Стандартизованный подход к многовидовой очистке клеток мужского германия млекопитающих с помощью механической диссоциации тканей и проточной цитометрии

Ana C. Lima; Min Jung; Jannette Rusch; Abul Usmani; Alexandra M. Lopes; Donald F. Conrad

doi:10.3791/55913

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Стандартизованный подход к многовидовой очистке клеток мужского германия млекопитающих с помощью механической диссоциации тканей и проточной цитометрии

11.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55913

⸱

12 июля 2017 г.

Ana C. Lima^*¹^,²^,³^,⁴ , Min Jung^*¹ , Jannette Rusch¹ , Abul Usmani¹ , Alexandra M. Lopes³^,⁴ , Donald F. Conrad¹

¹Department of Genetics, Washington University School of Medicine, ²Graduate Program in Areas of Basic and Applied Biology (GABBA), Abel Salazar Institute of Biomedical Sciences, University of Porto, ³Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, University of Porto, ⁴IPATIMUP - Instituto de Patologia e Imunologia Molecular da Universidade do Porto, ⁵Department of Pathology & Immunology, Washington University School of Medicine

^* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этой работе описывается стандартизация метода получения очищенных популяций зародышевых клеток из ткани яичка различных видов млекопитающих. Это простой протокол, который объединяет механическую диссоциацию яичка, окрашивание Hoechst-33342 и пропидиум иодидом и сортировку FACS с широким применением в сравнительных исследованиях мужской репродуктивной биологии.

Аннотация

Флуоресцентно-активированная сортировка клеток (FACS) была одним из методов выбора для выделения обогащенных популяций клеток яичек млекопитающих. В настоящее время он позволяет различать до 9 популяций половых клеток мыши с высоким выходом и чистотой. Это высокое разрешение в отношении дискриминации и очистки возможно благодаря уникальным изменениям структуры и количества хроматина во всем сперматогенезе. Эти образцы могут быть захвачены проточной цитометрией мужских половых клеток, окрашенных флуоресцентными ДНК-связывающими красителями, такими как Hoechst-33342 (Hoechst). Здесь представлено подробное описание недавно разработанного протокола для выделения клеток яичек млекопитающих. Вкратце, одноцепочечные суспензии образуются из ткани тестикулята механической диссоциацией, дважды окрашиваются Hoechst и пропидиум иодидом (PI) и обрабатываются проточной цитометрией. Последовательная стратегия стробирования, включая выбор живых клеток (отрицательный PI) с различным содержанием ДНК (интенсивность Хоэста), iS, используемые во время сортировки FACS, чтобы различать до 5 типов зародышевых клеток. К ним относятся, с соответствующей средней чистотой (определяемой с помощью оценки микроскопии): сперматогония (66%), первичные (71%) и вторичные (85%) сперматоциты и сперматиды (90%), далее разделенные на круглые (93%) и удлиненные (87%) субпопуляций. Выполнение всего рабочего процесса является простым, позволяет одновременно изолировать 4 типа ячеек с соответствующей машиной FACS и может выполняться менее чем за 2 часа. Поскольку сокращение времени обработки имеет решающее значение для сохранения физиологии клеток ex vivo , этот метод идеально подходит для исследований с высокой пропускной способностью по сравнению с биохимией мужских половых клеток. Более того, стандартизованный протокол для многовидовой очистки зародышевых клеток млекопитающих исключает методологические источники переменных и позволяет использовать один набор реагентов для разных моделей животных.

Введение

Учитывая отсутствие системы in vitro , представляющей прогрессию сперматогенеза, а также наличие большой клеточной гетерогенности в яичках, исследования биологии клеток мужских половых клеток требуют надежных методов выделения обогащенных популяций конкретных типов клеток. Для этой цели широко используется флуоресцентная сортировка клеток (FACS) ¹ ^, ² ^, ³ ^, ⁴ ^, ⁵ , так как она обеспечивает высокий выход и чистоту и превосходит другие методы изоляции в количестве типов зародышевых клеток, которые о....