установить его на компьютере.
      2. Студия
    2. скачать R на следующем вебсайте: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/. Установить его на компьютере.
      Примечание: " анализ тестирования остров " с R только может выполняться сценарий. R-студия, с ее проще интерфейсом пользователя, представлен как альтернативный шаг для пользователей неопытных с р.
    3. Скачать " остров пробирного анализа " сценария из " дрозофила остров Assay " каталог на следующем вебсайте: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1.
      Примечание: после выполнения шага 2.2, " остров пробирного анализа " сценарий можно также найти в распакованные папки под названием " остров пробирного. "

3. Подготовка мух для испытания в Assay острова

  1. собирать устроили мух для каждого экспериментальные условия под холодной или анестезии двуокиси углерода (CO 2), как описано выше 13 (в течение 1 - 2 дня).
    1. Подготовить как минимум 3 образец флаконов в экспериментальные условия, каждый из которых содержит приблизительно 15 устроили мухи. Использовать только летит с нетронутыми крылья и что же возраста и пола.
      Примечание: Для экспериментов, описанных здесь, 5 образцов флакон содержащий 15 мужчин мух генотипов w -; Актин-Gal4 / + (контроль) и w -; Актин-Gal4/GD11950 (tefu интерференции) были собраны в день eclosion, выдерживается в течение 4 дней и были использованы для выполнения остров assay. Интерференции, управления штаммов и актин gal4 водитель были получены из коммерческих источников (см. Таблицу материалов).
  2. Пусть мух восстановить чтобы избежать эффектов от анестетиков (по крайней мере 1 день при использовании CO 2) перед началом тестирования собранных мух в assay остров в возрасте интерес.

4. Экспериментальная установка

Примечание: см Рисунок 1B.

  1. Добавить холодной водой с небольшим количеством мыла в ванной лоток и положение платформы в середине.
    Примечание: Мыло снижает поверхностное натяжение воды; мух, которые касаются воды утонет. Это предотвращает все большее количество мух летать в поле во время прогрессирование экспериментальной сессии.
  2. Поместите прозрачную коробку на верхней панели и осветить платформа сверху с помощью ламп.
    Примечание: Освещение платформы главным образом необходима для обеспечения надлежащего видео контраст. Обычные 12-V Светодиодные подходит для этого.
  3. Установите веб-камеру непосредственно над платформы (вне коробки) и подключить его к компьютеру.
  4. Создать новые папки для хранения различных экспериментальных данных до экспериментов на компьютере.
    1. Следовать структуре примера показано на рисунок 2A для создания папок. Например если экспериментальный дизайн требует тестирования два генотипов с пятью реплицирует, сначала создайте Главная папка, содержащая дату эксперимента. Внутри главной папки создайте две вложенные папки (по одному на генотип). Внутри папки генотипа, создать пять новых подпапок, одному реплицировать.
      Примечание: Для дальнейшего анализа, важно что серии изображений, соответствующих отдельных экспериментов сохраняются в папках с уникальными именами.

5. Видео параметры установки в " захватить устройство " раздел интерфейса

  1. Открыть запись изображений программное обеспечение и, под " захват " вкладку, нажмите на " Time-Lapse изображения … " и выберите соответствующую камеру в " Захватить устройство. "
  2. место мертвых летать на острове; настроить параметры видео, нажав на " параметры видео " поле. Прокручивать панели инструментов, Настройка яркости, контраста и цвет в манере, таким образом, что мертвые мухи появляется черный на белом фоне ( рис. 2B). После изменения являются полная, нажмите " ОК. "

6. Запись и видео сохранение параметров настройки в " промежуток времени " раздел интерфейса

< ol>
  • Настройки в " Time-Lapse фильм установки " для сохранения эксперимент как файл .avi. Нажмите на " Просмотр …, " выберите каталог, где будет храниться фильм, определяют имя видео, и нажмите " сохранить. "
    Примечание: видео файл не используется для количественной оценки данных, однако, это может быть полезно, чтобы получить общее представление о проведении эксперимента.
  • Настройки в " Time-Lapse фильм установки " раздел.
    1. В диалоговом окне Сжатие выберите " Intel IYUV код " для сжатия видео и выберите " взять один кадр каждые 0,1 секунды, " с " скорость воспроизведения (изображений в секунду): " на 10.
    2. Сохранить эксперимент временных рядов как .bmp кадры, нажав на " дополнительно … " выберите " создать изображение .bmp для каждого захваченных кадров. " нажмите на " обзор. " выберите тот же каталог, в " во время AVI фильм захват " окно (как выбранный в шаге 6.1), нажмите кнопку " открыто, " и нажмите " ОК. "
      Примечание: Обратите внимание, что во время эксперимента, кадры хранятся в виде BMP-файлы (требуется для анализа данных). Программа имена фреймов как " A " следуют номер, соответствующий кадр последовательности записи (например, " A_number.bmp ") ( рис. 2 c). Всегда сохраняйте изображения, принадлежащие различных экспериментов в новой папке, чтобы убедиться, что ранее записанные изображения серии не будет перезаписан. Имейте в виду, что изображения не сохраняются автоматически в той же папке, что и видео файл если эта папка выбрана под " Просмотр … " после нажатия " дополнительно " коробке.

    • 7. Остров, сбора данных и анализа

    1. нажмите на кнопку Пуск в интерфейсе покадровой изображения записи изображений программного обеспечения, чтобы начать запись.
    2. Кран экспериментальной флакон, содержащий мух (шаг 3) 2 - 3 раза для обеспечения мух в нижней части флакона. Быстро выньте вилку флакона и, с энергичным движением, коснитесь флакона на платформе таким образом, чтобы все мухи попадают на платформу в то же время ( рис. 1 c).
    3. После приблизительно 30 s, Пресс " остановить " кнопку для остановки записи.
      Примечание: Если все мухи пропадают из платформы, запись может быть остановлена ранее.
    4. Удаление мух, которые остаются для 30 s на платформе вручную после остановки записи изображений.
    5. Прежде чем приступить к записи следующий эксперимент, изменить целевой каталог для файлов .bmp и фильмы (см. раздел 6).

    8. Обработка данных: Запуск " дрозофила остров Assay " макрос

    Примечание: см. рис. 1 d.

    1. Запустить " создать стек и проекции " вложенный макрос я стеки и прогнозов серии собраны изображения.
      1. Начала Фиджи, нажмите на " плагины " в панели инструментов и выбрал " дрозофила остров Assay " в выпадающем меню; появится новое окно.
      2. Ввод " сначала изображение рядов идентификатор " настройки в графическом интерфейсе макрос.
        Примечание: Рамки записанные изображения сохраняются в виде " A-number.bmp " в порядке, в котором получены изображения. В " первого кадра идентификатор " интерфейс макросов, заполните параметр с номера, присвоенного на первый кадр программы и расширение файла. Заполните " первого кадра идентификатор " с "-0001.bmp, " так как первый кадр называется " A-0001.bmp " ( рис. 2 c). В случае, если другие форматы изображений (например, .tiff или .jpeg) генерируются веб-камера программного обеспечения, укажите правильный файл расширение первого изображения в " сначала изображение рядов идентификатор. "
      3. выберите только " создать стек и проекции " вложенный макрос, нажмите " ОК, " и выбрать основной каталог, содержащий все подпапки с отдельными островными пробирного экспериментов.
        Примечание: Файлы .bmp в каждом отдельном эксперимент папки, содержащие " первого кадра идентификатор " впоследствии будут обрабатываться. Два новых файлов будут отображаться в каждой подпапке индивидуальный эксперимент, с именем по умолчанию " Stack_image_name.tif " и " Projection_image_name.tif " ( рис. 1 d). После того, как этот шаг выполняется, BMP-файлы могут быть удалены. Стек и проекции .tif файлов содержат все данные и достаточны для дальнейшего анализа.
    2. Запустить " определить платформа " II подпункта макрос выберите точное расположение платформы.
      1. Открыть графический интерфейс " дрозофила остров Assay, " выберите только " определить платформа " флажок и нажмите " ОК. "
      2. в " выбрать каталог " окно, выберите основной каталог где экспериментальная подпапки, хранятся и нажмите " Select. "
        Примечание: " определить платформа " вложенный макрос автоматически ищет " Projection_image_name.tif " файлов во всех вложенных папках хранится в главной директории. " Projection_image_name.tif " изображения, хранящиеся в папке первого, вместе с двумя окнами — " определить платформу " и " ROI менеджер " — откроет.
      3. Выберите " многоугольник выбора " инструмент в панели инструментов, чтобы сделать выбор, который соответствует платформе остров.
        Примечание: Очень важно исключить из выделения границы платформы. Посмотреть Рисунок 2D.
      4. После выбора платформы в первом изображении, нажмите на " добавить " в " ROI менеджер " окно; выбранной области появится в окне менеджера ROI как набор значений ( Рисунок 2D). Пресс " ОК " в " определить платформы " окно. Макрос будет перейти к следующему проекции.
      5. Нажмите на номера ( Рисунок 2D) хранятся в " ROI менеджер " окно; предыдущий выбор будет затем автоматически появляются в текущей проекции изображения.
        Примечание: начиная с острова платформа может иметь одинаковый размер и положение, когда эксперименты проводятся в ряд (до тех пор, как позиция веб-камера и острова остаются неизменными), это полезно для хранения ROI, определения платформы в " ROI менеджер. ", Таким образом, пользователь будет сэкономить время; в будущие прогнозы, стоит только нажать на выбранный временно сохраненные в менеджере ROI.
      6. Если положение острова слегка переехал по сравнению предыдущим эксперимент, отрегулируйте положение выделения левой кнопки в центре отбора и перетащив выделенную область в желаемое положение.
      7. Если выбор не совпадает с платформой, находящийся за пределами выделения и разграничить новое выделение для использования платформы " выбранного многоугольника " инструмент. Хранить новый выбор в менеджере ROI, нажав " добавить; " новое выделение появится в " ROI менеджер " окна, который может быть использован непрерывно.
      8. Когда выбор корректируется, нажмите " ОК " в " определить платформы " окно и повторите процедуру до тех пор, пока все платформы определены.
        Примечание: Обратите внимание, что именем двоичный образ платформы, соответствующий области разграничены ROI в белом на чёрном фоне, " Platform_image_name.tif, " появились для каждого обработанного изображения в подпапке же экспериментальная как стек и проекции изображения, созданные в шаг 8.1.3 ( рис. 1 d).
    3. Определяют минимальный размер летать.
      Примечание: Этот параметр определяет минимальный размер летать в пикселях. Частицы, которые меньше заданного минимального размера будут исключены из анализа во избежание ложных срабатываний из-за шума.
      1. Открыть стека изображений, созданных " создать стек и проекции " I. вложенный макрос
      2. Преобразование стека изображений в 8-разрядный, щелкнув изображение > > типа > > 8-битный.
      3. Перейдите в меню, нажмите изображение > > Настройка > > порог, убедитесь, что " темный фон " флажок установлен и нажмите " применить; " второе окно называется " порог " появится. Нажмите на " темный background " и нажмите " ОК. "
        Примечание: двоичное изображение стека будет создаваться в котором мух определены в черном и платформы в белом. Когда это не так, применить " инверсия " функцию, нажав кнопку изменить > > инвертировать > > запустить.
      4. Установить масштаб для обнаружения количество пикселей, нажав кнопку Analyze > > задать масштаб. Задайте следующие параметры: расстояние в пикселях = 1, известный расстояние = 1, пропорции пиксела = 1 и единица длины = пикселей. Пресс " ОК. "
      5. выберите " палочка " (трассировки) инструмент в панели инструментов и нажмите на лету (черная точка) настоящее на платформе. Нажмите ctrl + m (для пользователей Windows) или cmd + m (Mac пользователей); Новый " результаты " окно будет указывать области выбранной точки в пикселях. Сделать это последовательно для несколько мух и определить минимальный размер летать.
        Примечание: При запуске макроса, установите " летать минимальный размер " установка наименьшей наблюдаемых летать размер минус маржа в размере 10%. ( Рисунок 2E).
    4. Запустить " анализ " III подпункта макрос для количественного определения летит, спасаясь от платформы.
      1. Перейдите к панели инструментов, выберите " плагинов, " и выбрал " дрозофила остров Assay. "
      2. Отрегулируйте " летать минимальный размер " установка согласно значение, определенное на шаге 8.3.
        Примечание: Используйте значение определено в шаг 8.3 только если параметр Стандартный " летать минимальный размер " вызывает исключение мух, которые были в настоящее время на платформе или если макрос определяет фонового сигнала как мухи.
      3. В " количество мух на флакон " установка, заполнить максимальное количество мух в флаконы во время завершения эксперимента. Например, если один эксперимент имеет флаконов, содержащих 15 мух, другие содержащие 20 мух и других содержащих 23 мух " количество мух на флакон " должно быть указано как 23.
      4. Выберите " анализ " флажок и нажмите " Ok; " новый " выбрать каталог " появится окно. Выберите основной каталог (с все подпапки и файлы внутри) и нажмите " выбрать. "
        Примечание: макрос будет анализировать все образы, хранящиеся в подпапках, до тех пор, как они содержат " stack_image_name, " " Projection_image_name, " и " Platform_image_name " файлов. Макрос будет обрабатывать изображения после изображения. Вывода макроса состоит из стека изображений двоичный результат именем “ result_stack_subfolder_name.tif ” и результат текстовый файл под названием " result_subfolder_name.txt, " которого отображаются в каждой папке данных. полученный текстовый файл (.txt) содержит количественные измерения, соответствующие изображения стек и состоит из 9 столбцов. Содержание этих столбцов приведены в таблице 1. " Result_stack_subfolder_name.tif " соответствует времени изображения-серии одного эксперимента, где мухи, обнаруженных в ходе эксперимента представлены как черные точки на белом фоне ( Рисунок 1E).
      5. Внимательно осмотрите стек результат для обеспечения что никаких артефактов имели место и что макрос работает точно ( Рисунок 2F).
        Примечание: Примеры артефакты могут быть элементы изображения, которые являются не летает, но как таковой, распознаются алгоритм сегментации изображений (ложных срабатываний). Это может например, быть из-за обнаружения фонового сигнала из-за неточной выбор ROI.

    9. С помощью анализа данных " остров пробирного анализа "

    1. структуры данных, как указано на рисунке 2A для проведения анализа с " остров пробирного анализа " сценарий. Генерировать основной каталог с подпапками, где каждая подпапка соответствует одной экспериментальной условие анализируемым.
    2. В подпапках, создавать папки, которые содержат независимой экспериментальной реплицирует ( рисунок 2A) и созданные файлы results.txt " дрозофила остров Пробирная " макрос.
      Примечание: " остров пробирного анализа " макрос будет обрабатывать все экспериментальные условия, расположенный в главной директории сразу.
    3. Начать R или R студии. Нажмите на файл > > открыть файл … в панели инструментов и выберите " остров пробирного анализа " script.
      1. Ggplot2 и matrixStats пакеты при выполнении установки " остров пробирного анализа " сценарий в первый раз. Введите следующую команду в окне консоли:
        > install.packages("ggplot2"), введите
        > install.packages("matrixStats"), введите.
    4. Укажите расположение выходных данных и анализа файлов в скрипте. Вставить в следующих строках сценария:
      1. строку 16: вставьте путь к основной каталог, содержащий экспериментов, чтобы проанализировать и сравнить ( рисунок 2A, это путь к " Assay остров " папка).
      2. Строка 19: вставьте путь к папке, где хранятся файлы вывода анализа.
        Примечание: Каталога, указанного в строке 16 может содержать только папки, чтобы быть проанализированы. Сценарий также не будет работать правильно если вставлен в строке 16 и строка 19 пути же.
    5. Запустить сценарий, щелкнув код > > запустить регион > > запустить все на панели инструментов.
      Примечание: Обратите внимание, что три полученный CSV-файлов и один результирующий TXT-файл ( Рисунок 1E) появляются в каталог, определенный в строке 19. Это: (I) " data_all_conditions.csv " файл содержит обработанные данные, соответствующие каждой экспериментальной состояния и экспериментальной реплицирует, организованных как описано в таблице 2. (II " статистики summary.csv " файл кратко среднее, стандартное отклонение (SD) и Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM) процент мух на платформу для каждого экспериментальные условия. (III " AUC.csv " файл содержит площадь под кривой для каждой экспериментальной репликации. (IV) в зависимости от количества условий в главной папке, сценарий будет либо экспорта " Welch_t-test_results.txt " файл (2 условия) или " AUC_anova_results.txt " файла (более чем 2 условия), где результаты t теста или Указаны ANOVA, сравнивая площадь под кривой между экспериментальных условиях. Обратите внимание, что четыре различных типов изображения TIFF-файлов ( Рисунок 1E) появляются в пути, определенного в строке 19. Они называются: " Name_Of_Data_Folder.tiff " (где Name_Of_Data_Folder представляет имя папки, предоставленные пользователем), " AUC.tiff, " " Escape_response_all_conditions.tiff, " и " AUC_anova.tiff. " подробная информация о содержании этих графов можно найти в результатах представитель этой рукописи и на рис. 3.

    Результаты

    В протоколе описаны дрозофилы остров анализа данных получения и обработки в три этапа. Во-первых рейс побег ответ дрозофилы брошены на платформу остров записывается с веб-камерой и хранятся в виде отдельных .bmp изображения (разделы 1-7 протокол). Во-вторых «Дрозофилы остров Assay» макро (шаг 8) обрабатывает кадры, создавая «result.txt» текстового файла (таблица 1), в котором приводится количество объектов, обнаруженных в каждом кадре и «Result_stack.tiff», которая показывает стек изображений объекты, обнаруженные в пределах области платформы в каждом кадре. В-третьих сценарий «Остров пробирного анализа» (протокол раздел 9) обрабатывает макросов данные, хранящиеся в файлах «results.txt» отдельных экспериментов. Несколько шагов, включены в сценарий для фильтрации и объединить эти данные для статистического анализа. Первый кадр, в котором мух брошены на платформе обнаружен и считается момент времени 1. Ранее кадры удаляются из набора данных. 100 кадров после времени пункт 1 (соответствует 10 s) выбираются для анализа. Эксперименты, в которых начальное количество мух обнаружены на платформе меньше чем 5 автоматически исключаются из анализа, устраняя ненадежные результаты от недостаточна экспериментов. Эксперименты, в которых начальное количество мух обнаружены на платформе превышает параметр «Количество мух на флакон» плюс допуск 3 также исключаются. Это устраняет наборов данных, в котором шум частицы ошибочно были обнаружены как мухи. Этот сценарий затем вычисляет процент мух, обнаруженные в каждый момент времени по сравнению с наибольшее количество мух, обнаруженных в серии. Исправлены ошибки в наборах данных, вызванные мух, ходьба и уменьшать ROI (определяется как сокращение последующим увеличением доли мух на платформе со временем) автоматически относительно их как неизменно присутствует на платформе на ранних стадиях . Все реплицировать наборов данных для определенного экспериментальные условия, которые были представлены в главном каталоге объединяются и экспортируется в файл «data_all_conditions.csv». Столбцы представляют собой переменные, описанные в таблице 2. Сценарий также будет экспортировать линейную диаграмму для каждого экспериментальные условия, имя папки, содержащей данные. Этот график показывает процент мух, оставаясь на платформе со временем (рейс побег ответ) для экспериментальной реплицирует присутствуют в соответствующей папке ()на рисунке 3A-B). Значит, SD и SEM для каждого экспериментальные условия рассчитаны и обобщены в файле «Статистика summary.csv». Линейный график, под названием «Escape_response_all_conditions.tiff» показывает ответ побег средняя рейс до 12 экспериментальных условиях присутствует в папке основнойРисунок 3 c) (). Наконец площадь под кривой для всех экспериментальных условий в главной папке рассчитывается и обобщены в файле «AUC.csv». В зависимости от количества условий в главной папке, сценарий будет либо выполнить двустороннюю непарных Уэлч t тест (2 условия) или дисперсионный анализ с коррекцией Тьюки для нескольких испытаний (более чем 2 условия) для определения ли экспериментальный условия значительно отличаются друг от друга. Эти результаты кратко изложены в «Welch_t-test_results.txt» или «AUC_anova_results.txt.» При выполнении ANOVA, сценарий также экспортировать файл «AUC_anova.tiff», который отображает разницу в средняя AUC и 95% доверительные интервалы экспериментальных условий, которые сравниваются. Значения абсолютной площадь под кривой экспериментальной реплицирует для всех экспериментальных условиях отображаются в виде отдельных точек данных с медианы в «AUC.tiff» (рис. 3D).

    Атаксия Фридрейха телеангиэктазии (AT) является аутосомно-рецессивный движение расстройство характеризуется ранним началом мозжечковая атаксия из-за мутации гена атаксии телеангиэктазии мутировал (ATM)14. Мутанты Drosophila orthologue ATM, tefu, отображения дефекты в15мобильность и долголетия. Оценить макрос «Дрозофилы остров Assay», дрозофилы модель AT был испытан в assay остров, и вывод данных макрос был по сравнению с ручной данных счетчиков. Результаты показывают, что вездесущие tefu нокдаун (w-; Actin-Gal4/GD11950) значительно снижает способность этих мух оставить платформы по сравнению с их генетический фон управления (w-; Actin-Gal4/+) (Рисунок 4). После 1 s, 50% мух управления бежал платформы, в отличие от < 1% tefu- RNAi летит. Важно отметить, что данные, полученные с макросом точно воспроизведены данные, полученные путем ручной подсчет, указав, что макрос является надежным инструментом, который может использоваться для количественного определения остров анализа данных и оценки движения дефектов ( Рисунок 4 A-B).

    figure-results-1
    Рисунок 1: схема описанием требований, экспериментальной процедуры и анализ остров пробирного. (A) остров пробирного оборудования. (B) экспериментальной установки для assay остров. Остров (C) анализа. (D) обработка данных пробирного остров с макросом «Дрозофилы остров Assay». Макрос «Дрозофилы остров Assay» состоит из 3 вложенные макросы: 1) стека и проекции, 2) определить платформу и 3) анализ. (E) обработка и статистической оценки данных с помощью сценария «Остров пробирного анализа». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

    figure-results-2
    Рисунок 2: примеры различных корректировок, необходимых во время протокол. (A) необходимую структуру каталогов, в котором остров пробирного эксперименты должны храниться для обработки и анализа данных. (.B) при регулировке настройки видео, мухи должны появиться черный на белом фоне. (C) кадр изображения выходных файловкак спас записи изображений программное обеспечение, описанное в этой рукописи. (D) желтый контур показывает выбор платформы. Выбор сохраненной платформы в «Менеджер ROI» выделена синим цветом. (E) мух представлены как белые точки во время регулировки «Лети размер минимальной установки.» Окно результатов показывает область мух в пикселях. (F) пример одного записанного кадра (слева) и соответствующего кадра в стеке результирующего изображения, полученные с макросом «Дрозофилы остров Assay» (справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

    figure-results-3
    Рисунок 3: результат изображения, полученные после обработки данных с помощью скрипта «Остров пробирного анализа» (A) линия график полета побег ответ для каждого управления экспериментальной репликации. (B) линия графике показаны рейса побег ответ для каждого tefu интерференции экспериментальной репликации. (C) средняя рейс побег ответ для указанных экспериментальных условий; планки погрешностей представляют SEM. (D) точка участки, представляющие площадь под кривой распределения для управления и мутантов условий. Экспериментальная реплицирует для обеих tefu интерференции и контроля условий отображаются в виде отдельных точек данных (в черном) с медианы (красная линия). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

    figure-results-4
    Рисунок 4: Повсеместно tefu нокдаун мух показывают значительно снизилась способность оставить платформы. Данные представляют процент мух на платформе со временем (s) для управления (w-; Actin-Gal4/+) и tefu интерференции (w-; Actin-Gal4/GD11950) летит. (количество реплицирует = 5; погрешностей представляют SEM). (A) необработанные данные, полученные с макросом «Дрозофилы остров Assay». (B) точка участки, представляющие площадь под кривой распределения для управления и tefu условий интерференции, полученные с макросом «Дрозофилы остров Assay» (Уэлч непарные t теста, ** p < 0.01). (C) необработанные данные, полученные путем вручную подсчитывать количество мух настоящее время на острове в секунду. (D) точка участки, представляющие площадь под кривой распределения для управления и Tefu RNAi условия, полученные путем подсчета руки (Уэлч непарные t теста, ** p < 0.01). Планки погрешностей представляют SEM. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

    Имя столбцаОписание
    ЛомтикИмя кадра.
    КоличествоКоличество объектов, обнаруженных в кадре в пределах платформы (ROI).
    Общая площадьОбщая площадь объектов, обнаруженных в кадре в пределах платформы (ROI) в пикселях.
    Средний размерОбщая площадь объектов, обнаруженных в кадре, деленное на количество объектов в пределах платформы (ROI).
    % ПлощадиДоля площади, занимаемой объектов по отношению к общей площади платформы (ROI).
    Перим.Общий периметр объектов, обнаруженных в кадре в пределах платформы (ROI) в пикселях.
    Минимальный летатьМинимальный летать параметр Размер определяется пользователем в графическом интерфейсе «Дрозофилы остров Assay» макро (в пикселах).
    Площадь ROIПлощадь платформы (ROI) определяется пользователем во время выполнения макроса, подпункт определить платформу (в пикселах).
    Количество мухКоличество мух, используется на эксперимент, определяется пользователем в графическом интерфейсе макроса «Дрозофилы остров Assay».

    Таблица 1: Параметры измеряется макрос «Дрозофилы остров Assay». Параметры, описанные в этой таблице будут отображаться в файле «results.txt» после запуска макроса «Дрозофилы остров Assay».

    Имя столбцаОписание
    ЛомтикНомер кадра.
    КоличествоКоличество мух, обнаруженных в кадре в пределах платформы (ROI).
    X.AreaОбщая площадь мух, обнаруженных в кадре в пределах платформы (ROI) в пикселях.
    Минимальный летатьМинимальный летать запись размера определяется пользователем в графическом интерфейсе «Дрозофилы остров Assay» макро (в пикселах).
    Площадь ROIПлощадь платформы (ROI, в пикселях) определяется пользователем при запустить вложенный макрос «определение платформы».
    Количество мухКоличество мух, используется на эксперимент, определяется пользователем в графическом интерфейсе макроса «Дрозофилы остров Assay».
    X.Count% летит настоящее на платформе в соответствующих ломтик/кадр относительно наибольшее количество мух, обнаруженных на платформе во время эксперимента.
    TimepointМомент времени 1 представляет первый кадр необходимо проанализировать и соответствует кадру, где мухи впервые появляются на платформе. Есть в общей сложности 100 кадров / репликацию проанализированы (соответствует 10 сек, при использовании описанных параметров.
    ЭкспериментЧисло повторных измерений на условие.
    СостояниеУказывает имя экспериментальные условия (в соответствии с определяемой пользователем имя папки, содержащей данные).

    Таблица 2: получено описание переменных после обработки данных с script. «Остров пробирного анализа» Параметры, описанные в этой таблице отображаются в файле «data_all_conditions.csv» после обработки данных с помощью сценария «Остров пробирного анализа».

    Обсуждение

    Этот протокол описывает «Дрозофилы остров Assay» макрос, который количественно оценивает дрозофилы моторное поведение во время остров assay. Макрос точно рассчитывает мух на платформе со временем, делая пробирного острова весьма деликатного и подходит для количественной оценки высок объём опорно дефектов. Методология позволяет для сравнения каких-либо условий, с мухами, выращенных в условиях различных генетических и/или окружающей среды, включая воздействие наркотиков. Эта индикация таким образом особенно полезным инструментом обнаружения при выполнении больших генетических или фармацевтических экранов, при изучении дрозофилы модели двигательных расстройств и других неврологических заболеваний, или при изучении передвижения или рейса поведение.

    Протокол assay остров, представленные в этой рукописи обеспечивает преимущества перед существующими/альтернативные методы. Например видео слежения локомоции гораздо более трудоемкой и менее пригодны для тестирования больших выборок. Остров представляет собой высокопроизводительного скрининга инструмент и, в этом смысле сопоставимо с Пробирной быстрого интерактивного негативные geotaxis (кольцо)16. Разница между ними является, что остров анализов позволяет для обнаружения более широкий спектр проблем опорно-двигательного аппарата; мух невозможности покинуть платформы могут быть вызваны дефектами в полете, прыжки, или ходить поведение вызвано крыла (мышцы/нейронов) и/или ног (мышцы/нейронов) дефектов. С другой стороны кольцо assay оценивает дефекты в восхождение/ходьба поведения, вызванные дефектами ноги (мышцы/нейронов). В случае, если пользователи заинтересованы в нескольких поведенческих отсчетов, остров assay также легко может сочетаться с другие анализы, например кольцо assay. Кроме того лазеры, необходимых для Оптогенетика может быть легко установлен в поле пробирного остров, и установки настолько прост, его можно легко перенести в помещение, где температура и свет может контролироваться.

    Для обеспечения успеха и воспроизводимость пробирного остров, описанные здесь, должны следовать несколько рекомендаций. Алиготе и передачи мух на экспериментальные испытания ампул по крайней мере за один день до эксперимента, чтобы избежать последствий CO2 или холодной анестезии. Не загромождать экспериментальной флаконы (использовать 10-15 мух на флакон; это лучше всегда разместить такое же количество мух на флакон). Мух на свежие продукты питания на все времена. Если не еще не знакомы с проведением анализа, практика бросать летит на платформу для максимизации доходности. Также практика быстро втягивания руки право впоследствии, как это мешает с анализа данных (анализ изображений и летать, считая начать только после того, как рука находится вне изображения). Держите экологических и экспериментальных условий идентичны в экспериментах, которые нужно сравнить (например, элементов управления и мутанты или генотипа проверял на разных возрастов). Всегда выполнять эксперименты в то же время суток и поддерживать флаконы под контролем температуры и влажности. Для статистической мощности испытания по меньшей мере три технических реплицирует на биологических репликации.

    Для обеспечения успешного выполнения макроса, описанные здесь, параметры веб-камера и изображения должна корректироваться для достижения максимальной контрастности: мухи, появляясь как черные объекты на белом платформе. Когда количество мух не учитываются должным образом макроса, настройки контраста, проверьте, выбран ли должным образом ROI и убедитесь, что размер мух на платформе выше указанного минимума летать размер установки (см. шаг 8.3 настоящего Протокола). Параметры нужно только быть определен только один раз. Они применимы для всех экспериментов, при условии, что расстояние между веб-камерой и платформы не изменяется. Circularity_min и Макс параметры определяют цикличность частиц (частицы = подсчет мух), будут приниматься во внимание для анализа (летает = подсчитываемые объекты). 1 представляет собой идеальный круг, а 0 линия17. Так как мух всегда присутствует определенная степень округлости (летать не может появиться как прямая линия), в 1 устанавливается параметр «Circularity_max» и параметр «Circularity_min» устанавливается на 0,4. Маловероятно, что пользователь должен настроить эти параметры.

    Макрос иногда делает Счетной ошибки, когда Муха расположен недалеко от границы с платформы. Это может произойти, если мухи не могут летать но ходить и из пользовательских ROI. В большинстве случаев изменив ROI (монтаж его как можно больше платформы) может легко решить эту проблему. Однако сценарий «Остров пробирного анализа» способен обнаружить и правильно неправильная данных счетчиков, вызванные мух, ходьба и уменьшать ROI относительно хорошо. Хотя резолюции webcam, представленные здесь достаточно высоки, чтобы дискриминация мух в непосредственной близости от довольно хорошо, мы осуществили дополнительные алгоритмы в процедуре обработки изображений «Дрозофилы остров Assay» макроса, такие как водораздел и подрывают функции17. Это облегчает надлежащее разграничение мух, которые находятся в непосредственной близости на платформе. Кроме того, макрос не может отличить мух, которые прыгали от платформы или летели от него. Тем не менее обычно отмечается, что здоровые молодые летать штаммов улетать сразу при перетаскивании платформы, тогда как старые мух и мух с двигательного дефицита остаться дольше на платформе и будет в конечном итоге перейти или упасть платформа. Несмотря на эти ограничения и пробирного анализа обеспечивают очень точная мера двигательного поведения.

    Для обеспечения успешного выполнения сценария «Остров пробирного анализа», пользователь должен убедиться в том, чтобы ввести правильный путь для ввода и вывода файлов в строках сценария, указывается в протоколе и предоставлять данные в формате правильную папку (как указано на рис. 2). Если пользователь считает критерии, используемые для фильтрации ненадежной экспериментальных данных слишком строгими (строка 68: первое значение в столбце «Подсчитать» является меньше или равно 5; строки 71: первое значение в столбце «Количество» выше, чем общее количество мух, бросили на пла RM + 3), отключить эти параметры фильтра, добавив # перед текст в строках 68 и 71 в сценарии «Остров пробирного анализа». В этом случае все наборы данных будут включены в анализ. Кроме того параметры фильтра можно изменить путем изменения значения в строках, 68 и 71 в зависимости от потребностей пользователя. Можно также вручную отрегулировать возможные артефакты в подсчет значений в «results.txt», созданный макросом «Дрозофилы остров Assay», и сценарий можно запускать повторно, скорректированных данных. Когда пользователь заинтересован в обработке более чем 10 fps, или более чем 10 s данных, количество кадров, обработаны сценарием «Остров пробирного анализа» следуеткорректироваться. Статистический анализ также могут быть заменены пользователем альтернатив.

    Папка с названием «Примеры остров Assay, «содержащие примеры с изображения ряды, полученные с помощью остров assay, можно найти на следующем вебсайте: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.4309652.v1. Скачать папку «Примеры остров Assay» и выполните действия, описанные в настоящем Протоколе, чтобы быстро ознакомиться с структуру файлов хранения, обработки изображения с макросом «Остров дрозофилы пробирного» и «Остров пробирного анализа» сценарий.

    Assay остров, в сочетании с развитыми макро и анализ сценария, может использоваться для оценки и количественного определения ненормальное движение поведение модели дрозофилы атаксия-телеангиэктазии. Так как assay может быть эффективно применен для различных возрастов, он хорошо подходит для анализа потенциально прогрессивный характер фенотипов.

    В целом остров assay, в комбинации с макросом «Дрозофилы остров Assay» и «Остров пробирного анализа» сценарий, является экономически эффективных, надежных и высокоэффективных пробирного объективно проанализировать и определить дефекты опорно- Дрозофила модели двигательных расстройств в духе высокой пропускной способности.

    Раскрытие информации

    Авторы не имеют никаких конфликтов интересов раскрыть.

    Благодарности

    Мы признаем ресурсный центр Вены дрозофилы и Блумингтон дрозофилы фондовый центр (низ P40OD018537) для предоставления штаммов дрозофилы . Мы благодарны Klämbt лабораторию для введения нас остров пробирного и Martijn Eidhof для строительства установки пробирного остров. Это исследование было в поддержке совместной транснациональной вызвать E-редкие-3 части Грант «Подготовка терапии для аутосомно-рецессивный атаксии» подготовка (НВО 9003037604), топ Грант (912-12-109) от Нидерландов организации научных исследований (НВО) и два DCN/Radboud университета медицинский центр PhD стипендии. Спонсоры имел никакой роли в дизайн исследования, сбор данных и анализ, решение опубликовать или подготовка рукописи.

    Материалы

    Список материалов, использованных в этой статье
    ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
    25 x 95 mm Drosophila флаконыFlystuff32-116SB-Logitech
    C525 HD WebcamLogitech-Подойдет любая веб-камера с USB-подключением.
    Подставка для удержания веб-камеры--
    Лампа-лампы 12 В подходят
    Ударная площадка-Подойдет любой коврик для мыши
    -Подойдет островной пробирный бокс--Размеры 40x35x2,5 см. Отверстие 20x30 см. Прозрачное.
    Островная пробирная ванна--Размеры 42x38x25 см. Не белая.
    Остров/платформа-Размеры 42x38x25 см. Однородный белый.
    Мыло-Подходит стандартное средство для мытья посуды.
    Компьютер--Скрипты работают как на Windows, так и на Mac
    Программное обеспечение для записи изображений: HandiAvi® AZcendant® -HandyAvi совместим только с Windows и был описан на протяжении всей рукописи. Его можно скачать из: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (версия 5.0)
    Программное обеспечение для записи изображений: WebcamCapture--Fiji/ImageJ плагин, который можно использовать на Mac альтернативу HandyAvi для записи изображений и можно скачать из: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/ При использовании этого метода пользователь должен использовать ту же настройку папки и настройки записи изображений, указанные в этой рукописи, за исключением того, что для каждого Experimental Replicate, захваченный стек изображений должен быть экспортирован как Stack.tiff в соответствующую папку Experimental Replicate. При запуске макроса "Drosophila Island Assay" на этих данных, в настройке "Идентификатор первого кадра" не должно присутствовать никакого текста.
    Fiji--Version 1.4 или выше, может быть загружен из: https://figshare.com/s/def4197ee0010b21a76f
    R studio--Может быть загружен из: https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/
    R--Версия 3.3.2, может быть загружен из: https://cran.rstudio.com
    -Светодиодные --

    Ссылки

    1. Smeets, C. J., Verbeek, D. S. Cerebellar ataxia and functional genomics: Identifying the routes to cerebellar neurodegeneration. Biochim Biophys Acta. 1842, 2030-2038 (2014).
    2. Liu, Y. T., Lee, Y. C., Soong, B. W. What we have learned from the next-generation sequencing: Contributions to the genetic diagnoses and understanding of pathomechanisms of neurodegenerative diseases. J Neurogenet. 29, 103-112 (2015).
    3. He, J., Mangelsdorf, M., Fan, D., Bartlett, P., Brown, M. A. Amyotrophic Lateral Sclerosis Genetic Studies: From Genome-wide Association Mapping to Genome Sequencing. Neuroscientist. 21, 599-615 (2015).
    4. Lill, C. M. Genetics of Parkinson's disease. Mol Cell Probes. 30, 386-396 (2016).
    5. Bjedov, I., et al. Mechanisms of life span extension by rapamycin in the fruit fly Drosophila melanogaster. Cell Metab. 11, 35-46 (2010).
    6. Hada, B., et al. D-chiro-inositol and pinitol extend the life span of Drosophila melanogaster. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 68, 226-234 (2013).
    7. Schmidt, I., et al. Kinesin heavy chain function in Drosophila glial cells controls neuronal activity. J Neurosci. 32, 7466-7476 (2012).
    8. Kochinke, K., et al. Systematic Phenomics Analysis Deconvolutes Genes Mutated in Intellectual Disability into Biologically Coherent Modules. Am J Hum Genet. 98, 149-164 (2016).
    9. Volkenhoff, A., et al. Glial Glycolysis Is Essential for Neuronal Survival in Drosophila. Cell Metab. 22, 437-447 (2015).
    10. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
    11. R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. (2008).
    12. RStudio Team. RStudio: Integrated Development for R. , Available from: http://www.rstudio.com (2015).
    13. Greenspan, R. J. Fly pushing: the theory and practice of Drosophila genetics. , 2nd ed, John Inglis. (2004).
    14. Rothblum-Oviatt, C., et al. Ataxia telangiectasia: a review. Orphanet J Rare Dis. 11, 159(2016).
    15. Petersen, A. J., Rimkus, S. A., Wassarman, D. A. ATM kinase inhibition in glial cells activates the innate immune response and causes neurodegeneration in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, E656-E664 (2012).
    16. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp Gerontol. 40, 386-395 (2005).
    17. ImageJ User Guide - IJ 1.46. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html (2012).

    Перепечатки и разрешения

    Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

    Запросить разрешение

    Теги

    FijiR

    Похожие статьи