Объединение рамановских изображений и многофакторного анализа для визуализации лигнина, целлюлозы и гемицеллюлозы в стенке клетки растения

Summary

Этот протокол призван представить общий метод визуализации лигнина, целлюлозы и гемицеллюлозы в растительных клеточных стенках с использованием рамановского изображения и многомерного анализа.

Abstract

Применение изображений Raman для выращивания биомассы возрастает, поскольку оно может предлагать пространственную и композиционную информацию о водных растворах. Анализ обычно не требует обширной подготовки проб; Структурная и химическая информация может быть получена без маркировки. Однако каждый рамановский образ содержит тысячи спектров; Это создает трудности при извлечении скрытой информации, особенно для компонентов с аналогичными химическими структурами. В этой работе представлен многомерный анализ для решения этой проблемы. Протокол устанавливает общий метод визуализации основных компонентов, включая лигнин, целлюлозу и гемицеллюлозу в стенке растительной клетки. В этом протоколе описаны процедуры подготовки образцов, спектрального сбора и обработки данных. Он сильно зависит от навыков оператора при подготовке проб и анализе данных. Используя этот подход, рамановское расследование может быть выполнено неспециалистским пользователем для полученияH-качества и значимых результатов для анализа клеточной стенки растений.

Introduction

Растительная биомасса является самым распространенным возобновляемым ресурсом на Земле; в основном состоит из лигнина, целлюлозы и гемицеллюлозы; и считается привлекательным источником биоэнергии и биохимических веществ¹. К сожалению, он может противостоять деградации и придавать гидролитическую стабильность или структурную прочность клеточной стенке растения. Такая стойкость обусловлена доступной площадью поверхности, размером частиц биомассы, степенью полимеризации, кристалличностью целлюлозы и защитным классом лигнина². Таким образом, всестороннее понимание структурной и химической природы клеточной стенки растений имеет важное значение с точки зрения биологии и химии растений, а также с точки зрения коммерческого использования. Обычно используемые методы мокрой химии, такие как хроматография, масс-спектрометрия и спектроскопия ядерного магнитного резонанса, позволяют получить только средние данные о составе измеряемого образца. Кроме того, эти методы являются инвазивными и разрушают исходную структуру растительной ткани class³.

Метод рамановской визуализации является мощным инструментом для неразрушающей визуализации пространственно разрешенной химической информации⁴. Он использует лазерный свет для вызова неупругого рассеяния фотоном и полагается на изменения поляризуемости, возникающие в результате молекулярных колебаний. В этом случае вода вызывает слабое комбинационное рассеяние, что делает этот подход подходящим для исследований биологических образцов in situ<sup class='xref'>5. Применение метода рамановской визуализации к клеточной стенке растений может пролить свет на структуру и состав клеточных стенок растений в их естественном состоянии с разрешением в масштабе отдельной клетки и даже слоев клеточной стенки⁶. Типичный анализ клеточной стенки растения с помощью комбинационной визуализации обычно состоит из трех этапов: 1) подготовка образца, 2) получение спектра и 3) обработка данных.

Хотя одним из основных преимуществ рамановской визуализации является возможность получения безметочных и неразрушающих спектров с минимальной подготовкой образца, физическое срезирование образца все еще необходимо для выявления интересующей поверхности. Этот процесс следует выполнять осторожно для получения плоской поверхности, так как техника зависит от поддержания оптического focus⁷. Спектральная съемка требует баланса между качеством изображения и длительным временем захвата⁸. Обработка данных направлена на эффективное извлечение химической информации из данных изображения, особенно для компонентов со схожей химической структурой, таких как целлюлоза и гемицеллюлоза. Из-за сильного пересечения спектров точные спектры трудно различить. В этом случае многомерный анализ является простым подходом к эффективному раскрытию скрытой структурной и химической информации⁹. В данной работе представлен общий протокол, описывающий использование комбинационной визуализации для визуализации основных компонентов в клеточных стенках растений, включая лигнин, целлюлозу и гемицеллюлозу.

Protocol

1. Подготовка образца

1. Вырежьте небольшой образец ткани (около 3 мм х 3 мм х 5 мм) из образца растения ( например, стебель тополя).
2. Погрузите ткань в кипящую деионизированную воду в течение 30 мин. Немедленно переносите его в деионизированную воду при комнатной температуре (RT) в течение 30 минут. Повторите этот шаг, пока ткань не опустится до нижней части контейнера, что указывает на то, что воздух в ткани был удален и что ткань смягчилась.
   Примечание. Для образцов, которые опускаются на дно до этого шага, обычно повторяйте этот цикл 3-5 раз.
3. Подготовьте 20, 50, 70, 90% (об. / Об.) Аликвоты полиэтиленгликоля (ПЭГ) в деионизированной воде, а также чистый ПЭГ и поддерживайте растворы при 65 ° С.
4. Инкубируйте ткань в серии градуированных ванн PEG, чтобы вытеснить воду и позволить ПЭГ проникать.
   Примечание. Обычно для встраивания используется ПЭГ с молекулярной массой 2000 (PEG2000).
   1. Обработать ткань с помощью g(А) 20% ПЭГ в течение 1 ч, (б) 50% ПЭГ в течение 1,5 ч, (с) 70% ПЭГ в течение 2 ч, (г) 90% ПЭГ в течение 2 ч и (E) 100% ПЭГ в течение 10 ч.
5. Предварительно нагрейте кассету при 65 ° C в духовке. Налейте ПЭГ, содержащий блок, в кассету, а затем поместите блок ткани в нужное положение, используя предварительно разогретые пинцеты или иглы.
6. Медленно остывайте кассету и храните ткань при комнатной температуре до использования.
7. Раскройте блок ПЭГ, содержащий ткань-мишень, в небольшой блок (около 1 см х 1 см х 2 см), используя острый лезвие бритвы и установите его на микротом.
8. Вырезать тонкие секции из блока ПЭГ (обычно 3-10 мкм).
9. Промойте секцию деионизированной водой в часовом стекле 10 раз, чтобы удалить ПЭГ из ткани.
10. Погрузите секции толуолом / этанолом (2: 1, об. / Об.) В течение 6 часов, чтобы удалить экстракторы. Подготовьте реакционную жидкость, смешав 65 мл деионизированной воды, 0,5 мл уксусной кислоты и 0,6 г хлорида натрияОбряд в стакане. Добавьте один участок и 3 мл реакционной жидкости в 5 мл флакон. Вверните верхнюю часть флакона.
11. Нагреть флакон в водяной бане при 75 ° C в течение 2 часов для удаления лигнина ткани. Промойте секцию деионизированной водой в часовом стекле 10 раз.
12. Перенесите необработанную / делигнифицированную секцию на слайд стеклянного микроскопа. Разверните секцию осторожно, используя кисти или иглы. Удалите лишнюю деионизированную воду с помощью бумажной салфетки.
13. Погрузите секцию в D ₂ O. Накройте образец прокладкой из стеклянной крышки. Уплотните крышку с помощью лака для ног, чтобы предотвратить испарение D ₂ O.

2. Спектральное приобретение

1. Откройте программное обеспечение для работы с прибором конфокального рамановского микроскопа. Включите лазер (длина волны = 532 нм), сосредоточьтесь на поверхности кристаллического кремния с объективом 100X микроскопа и нажмите кнопку калибровки для калибровки прибора.
2. Переключить инструментВ режим оптического микроскопа и включите лампу микроскопа. Установите скобу микроскопа на сцене, при этом обложка крышки обращена к объективу.
3. Просмотрите образец с объективом микроскопа 20X и найдите интересующую область. Нанесите погружное масло на покровное стекло и переключитесь на объектив погружного микроскопа (60X, числовая апертура NA = 1,35). Сосредоточьтесь на поверхности образца.
4. Переключите прибор в режим проверки комбинационного рассеяния и выключите лампу микроскопа.
5. Выберите область отображения с помощью прямоугольного инструмента. Измените размер шага, чтобы определить количество полученных спектров.
   Примечание. Помните о размере шага (обычно большем, чем диаметр пятна, рассчитанный с помощью числовой апертуры объекта, теоретически 1,22λ / NA). Размеры ниже этого приведут к передискретизации.
6. Установите оптимальные спектральные параметры для получения наилучшего отношения сигнал / шум (SNR) и спектрального качества в соответствующее время сбора (обычно <8 ч), depeНа пригодность образца. Как правило, вводятся параметры изображения в программном обеспечении следующим образом: лазер (532 нм), фильтр (100%), отверстие (300), щель (100), спектрометр (1840 см ^-1 ), канавки (1200 т), объектив ( 60X) и время сбора (2 с).
7. Сохраните спектральные данные перед обработкой данных и преобразуйте их в универсальный формат ( например, файлы TXT).

3. Анализ данных

1. Загрузите спектральные данные (файлы TXT) в программное обеспечение для анализа данных ( например, Matlab). Примените метод шумоподавления в наборе данных для улучшения SNR ( например, алгоритм Савицкого-Голея или алгоритм вейвлета)
2. Используйте необработанные образцы для получения изображений лигнина и полисахаридов. Для визуализации лигнина рассмотрим спектральный пик около 1600 см ^-1 из-за симметричного колебания растяжения ароматического кольца. Для получения полисахаридов (включая целлюлозу и гемицеллюлозу) используйте спектральный пик aВокруг 2889 см ^-1 из-за растяжения CH и CH ₂ .
3. Используйте делигнифицированные образцы для получения изображений целлюлозы и гемицеллюлозы. Выполните разрешение самомодельной кривой (SMCR) на полученных спектрах для выделения спектров целлюлозы и гемицеллюлозы и изображения их распределений.
4. Выполните анализ основных компонентов (PCA) и анализ кластеризации по полученным данным, чтобы отличить спектры комбинационного рассеяния от разных слоев клеточных стенок.

Results

На рисунке 1 представлен обзор типичной системы микрораманов для рамановской визуализации стенки клетки растения. В качестве примера, исходные спектры комбинационного рассеяния тополя ( Populus nigra L.) имеют значительные базовые дрейфы и всплески ( рис. 2а ). После выполнения автоматического метода предварительной обработки для набора данных изображений Raman (APRI) эти два спектральных загрязнителя успешно удаляются ...

Discussion

Растительная клеточная стенка представляет собой композит, который состоит из нескольких слоев, включая угол ячейки (CC), вторичную стенку (SW, с слоями S1, S2 и S3) и составную среднюю пластинку (CML, средняя ламелла плюс смежная первичная Стенки), что затрудняет получение плоской поверхности во время подготовки образца. Таким образом, образцы растений, особенно травы, которые имеют более сложную структуру, чем древесина, часто необходимо затвердевать, чтобы обеспечить тонкое разделение. ПЭГ - идеальная твердая матрица...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microtome	Thermo Scientific	Microm HM430
Конфокальный рамановский микроскоп	Horiba Jobin Yvon	Xplora
Oven	Shanghai ZHICHENG	ZXFD-A5040