Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Стандартизованный подход к многовидовой очистке клеток мужского германия млекопитающих с помощью механической диссоциации тканей и проточной цитометрии

11.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55913

⸱

12 июля 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Genetics, Washington University School of Medicine, 2Graduate Program in Areas of Basic and Applied Biology (GABBA), Abel Salazar Institute of Biomedical Sciences, University of Porto, 3Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, University of Porto, 4IPATIMUP - Instituto de Patologia e Imunologia Molecular da Universidade do Porto, 5Department of Pathology & Immunology, Washington University School of Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этой работе описывается стандартизация метода получения очищенных популяций зародышевых клеток из ткани яичка различных видов млекопитающих. Это простой протокол, который объединяет механическую диссоциацию яичка, окрашивание Hoechst-33342 и пропидиум иодидом и сортировку FACS с широким применением в сравнительных исследованиях мужской репродуктивной биологии.

Аннотация

Флуоресцентно-активированная сортировка клеток (FACS) была одним из методов выбора для выделения обогащенных популяций клеток яичек млекопитающих. В настоящее время он позволяет различать до 9 популяций половых клеток мыши с высоким выходом и чистотой. Это высокое разрешение в отношении дискриминации и очистки возможно благодаря уникальным изменениям структуры и количества хроматина во всем сперматогенезе. Эти образцы могут быть захвачены проточной цитометрией мужских половых клеток, окрашенных флуоресцентными ДНК-связывающими красителями, такими как Hoechst-33342 (Hoechst). Здесь представлено подробное описание недавно разработанного протокола для выделения клеток яичек млекопитающих. Вкратце, одноцепочечные суспензии образуются из ткани тестикулята механической диссоциацией, дважды окрашиваются Hoechst и пропидиум иодидом (PI) и обрабатываются проточной цитометрией. Последовательная стратегия стробирования, включая выбор живых клеток (отрицательный PI) с различным содержанием ДНК (интенсивность Хоэста), iS, используемые во время сортировки FACS, чтобы различать до 5 типов зародышевых клеток. К ним относятся, с соответствующей средней чистотой (определяемой с помощью оценки микроскопии): сперматогония (66%), первичные (71%) и вторичные (85%) сперматоциты и сперматиды (90%), далее разделенные на круглые (93%) и удлиненные (87%) субпопуляций. Выполнение всего рабочего процесса является простым, позволяет одновременно изолировать 4 типа ячеек с соответствующей машиной FACS и может выполняться менее чем за 2 часа. Поскольку сокращение времени обработки имеет решающее значение для сохранения физиологии клеток ex vivo , этот метод идеально подходит для исследований с высокой пропускной способностью по сравнению с биохимией мужских половых клеток. Более того, стандартизованный протокол для многовидовой очистки зародышевых клеток млекопитающих исключает методологические источники переменных и позволяет использовать один набор реагентов для разных моделей животных.

Введение

Учитывая отсутствие системы in vitro , представляющей прогрессию сперматогенеза, а также наличие большой клеточной гетерогенности в яичках, исследования биологии клеток мужских половых клеток требуют надежных методов выделения обогащенных популяций конкретных типов клеток. Для этой цели широко используется флуоресцентная сортировка клеток (FACS) 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , так как она обеспечивает высокий выход и чистоту и превосходит другие методы изоляции в количестве типов зародышевых клеток, которые она может идентифицировать и Выберите 6 , 7 , 8 . Принцип анализа проточной цитометрии основан на обнаружении дифференциальных световых образцов после лазерного возбуждения одиночных клеток. Когда камера проходит через лазер, она отражает / рассеивает светПри всех углах, пропорциональных размеру ячейки (прямое рассеяние, FSC) и внутриклеточной сложности (боковой разброс, SSC). См. Ormerod 9 для получения подробной информации о проточной цитометрии.

Мужские зародышевые клетки подвергаются специфическим модификациям в отношении содержания ДНК, структуры хроматина, размера и формы на разных стадиях сперматогенеза. Таким образом, отдельные клеточные популяции могут быть идентифицированы и разделены путем объединения рассеяния света и окрашивания ДНК флуоресцентными красителями 10 , 11 . Для этой цели можно использовать несколько красителей (обзор в Geisinger и Rodriguez-Casuriaga 3 ), такой как Hoechst-33342 (Hoechst), который часто использовался в проточном цитометрическом анализе клеток тестикула в течение последнего десятилетия 1 , 2 , 4 , 10 , 12 . UpoN возбуждение ультрафиолетовым излучением, Hoechst излучает синюю флуоресценцию, пропорциональную содержанию клеточной ДНК, тогда как красная флуоресценция отражает изменчивость структуры хроматина и уплотнения 1 , 13 , 14 . В результате мужские зародышевые клетки на разных стадиях дифференцировки проявляют специфические закономерности во время FACS окрашенных Hoechst одноклеточных суспензий (Ho-FACS, 1 , 12 ). Интересно, что из-за механизма оттока красителя, который активен только на стадии сперматогона, интенсивность синей флуоресценции Хехста не пропорциональна содержанию хроматина в этих клетках, и они группируются как побочная популяция во время Ho-FACS 15 . Кроме того, объединение Hoechst-окрашивания с иодидом пропидиума без проницаемости (PI) позволяет пользователям различать живые (отрицательные значения PI) из мертвых (PI-положительных) клеток во время FACS 1 , 2 , 10 , 12 . Эта стратегия ранее использовалась в проточных цитометрических анализах яичек зародышевых клеток и интенсивно оптимизировалась у мышей, чтобы различать до 9 типов зародышевых клеток, включая клетки на 4 разных стадиях мейоза I 1 , 2 , 4 , 16 . Для целей этой работы окрашивание Hoechst имеет три основных преимущества. Во-первых, Ho-FACS успешно применяется для выделения мужских зародышевых клеток в мышиной модели 1 , 2 , 12 и других грызунов, таких как крыса и морская свинка 17 , 18 , 19 . Во-вторых, Hoechst является клеточно-проникающим красителем и не требует мембранной проницаемости, поэтому онVes. Наконец, никакой обработки РНКазой не требуется, так как Hoechst связывается преимущественно с поли (d [AT]) последовательностями ДНК 1 , 20 , что означает, что РНК сохраняется и, помимо ДНК и белков, может быть использована для последующих молекулярных исследований зародышей Клеточной дифференцировки.

Несмотря на сходство в плоидности и / или бледности ДНК, наблюдаемую при анализе проточной цитометрии видов млекопитающих (рассмотренная в Geisinger и Rodriguez-Casuriaga 3 ), в протоколах, описанных для выделения мужских зародышевых клеток методом проточной цитометрии, была значительная изменчивость. В различных исследованиях использовались конкретные протоколы для диссоциации тканей и использовались различные ДНК-связывающие красители (отдельно или в комбинации) и стратегии стробирования FACS у разных модельных организмов, главным образом мыши, крысы и морской свинки. Следовательно, прямое сравнение данных, собираемых для разных видов, может быть затронутоНеиспользованные технические артефакты, возникающие в результате изменчивости между методологиями. Важно отметить, что поразительное сохранение динамики хроматина во всем сперматогенезе млекопитающих (2N-4N-2N-1N) предполагает, что стандартизованный протокол может быть поперечно применен к различным видам млекопитающих.

Целью этого исследования было разработать единый рабочий процесс, применимый к различным видам млекопитающих, путем комбинирования и адаптации ранее опубликованных методов 2 , 20 . Стандартизация метода для обработки тканей была достигнута путем проведения механической диссоциации для преодоления потребности в видоспецифических корректировках, необходимых для ферментативного расщепления 5 . Следует отметить, что механическая диссоциация ткани тестикулярного грызуна показала, что она лучше, чем ферментативное переваривание ткани 20, и Ho-FACS одноцепочечных суспензий, генерируемых обоими методами, проявляютЭто сопоставимые результаты 5 . В качестве доказательства принципа этот протокол описывает параметры, используемые для выделения до 5 популяций зародышевых клеток: сперматогония (SPG); Первичный (SPC I) и вторичные сперматоциты (SPC II) и сперматиды (SPD) - круглые (rSPD) и удлиненные (eSPD). Важно отметить, что это легко осуществить в лаборатории, причем основными требованиями являются система диссоциации тканей и доступ к сортировщику клеток, оснащенному УФ-лазером. Этот рабочий процесс ( рис. 1 ) является быстрым и прямым и позволяет одновременное выделение 4 популяций зародышевых клеток из свежей ткани тестикула менее чем за 2 часа. Сокращение времени обработки имеет решающее значение для поддержания целостности сотовой связи для последующих последующих процедур. Более того, его успешная работа у 5 разных видов предполагает, что он может широко применяться в клане млекопитающих, что делает его идеальным методом для выделения зародышевых клеток для сравнительных исследований репродуктивного биола млекопитающихгия.

Этот протокол состоит из трех основных разделов, за исключением подготовительных этапов: (1) механическая диссоциация ткани яичка и (2) окрашивание тестикулярных клеток с помощью Hoechst и PI, а затем (3) сортировка FACS соответствующих сперматогенных клеток. После сбора этих обогащенных популяций различных клеток яичек млекопитающих можно использовать для широкого спектра применений. В этом протоколе описывается метод «единственного размера для всех» диссоциации для очистки мужских половых клеток от многих видов млекопитающих. В зависимости от типа исследования, которое пользователи хотят проводить с изолированными зародышевыми клетками, могут использоваться другие носители или буферы. Следующие этапы протокола предназначены для получения одноцепочечных суспензий из одного целого мышиного яичка.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все описанные ниже процедуры соответствовали положениям Комитета по изучению животных в Вашингтонском университете в Сент-Луисе.

1. Подготовка к протоколу механической диссоциации

  1. Предварительно намочите картридж для дезагрегации одноразовой ткани размером 50 мкм для диссоциации всего мышиного яичка.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Этот картридж для дезагрегации одноразовых тканей содержит микроблаты, предназначенные для резки тканей и неподвижной стальной сетки с примерно 100 гексагональными отверстиями. Доступны различные размеры сетки для картриджа дезагрегации ткани для адаптации этого протокола на основе видов и желаемых типов клеток. Патроны размером 50 мкм использовались для всех видов млекопитающих, упомянутых в этой статье.
    1. Загрузите 1 мл ледяного фенолового красного, освобожденного 1 раза Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), на картридж для дезагрегации одноразовых тканей размером 50 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Красный красный может помешать обнаружению красных флуоресценцийВо время FACS.
    2. Аспират 1x DMEM из картриджа для дезагрегации ткани с одноразовым шприцем без иглы 3 мл из шприца.
  2. Включите систему дезагрегации тканей, нажав кнопку «ON». Эта система не требует «разогрева».
  3. Предварительно намочите три 40 мкм одноразовых фильтра с ледяной 1х DMEM. Поместите каждый 40 мкм одноразовый фильтр на коническую трубку объемом 50 мл. Пипетируйте 1 мл 1x DMEM и пропускайте жидкость.
  4. Подготовьте чашку Петри 100 мм х 15 мм для сбора тканей тестикулярных тканей. Внесите 500 мкл 1x DMEM на чашку Петри.

2. Подготовка ткани яичек для протокола механической диссоциации

  1. Препарируйте мышь мужского пола, чтобы тщательно удалить свежие целые семенники или яичные фрагменты (если они имеют дело с другими видами млекопитающих) с помощью хирургических ножниц и щипцов.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Убедитесь, что в тканях нет жира и некроза. Fr Esh тестикулярные ткани производят превосходное одноклеточное качество суспензии, чем замороженные ткани.
    1. Перенесите собранные семенники / фрагменты в подготовленную чашку Петри размером 100 мм х 15 мм, содержащую 500 мкл 1x DMEM.
    2. Осторожно промойте ткань в 1x DMEM, чтобы удалить эритроциты (если они есть).
  2. Осторожно удалите тунику albuginea. Толщина оболочки albuginea будет варьироваться у разных видов.
    1. Возьмите один конец яичка с помощью щипцов.
    2. Проколоть другой конец яичка скальпелем, все еще удерживая один конец яичка с помощью щипцов с предыдущего шага.
    3. Скребьте тестикулярные канальцы с помощью скальпеля, все еще удерживая один конец семенника с помощью щипцов с шага 2.2.1.
  3. Отрежьте тестикулярные канальцы на кусочки 2-3 мм 3, используя скальпель.

3. Получение одноклеточных суспензий путем механической диссоциации ткани яичек

Ontent "> ПРИМЕЧАНИЕ. Шаги диссоциации, описанные ниже, предназначены для одного взрослого мышиного яичка. Соответственно должны быть скорректированы объемы тканей тестикулярных клеток от несовершеннолетних мышей или немышечных видов. Несовершеннолетние животные могут не содержать всех стадий зародышевых клеток. Некоторые виды млекопитающих имеют Изменение состава ткани тестикулярной ткани в течение сезонов размножения по сравнению с нерегулярным сезоном.

  1. Перенесите мелкие кусочки тестикулярной трубочки в предварительно смоченный 50-миллиметровый картридж для дезагрегации ткани с помощью щипцов и добавьте 1 мл 1x DMEM.
  2. Загрузите картридж для дезагрегирования ткани в систему дезагрегации ткани и обработайте в течение 5 минут, повернув ручку из режима ожидания в режим «запуска».
  3. Удалите картридж для дезагрегации ткани из системы дезагрегации ткани и суспензию суспензии аспирата с помощью одноразового шприца без иглы объемом 3 мл из шприца.
    1. Аспирируйте несколько раз, чтобы удалить всю жидкость из картриджа для дезагрегации ткани. НеВсе 1 мл могут быть извлечены из картриджа дезагрегации ткани.
  4. Пропустите аспирационную суспензию клеток через два одноразовых предварительно смоченных фильтра 40 мкм. Отфильтруйте дважды, чтобы удалить любые ячейки.
    1. Поместите один предварительно смачиваемый фильтр 40 мкм в коническую трубку объемом 50 мл. Непосредственно добавьте аспирационные клетки в шприц на фильтр 40 мкм. Пипетируйте сквозную одноклеточную суспензию с помощью одноразовой пипетки.
    2. Удалите использованный предварительно смачиваемый фильтр 40 мкм и поместите еще один предварительно смоченный 40 мкм фильтр в 50-миллилитровую коническую трубку. Пипетируйте собранную суспензию с одной ячейкой на чистый фильтр 40 мкм.
    3. Соберите фильтрованную одноклеточную суспензию с помощью чистой одноразовой пипетки.
  5. Пипеткой отфильтровать клеточную суспензию обратно в картридж для дезагрегации ткани размером 50 мкм и обработать еще 5 минут в системе дезагрегации ткани.
  6. Восстановите всю жидкость из дезагрегата тканиНа картридже.

4. Окрашивание с помощью Hoechst и Propidium Iodide (PI)

  1. Перенесите восстановленную клеточную суспензию из картриджа для дезагрегации ткани размером 50 мкм в чистую пробирку объемом 1,5 мл. Приблизительно 1-1,5 мл одноцепочечной суспензии будут выделены.
  2. Разделите восстановленную одноклеточную суспензию на четыре пробирки объемом 1,5 мл или 5 мл.
    1. Для первых трех пробирок пипеткой 150 мкл одноклеточной суспензии и пипеткой остатков одноклеточной суспензии в последнюю из четырех трубок (приблизительно 550 мкл одноцепочечной суспензии).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Количество одноцепочечной суспензии в последней трубке может изменяться в зависимости от эффективности восстановления суспензии клеток на этапе 3.6.
  3. Установите первую трубку из четырех трубок как неокрашенный контроль для сеанса FACS.
  4. Подготовьте суспензии клеток с окрашенными красителями (PI или Hoechst) в качестве контролей. Добавьте 2,5 мкл Hoechst или 1 мкл PI в каждую пробирку (вторая и thiе).
  5. Подготовьте двойную окрашенную трубку. Это будет использоваться для сбора субпопуляций зародышевых клеток. Добавьте 2,5 мкл Hoechst и 1 мкл PI к последней пробирке.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Срок хранения Hoechst составляет 2-3 месяца. Использование старых запасов красителя приведет к значительным изменениям во время сеанса FACS.
  6. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте. Поместите образцы в ротатор трубки или инвертируйте 1,5 мл пробирки каждые 5-10 минут.
  7. Суспензию фильтрующего элемента с предварительно смоченным фильтром на 40 мкм и оставляют отфильтрованный раствор на льду и в темноте до сеанса FACS.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Шаг фильтрации необходим для предотвращения клеточных глыб для FACS. Кроме того, для ограничения клеточного клеща можно использовать обработку ДНКазой (см. Рис. 1 ) или дикалиевую соль 2-Нафтол-6,8-дисульфоновой кислоты (NDA 20 ). Длительные периоды ожидания влияют на флуоресцентный сигнал, обнаруженный во время FACS, и могут приводить к увеличению гибели клеток.

5. Флуоресценция активированной сортировки клеток (FACS) Установка и очистка клеток яичек

  1. Подготовьте трубы для сбора FACS.
    1. Пальто 5 мл полипропиленовые круглодонные трубки или 1,5 мл пробирки с 400 мкл FBS для сбора клеток. Декантируйте избыток FBS после покрытия.
    2. Добавьте в пробирки среду для сбора FACS (1x DMEM + 10% Fetal Bovine Serum, FBS): 1 мл для 5 мл пробирки или 100 мкл для 1,5 мл пробирки.
  2. Настройте соответствующие условия сортировки в сортировщике и программном обеспечении.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Другие сотовые сортировочные машины и программное обеспечение для анализа могут использоваться с аналогичными стратегиями установки и стробирования, описанными ниже. Условия, описанные здесь, были адаптированы из Гайсинской и Бортвин- 2 , Гейсингера и Родригеса-Казуриага- 3 , а Гетун и др. 4
    1. Загрузите ультрафиолетовый лазер с 463/25 нм полосовой фильтр для обнаружения фильтра Hoechst blue и 680 нм LP-диапазона для обнаружения Hoechst red и обнаружения PI.
    2. Используйте дихроичное зеркало 555DLP, чтобы отличить синий от красной флуоресценции.
    3. Используйте сопло и сортировочные ячейки размером 70 мкм со скоростью 1000-2000 ячеек в секунду.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Эффективность сортировки напрямую зависит от скорости потока. Высокие скорости потока (> 3500 событий / с) увеличивают скорость сортировки, но приводят к загрязнению популяций. См. Ссылку 12 для получения дополнительной информации.
  3. Установите ворота, используя контрольные образцы.
    1. Загрузите и запустите неокрашенный образец.
    2. Исключить клеточный мусор на основе графика FSC и SSC. В нижнем левом квадранте участка появится всплеск клеток. Произвольно устанавливают пороговое значение для клеточного мусора пользователем или специалистом по сортировке клеток.
    3. Ворота на отдельных ячейках путем регулировки порога для FSC и ширины импульса. У разных сортировщиков ячеек разные способы различенияGuish синглеты. Поскольку ширина импульса отражает временные ячейки для пересечения лазера, одиночные клетки имеют более низкие значения по сравнению с многоклеточными агрегатами. Регулирующий порог на графике для FSC по сравнению с шириной импульса может использоваться для выбора синтаксиса.
    4. Установите оптимальные напряжения фотоумножителя (PMT).
    5. Используйте как неокрашенные, так и окрашенные одним красителем клетки, чтобы установить порог сигнала флуоресценции PI или Hoechst.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Важно оптимизировать базовые напряжения ПТМ для интересующих клеток, чтобы установить правильный диапазон флуоресценции для каждого красителя. Это важно для оптимального обнаружения сигнала и чувствительности. Неокрашенные и одиночные окрашенные контрольные клетки используются для создания диапазона отрицательно и положительно окрашенных клеток с красителями PI и / или Hoechst и минимизации шума в сигналах. Для дальнейших объяснений по оптимизации напряжения PMT с помощью контрольных ячеек, пожалуйста, обратитесь к Gaysinskaya and Bortvin 2
    6. Ворота на живой клеткеS на основе окрашивания PI (отрицательный PI) и участка FSC. Мертвые клетки будут положительными для флуоресценции ПИ.
    7. Установите ДНК-содержимое, построив гистограмму подсчета клеток на основе синей флуоресценции Hoechst. Должны появиться 3 пика с возрастающими концентрациями синей флуоресценции Hoechst, представляющие гаплоидные (1C), диплоидные (2C) и тетраплоидные (4C) клетки. Установите 3 затвора, по одному для каждого пика.
    8. Наблюдайте не менее 500 000 событий на участке FSC и SSC, прежде чем приступать к стробированию популяций зародышевых клеток.
  4. Ворота различных популяций зародышевых клеток.
    1. Загрузите образец Hoechst / PI.
    2. Установите первые 3 родительских ворот, которые являются общими для всех групп населения.
      1. Исключить клеточный мусор, основанный на графике FSC и SSC. Выбирайте синглеты на основе графика FSC по длине импульса. Выберите живые клетки, закрыв отрицательные ячейки PI.
    3. Определите ворота сперматогонии.
    4. Плоские отрицательные клетки PI на основе синей и красной флуоресценции Hoechstинтенсивности. Сперматогония проявляется как побочная популяция (см. Рис. 1 ).
    5. Определите ворота для остальных популяций зародышевых клеток. ПРИМЕЧАНИЕ. Для получения дополнительной информации см. Рисунок 1 и дополнительную цифру 2.
    6. Участок отрицательных клеток PI в воротах содержимого ДНК.
      1. Для ворот сперматид пик с наименьшей флуоресценцией Хёхста (1С).
      2. Для сперматоцитов II задерживают пик с промежуточной флуоресценцией Хёхста (2С).
      3. Для сперматоцитов I, задерживают пик с наивысшей флуоресценцией Хёхста (4C).
    7. График интенсивности синей и красной флуоресценции Hoechst для уточнения популяций сперматоцитов и сперматид из ворот ДНК-содержимого.
  5. Соберите выбранные субпопуляционные ворота в предварительно собранные трубки для сбора. Каждый семенник будет принимать в среднем от 45 мин до 1,5 ч для сбора приблизительно 0,5-6,0 × 10 6 клеток для каждой субпопуляции.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Длительное воздействие клеток на Hoechst maY слегка сдвигают местоположение популяций со временем. Обновите настройки после 20-30 минут FACS. Максимальный выход для каждой субпопуляции будет зависеть от эффективности этапа диссоциации.

6. Микроскопическая оценка очищенных клеток

  1. Спин собирал клетки при 500-600 мкг при 4 ° С в течение 10 мин.
  2. Повторно суспендируют клеточный осадок с 1 мл ледяного 1х раствора фосфатного буфера (PBS) или 1x DMEM.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Объем повторной суспензии можно отрегулировать в соответствии с количеством отсортированных ячеек и желаемой конечной концентрацией.
  3. Нанесите 40 мкл промытых клеток на чистый стеклянный предмет и поместите покровное стекло.
  4. Закрепите оставшиеся клетки 4% параформальдегидом (PFA) и храните фиксированные клетки при температуре 4 ° C в темноте для дальнейшего использования.
    1. Внесите 100 мкл 4% PFA непосредственно в сборные трубки.
    2. Кратко встряхните трубки или пипетки несколько раз, чтобы обеспечить хорошее перемешивание клеточной суспензии.
  5. Визуализируйте подготовленные слайды в микроскопе, оснащенном УФ-лампой для обнаружения флуоресценции Хёхста под объективом 63X. Обратитесь к разделу «Результаты» - «Морфологическая оценка популяций отсортированных зародышевых клеток» - для получения дополнительной информации о том, как идентифицировать конкретные типы зародышевых клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Одноцепочечные суспензии от механической диссоциации ткани яичка

На рисунке 2 сравниваются одноцепочечные суспензии, полученные механической диссоциацией ткани яичек мыши в разных условиях. Образцы, полученные путем обработки свежей ткани, неокрашенные ( рис. 2А ) или окрашенные Hoechst ( рис. 2B ), показывают наличие отдельных клеток на раз...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Учитывая высокую консервативную динамику хроматина во время сперматогенеза у млекопитающих, целью этой работы было разработать протокол для выделения мужских половых клеток на разных стадиях дифференциации от различных тканей яичек млекопитающих ( рис. 1 ). Одним из основных препятствий при применении одного рабочего процесса к различным моделям животных является потребность в видоспецифических корректировках, особенно в отношении протоколов диссоциации тканей. Существующие методы в основно...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Все авторы не заявляют никаких конкурирующих интересов.

Благодарности

Авторы благодарят больницу Hillside Animal Hospital (Сент-Луис, Миссури) для собак; Джейсон Аранд и лаборатория доктора Теда Цицерона в Вашингтонском университете в Сент-Луисе (WashU) за предоставление крысиных яичек и Брайан Таберс для оказания помощи в сборе; Джаред Харток и лаборатория доктора Солт в WashU для яиц морских свинок; И д-р Майкл Тэлкотт в Отделе сравнительной медицины в WashU для миниатюрного свиного яичка. Авторы также признают Раковый центр Элвина Дж. Ситмана в Школе медицины Вашингтонского университета и Барнс-еврейскую больницу в Сент-Луисе, штат Миссури, за использование ячеистого цитометрического ядра Siteman, который предоставил персональную службу сортировки клеток. Рак-центр Siteman частично поддерживается грантом поддержки NCK Cancer Center № P30 CA91842.

Это исследование было профинансировано докторантурой FCT [SFRH / BD / 51695/2011 до ACL], грантами от Национального института здоровья США [R01HD078641 и R01MH101810 до DFC] и исследовательский контракт FCT [IF / 01262/2014 на AML].

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
4% параформальдегидVWR#157104% PFA, Для фиксации отсортированных клеток
MedimachineBD Biosciences#340588;Система для диссоциации яичек
1X Dulbecco модифицированный Eagle mediumLife Technologies#31053DMEM, для диссоциации яичек
MediconBD Biosciences#340591Картридж для дезагрегирования яичек
Фетальная бычья сывороткаThermo Scientific#10082139FBS, для коллекции FACS
Hoechst 33342Invitrogen#H3570Hoecsht, для окрашивания
FACS40 & микро; m клеточный фильтрGREINER BIO-ONE#89508-342Для диссоциации яичек
100x 15 мм чашка ПетриFalcon#351029Для диссекции яичек
5 мл полипропиленовые трубки с круглым дномFalcon#352063Для сбора FACS
1,5 мл Eppendorf пробиркиVWR#20170-650Для сбора FACS
3 мл ненужного шприцаBD Biosciences#309657Для диссоциации яичка
50 мл коническая трубкаMIDSCIДля диссоциации яичка 
Йодид пропидияInvitrogen#L7011PI, для окрашивания FACS
MoFlo Legacy cell sorterBeckman Coulter#ML99030для FACS
Summit Cell Sorting программное обеспечениеBeckman Coulter#ML99030для FACS
фосфатный буферный физиологический растворThermo Scientific#AM9625PBS, для микроскопии
Микроскопическое предметное стеклоFisher Scientific#12-544-4Для микроскопии
Стеклянный покровный листFisher Scientific#12-548-87Для микроскопии
Одноразовая переводная пипетка (3 мл)Samco Scientific#225Для диссоциации яичек
DNase IRoche#10104159001Для диссоциации яичек
Хирургическое лезвие из углеродистой сталиMiltex#4-111Для диссекции яичек
Графиня автоматический счетчик клетокInvitrogen#C10227Для автоматического подсчета клеток
Trypan blue solution (0.4%)Sigma#T8154Для окрашивания жизнеспособности
#C50R

Ссылки

  1. Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).
  2. Gaysinskaya, V., Bortvin, A. Flow cytometry of murine spermatocytes. Curr Protoc Cytom. 72, (2015).
  3. Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. Flow cytometry for gene expression studies in Mammalian spermatogenesis. Cytogenet Genome Res. 128 (1-3), 46-56 (2010).
  4. Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J Vis Exp. (50), (2011).
  5. Lima, A. C., et al. Multispecies Purification of Testicular Germ Cells. Biol Reprod. , (2016).
  6. Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation. J Vis Exp. (80), (2013).
  7. Chang, Y. F., Lee-Chang, J. S., Panneerdoss, S., MacLean, J. A. 2nd, Rao, M. K. Isolation of Sertoli, Leydig, and spermatogenic cells from the mouse testis. Biotechniques. 51 (5), (2011).
  8. Margolin, G., Khil, P. P., Kim, J., Bellani, M. A., Camerini-Otero, R. D. Integrated transcriptome analysis of mouse spermatogenesis. BMC Genomics. 15, 39(2014).
  9. Ormerod, M. G. Flow Cytometry - A Basic Introduction. , Available from: http://flowbook.denovosoftware.com/ (2008).
  10. Grogan, W. M., Farnham, W. F., Sabau, J. M. DNA analysis and sorting of viable mouse testis cells. J Histochem Cytochem. 29 (6), 738-746 (1981).
  11. Mays-Hoopes, L. L., Bolen, J., Riggs, A. D., Singer-Sam, J. Preparation of spermatogonia, spermatocytes, and round spermatids for analysis of gene expression using fluorescence-activated cell sorting. Biol Reprod. 53 (5), 1003-1011 (1995).
  12. Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes. Cytometry A. 85 (6), 556-565 (2014).
  13. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
  14. Watson, J. V., Nakeff, A., Chambers, S. H., Smith, P. J. Flow cytometric fluorescence emission spectrum analysis of Hoechst-33342-stained DNA in chicken thymocytes. Cytometry. 6 (4), 310-315 (1985).
  15. Lassalle, B., et al. 'Side Population' cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells. Development. 131 (2), 479-487 (2004).
  16. Omran, H. M., Bakhiet, M., Dashti, M. G. DNA integrity is a critical molecular indicator for the assessment of male infertility. Mol Med Rep. 7 (5), 1631-1635 (2013).
  17. Rodriguez-Casuriaga, R., Folle, G. A., Santinaque, F., Lopez-Carro, B., Geisinger, A. Simple and efficient technique for the preparation of testicular cell suspensions. J Vis Exp. (78), (2013).
  18. Rodriguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santinaque, F. F., Lopez-Carro, B., Folle, G. A. High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells. Cytometry A. 79 (8), 625-634 (2011).
  19. Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye. MethodsX. 1, 239-243 (2014).
  20. Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis. Biol Proced Online. 11, 184-195 (2009).
  21. Hess, R. A., Renato de Franca, L. Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. Adv Exp Med Biol. 636, 1-15 (2008).
  22. Zhao, H., Traganos, F., Dobrucki, J., Wlodkowic, D., Darzynkiewicz, Z. Induction of DNA damage response by the supravital probes of nucleic acids. Cytometry A. 75 (6), 510-519 (2009).
  23. Gassei, K., Ehmcke, J., Dhir, R., Schlatt, S. Magnetic activated cell sorting allows isolation of spermatogonia from adult primate testes and reveals distinct GFRa1-positive subpopulations in men. J Med Primatol. 39 (2), 83-91 (2010).
  24. Hayama, T., et al. Practical selection methods for rat and mouse round spermatids without DNA staining by flow cytometric cell sorting. Mol Reprod Dev. 83 (6), 488-496 (2016).
  25. Zhu, L., et al. FACS selection of valuable mutant mouse round spermatids and strain rescue via round spermatid injection. Zygote. 23 (3), 336-341 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Hoechst
Стандартизованный подход к многовидовой очистке клеток мужского германия млекопитающих с помощью механической диссоциации тканей и проточной цитометрии
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.