Method Article

Флуоресценции опосредованной томография для выявления и количественной оценки мышиных кишечного воспаления Макрофаг связанных

DOI:

10.3791/55942

⸱

December 15th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine B, University Hospital Münster, 2Translational Research Imaging Center, Department of Clinical Radiology, University Hospital Münster

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Целевой объект специфического датчики представляют инновационный инструмент для анализа молекулярные механизмы, такие как выражение протеина в различных типах болезни (например, воспаление, инфекция и опухолей). В этом исследовании мы описывают количественную оценку трехмерной томографических кишечных макрофагов инфильтрации в мышиных модель колита с использованием конкретного/80-F4 флуоресценции опосредованной томография.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мышиных моделях заболеваний необходимы для научных исследований. Однако многие средства диагностики эндоскопия или томографических изображений не используются регулярно в животных моделях. Обычные экспериментальной отсчетов часто полагаются на посмертное и ex vivo анализов, которые препятствуют внутри отдельных последующих экзаменов и увеличить количество животных исследования необходимы. Флуоресценции опосредованной томография позволяет неинвазивные, повторяющихся, трехмерные и количественные оценки флуоресцентных зондов. Она очень чувствительна и разрешает использование молекулярных органов, которая позволяет для обнаружения конкретных и характеристик различных молекулярных целей. В частности целевые датчики представляют инновационный инструмент для анализа экспрессии генов активации и белков в воспаление, аутоиммунные заболевания, инфекции, заболевания сосудов, миграции клеток, tumorigenesis, и т.д. В этой статье мы предоставляем пошаговые инструкции на этой сложной визуализации технологии для обнаружения в естественных условиях и характеристика воспаления (т.е., F4/80-позитивных макрофагов инфильтрации) в широко используемых мышиных модели кишечные воспаления. Этот метод может также использоваться в других областях исследований, как иммунные клетки или стволовых клеток отслеживания.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Животные модели широко используются в научных исследованиях, и многие неинвазивные процедуры существуют для монитора активности заболевания и жизнеспособность, таких как количественная оценка изменения веса тела или анализ крови, мочи и Кала. Однако это только косвенные замещающих параметров, которые также подлежат межличностная изменчивость. Они часто должны дополняться посмертное анализ образца ткани, которая предотвращает последовательного наблюдения на время повторяющихся точек и прямых наблюдений физиологических и патологических процессов в естественных условиях. Появились сложные методы визуализации малых животных, в том числе кросс-секционные изображений, оптических изображений и эндоскопия, который позволяет прямой визуализации этих процессов, а также позволяет для повторных анализов же животных1 , 2 , 3. Кроме того, возможность многократного контролировать различные состояния болезни в то же самое животное может уменьшить количество животных необходимо, которые могли бы быть желательным с точки зрения животных этики.

Несколько различных оптических изображений методы существуют в vivo флуоресценции изображений. Первоначально конфокальная томография использовалась для изучения поверхностных и подповерхностных флуоресцентные события4,5. Недавно однако, томографические системы, которые позволяют для оценки количественных трехмерные ткани были развитые6. Это было достигнуто путем разработки флуоресцентных зондов, которые излучают свет в ближней ИК-области спектра (NIR), предлагая низкой абсорбцией, чувствительных детекторов и монохроматического света источников7. Хотя традиционные срезов тепловизионные методы такие как компьютерная томография (КТ), магнитно-резонансная томография (МРТ) или УЗИ (США), полагаться главным образом на физических параметров и визуализации морфологии, оптических изображений могут предоставить дополнительную информацию на базовом молекулярных процессов с использованием эндогенного или экзогенного флуоресцентных зондов8.

Достижения в области молекулярной биологии помогли облегчить поколения интеллектуальных и целенаправленных флуоресцентных зондов молекулярные для все большего числа целей. К примеру рецептор опосредованный поглощения и распределения в области заданного целевого объекта могут быть визуализированы с помощью карбоцианиновыми антител, меченных производная9. Обилие доступных антител, которые могут быть помечены в качестве конкретных индикаторов в недоступные участки тела, обеспечивает беспрецедентные понимание молекулярных и клеточных процессов в моделях tumorigenesis и нейродегенеративные, сердечно-сосудистые, иммунологические и воспалительных заболеваний7.

В этом исследовании мы описывают использование флюоресценции опосредованной томография в мышиных модель колита. Декстран сульфат натрия (DSS)-индуцированного колит это стандартная модель химически индуцированных мыши кишечного воспаления, что напоминает воспалительное заболевание кишечника болезнь (IBD)10. Это особенно полезно оценить вклад иммунной системы до развития воспаления кишечника11. Поскольку набор, активации и проникновение моноцитов и макрофагов представляют собой важнейшие шаги в патогенезе IBD, Визуализация их найма и кинетика инфильтрации имеют важное значение для мониторинга, например, эффект потенциал лечебных веществ в доклинических параметр12. Мы опишем индукции DSS колит и продемонстрировать томография опосредованной характеристика макрофагов инфильтрации в слизистую оболочку кишки с помощью молекулярных томография флуоресценции для конкретных визуализации моноцитов/макрофагов маркера F4/80 13. Кроме того, мы показываем вспомогательные и дополнительные процедуры, такие как антитела маркировки; экспериментальная установка; и анализа и интерпретации полученных изображений, в корреляции с обычными отсчетов такие индексы активности болезни, поток цитометрии и гистологический анализ и иммуногистохимии. Мы обсуждаем ограничения этой техники и сравнения с другими визуализации формы.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты на животных были утверждены шведским für натур, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen согласно немецкого закона о защите животных (Tierschutzgesetz).

1. материалы и экспериментальной установки

  1. Уход за животными.
    1. Использование пола и возраста соответствием мышей любой DSS-подвержены деформации (например, C57BL/6) на 20-25 г веса.
    2. План по крайней мере пять или более мышей в экспериментальной группе и Дом мышей согласно рекомендациям местного ухода за животными.
    3. Предоставить стандартный грызунов Чоу диеты и автоклавного питьевой воды ad libitum.
    4. Удалите стандартные Чоу и заменить его бесплатно люцерны Чоу по меньшей мере три дня до начала сканирования для уменьшения эндолюминальные auto флуоресценции.
  2. Индукция острого колита DSS-индуцированной.
    1. Растворите 2 g DSS (молекулярный вес ~ 40,000 Da) в 100 мл газобетона питьевой воды для получения на 2% (w/v решение).
    2. Заполнить питьевой мышей исключительно с DSS решения и оценить 5 мл жидкости на мышь в день. Обеспечить же питьевой воды без DSS в мышах управления10.
      Примечание: Монитор мышей ежедневно до конца эксперимента. Усыпить мышей, потерять больше, чем 20% от их первоначального веса или умирающий, которые стали (то есть, упорно сгорбившись осанки, снижение движения, трудился дыхание, заметно возводить пальто) согласно местных применимые руководящие принципы на животных благосостояния.
  3. Подготовка флуоресценции опосредованной томография.
    1. Ярлык желаемого антител (например, крыса анти мыши F4/80) с флуоресцентной краской (например, Cyanine7, λвозбуждения: 750 нм, λвыбросов: 776 Нм) как описано в протоколе производителя. Dialyze очищенных антител в соответствующей диализа мембраны (размер пор < 50-100 кДа) против 1 Л 0,15 М натрия хлорида для по крайней мере 2 часа или на ночь.
      1. Передача антитела к 1 Л 0,1 М NaHCO3 и dialyze для минимум 2 ч.
      2. Растворить необходимое количество Люминесцентную краску в диметилсульфоксида (ДМСО) (10,8 мкл/мг антитела) и добавить его в раствор антител. Используйте Люминесцентную краску кратной Молярная сверх для достижения краситель белка соотношение 1:3.
      3. Инкубировать в темноте при температуре 4 ° C для 1 h. удалить немеченого антитела диализа против 1 Л 0,15 М натрия или с помощью столбца опреснительной адаптер PD-10 и решимость в фосфат амортизированное saline (PBS) для применения в естественных условиях .
      4. Определите окончательный антитела концентрации и маркировки соотношение методом спектрофотометрии.
      5. Измерить концентрацию белка на поглощение 250-330 Нм и рассмотреть дополнительные поглощение красителя. Исправить максимум поглощения в 280 Нм (белка), 11% максимум поглощения в 750 Нм (следующий шаг) для маркировки Cyanine7.
      6. Измерения разрежения соединение (обычно 1:10) на 250-800 Нм и извлечь концентрацию Cyanine7 на 750 Нм.
      7. Определить коэффициент краситель белка как: краска/антитела = максимальное поглощение на 750 Нм / 200000 / (максимум поглощения в 280 Нм - 0,11 х Макс поглощения на 750 Нм) / 170 000.
      8. Держите раствор антител на 4 ° C и защитить его от света во избежание обесцвечивания перед инъекцией.
    2. Загрузите необходимые антитела объема раствора в стерильный шприц непосредственно перед инъекций и щит от света до тех пор, пока он используется.
    3. Определите оптимальные сроки введения зонда и сканирования, в зависимости от трассирующими Фармакокинетика.
    4. Анестезировать мышей, с помощью изофлюрановая 1,5-2,5% вдыхают кислород или надежно разместить их в специальный фиксатор для инъекции Вену хвост помечены антител.
    5. Для полнометражных антител придать обозначенное антитело по крайней мере 24 ч до начала сканирования, такие как анти мыши F4/80 макрофагов визуализации в мышиных колит. Внутривенно вводить мышей (и.в.) через хвост вен с обозначенное антитело в сумму, соответствующую 2.0 нмоль красителя.
    6. Использование одинаково помечены неспецифических антител (например, крыса IgG или другой изотипа соответствующее основное антитело наследия) как элемент изотипа в дозах эквивалентные тем конкретным зонда.
      Примечание: Результаты в vivo сканирование после инъекции комплекса управления может служить ориентиром для толкования конкретного ПЭП, визуализации данных.
    7. Использование электрической бритвой бриться мех животных в области живота, чтобы свести к минимуму световое отражение и поглощение.

2. техническое оснащение

  1. Используйте устройство ветеринарных флуоресценции опосредованной томография (ДРМ) для малых животных флуоресцирования ( рис. 4).
  2. Создайте новое исследование для каждого проекта, нажав кнопку «Новое исследование» кнопку и включить в исследование описание соответствующих индикаторов, включая изображений параметры и доз для будущей справки.
  3. В рамках этого исследования, создание исследовательских групп согласно дизайн соответствующие исследования (например, для конкретных трассирующими и неспецифическим изотипа контроля), нажав кнопку «Новая исследовательская группа» кнопку. Оснащения каждой исследовательской группы с соответствующим количеством животных.
  4. Калибровки системы для трассировочного конструкций.
    1. Выполните калибровку для каждого пакета Трейсеры нормализовать вариации в маркировке и дать количественное измерение данным OI.
    2. Следуйте рекомендациям производителя прибора для калибровки каждой отдельной системе; При выборе «Добавить новый трассировочный» эта система будет обеспечивать руководство через шаги. Обеспечивают разбавления раствор прикладной антител и рассчитанные абсолютной концентрации трассирующими зонда.
    3. ДРМ использовать ткани подражая Фантом характеристик определенной толщины и поглощения (напоминающие жизненно важные ткани) и заполнить его с конкретным объемом используется раствор антител. Эта мера на устройстве ДРМ.
      Примечание: Система будет использовать ссылку измерение предоставленных зонда, вместе с заданной концентрации, для вычисления абсолютного трассирующими концентрации от будущего в естественных условиях измерения.
  5. Использовать нагреваемые экспертизы кассету с температурой от 42 ° C.
    Примечание: Это предотвращает мышей становится гипотермического во время экзамена.

3. животных анестезии

  1. Использовать непрерывный поток 1,5-2% vol % изофлюрановая ([2-chloro-2-(difluoromethoxy)-1,1,1-trifluoro-ethane]) и 1.5 L O2мин., чтобы анестезировать мышей.
Используйте специально ингаляции систем для анестезии грызунов (изофлюрановая испаритель) легко контролировать глубины анестезии и для сведения к минимуму воздействия сотрудников.
  • Поместите указатель мыши в индукции герметичной камере и включите испаритель для питания изофлюрановая (100% (v/v), 5 vol % кислорода, 3 Л/мин). Монитор мыши до тех пор, пока это лежачие и бессознательное.
  • Поместите его в экзамен кассету для томографии, с непрерывной изофлюрановая ингаляции через носовой конус в дозе 100% v/v, 1.5 vol % кислорода, 1,5 Л/мин для сведения к минимуму движение артефакты во время экспертизы. Для процедур длится дольше, чем 5 минут применить глазную мазь для мыши глаза, чтобы предотвратить повреждение роговицы.
  • Оценки глубины анестезии, проверяя рефлексов. Положите мыши на его обратно; При достаточной анестезии, мышь не должны повернуть вокруг. Щепотка мыши мягко между ее ног; При достаточной анестезии, ноги не будет снята (стадия хирургического толерантности).

    • 4. флуоресценции опосредованной томографическое сканирование

    Примечание: Адаптировать следующие детали, которые являются специфическими для ДРМ система, используемая в этом исследования (см. Таблицу материалов) для альтернативных флуоресценции отражения тепловизионных устройств или систем ДРМ, при необходимости.

    1. Место наркотизированных мышь на его обратно в кассету экзамен.
    2. Процедура сканирования.
      1. Вставьте кассету в тепловизионной системы и закройте его немедленно обеспечить непрерывное обезболивание. Выберите соответствующий образец из исследовательской группы, созданные ранее. Выберите управляемые tracer в раскрывающемся меню для обеспечения правильно рассчитанные значения концентрации трассировщик.
      2. Приобрести флуоресценции отражения изображения в соответствующие волны (720 Нм для Cyanine7) для планирования сканирования и наброски поля сканирования, нажав кнопку «получить изображение со сканера».
      3. Смотрите, что поля сканирования отображается как наложения на изображение отражения флуоресценции. Настроить его на области интереса (например, двоеточие или живота), избегая воздуха или районах оставшихся меха. В зависимости от изображения установите количество изображений точек данных в пределах области сканирования, выбрав из грубого среднего и мелкого резолюции поля сканирования в меню справа.
        Примечание: Имейте в виду, что штраф сканирования поля может предложить лучше пространственным разрешением за счет сканирования значительно больше времени.
      4. Начать приобретение данных/изображения на выбранной длине волны, нажав кнопку «Сканировать».
        Примечание: Время сканирования для проверки средне тонкий целом живота будет около 5 мин; в это время каждая точка данных отдельно освещен лазерным возбуждением, и записан результирующий флуоресценции.
      5. Удаление животное из изображений кассету в конце сканирования и позволяют животное, чтобы восстановить полностью перед установкой его обратно в клетке.
      6. Повторите ДРМ, если сочтет это необходимым в различные моменты времени в ходе эксперимента (например, дни 0, 5 и 9-10 (конец эксперимента)), но рассмотреть накопление антител в организме, поэтому увеличение фонового сигнала флуоресценции.

    5. После сканирования

    1. Поместите указатель мыши в отдельной клетке на бумажное полотенце под лампой потепления красный свет и контролировать мышь для признаков дискомфорта или бедствия до полного восстановления. Поместите курсор мыши обратно в его соответствующей клетке, когда полностью проснуться.
    2. Усыпить мышей в конце эксперимента по доставке CO2 в изолятор в дозе 100% (v/v), 100 vol % и 3 Л/мин. Не предварительно заполнить камеры с CO2, как внезапное воздействие высоких концентраций CO2 может привести к беде. Проверьте смерти после того, как мышь остановилось дыхание последующих вторичный режим эвтаназии как быстрое шейки матки дислокации.
    3. Explant толстой кишки по брюшной полости лапаротомия и выполнить проверку ex vivo explanted толстой кишки, как описано в шагах 4.2.1 - 4.2.4. Откройте каждый Колон, продольно с помощью Metzenbaum Ножницы хирургические и тщательно промыть физиологическим раствором перед подготовкой для дальнейшего анализа.
    4. Используйте скальпель вырезать фрагмент 0,5 см от дистальной части толстой кишки и сразу же поместить его в трубу криогенных 1,5 мл. Замораживания ее в жидком азоте и хранить на-70 ° C до дальнейшего использования (например,миелопероксидаза (МПО) измерения).
    5. Используйте деревянную палочку и свернуть оставшиеся продольно открыт двоеточие от дистальной к проксимального конца, с слизистой оболочки наружу («рулет техника»), для гистологического анализа. Место подготовки в фиксатор (см. Таблицу материалы) и заморозить-80 ° C14.

    6. данные восстановления и интерпретация

    1. Используйте средство восстановления соответствующих изображений программное обеспечение для создания 3D карты распределения флуоресценции из необработанных изображений данных; сканирование автоматически добавляются к средству восстановления, когда при сканировании, функция «добавить в очередь реконструкции» выбран.
      1. В противном случае выберите сканирования в раскрывающемся меню под соответствующие исследования и исследовательская группа, щелкните правой кнопкой мыши Проверка и выберите «Добавить к восстановлению».
    2. Для дальнейшего анализа Загрузите набор данных в программное обеспечение для анализа. В раскрывающемся меню в верхней панели выберите соответствующие исследования, а затем выберите исследовательской группы и отдельных животных из меню справа; будут показаны все проверки, выполняемые для этого животного. Выберите правильный сканирования и нажмите кнопку «Загрузить».
      Примечание: 3D-реконструкции трассировщик распределения будет отображаться на левой стороне как наложение изначально приобретенных флуоресценции отражения изображения. Модель можно поворачивать и увеличенное для облегчает анализ.
    3. Выявление очагов накопления (например, печень или мочи мочевого пузыря) неспецифических ярлык на реконструированной 3D картах и дифференцировать от тканях (например, кишки или кишечника).
    4. Из верхней панели выберите форму ROI, наиболее подходящим для целевого объекта. Ткани-мишени ярлык как регионы интереса (ROI), поместив соответствующие инструменты измерения в программное обеспечение для анализа; программное обеспечение будет предоставлять интенсивности флуоресценции для рентабельности, а также (Пико-) Молярная количество трассировщик, сканирования откалиброван для.
    5. Выберите общее количество трассировочных в соответствующие ROI, нормированный ROI размера, как наиболее подходящий эквивалент для оценки активности болезни в корреляции с воспалительного инфильтрата (гистология).
      Примечание: Другие особенности ROI может быть выбран при необходимости как представителя определенной модели.

    7.Ex Vivo Анализы

    1. Гематоксилином и эозином и пятнать иммунофлюоресценции.
      1. Deparaffinize разделы, помещая их в 70% этанола (EtOH) 2 мин; Потом смойте дистиллированной воды. Пятно с гематоксилином решение для 5 мин и затем промойте теплой проточной воде в течение 10 мин.
      2. Промыть дистиллированной водой, изображение с раствором эозина за 2 мин и снова промыть дистиллированной водой.
      3. Место в 70% EtOH, 96% EtOH, 99% EtOH и ксилола (2 раза) за 2 мин каждая обезвоживает и очистить разделы. Крепление с смолистые монтажа средних.
    2. Иммунофлюоресценции пятнать.
      1. Используйте разделы ранее полученных ткани («рулет») для окрашивания иммунофлюоресценции и подготовить крио cut разделы 7 мкм.
      2. Заблокировать разделы ацетон исправлена и замороженных Колон в 5,0% крыс сыворотка для 10 мин и проинкубируйте ночь с разбавленным (1/500 v/v) биотинилированным первичной крыса анти мыши F4/80 антитела. Вымойте разделы трижды в трис амортизированное saline (TBS) и проинкубируйте с стрептавидина-FITC (1: 100 v/v) в PBS/BSA (0,1% w/v) на ночь при 4 ° C.
      3. Мыть в подразделах TBS и пятен с 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1: 1000 v/v), для достижения контраста. Анализ изображения флуоресценции под конфокального микроскопа (см. Таблицу материалов; 40 кратном куб Н2.1 фильтров с фильтром возбуждения 515-560) и рассчитывать F4/80-положительных клеток одного мощного поля.
        Примечание: Используйте антитела же клон и формат при объединении в vivo ДРМ и посмертное гистология анализы как иммуногистохимия или окрашивание иммунофлюоресценции, в зависимости от намеченной цели. Для обнаружения F4/80-позитивных макрофагов в естественных условиях и ex vivoбыли использованы различные форматы.
    3. MPO измерения в образцах толстой кишки.
      1. Использование свежей получены, PBS-промыть Колон образцы или талой образца для MPO измерений. Взвесить все образцы и гомогенизации ткани литического буфера в ELISA комплекта (см. Таблицу материалов) в объеме 20 мкл буфера lysis на мг ткани.
      2. Sonicate 15 s (sonication частота: 20 кГц, мощность: 70 Вт) и Центрифугуйте образцы на 10 минут при 200 x g и 4 ° C.
      3. Использование коммерчески доступных ELISA комплекта (см. Таблицу материалы) согласно описанию производств. Проводить испытания в дубликаты.

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Results

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Оценка колит:

    DSS-индуцированной колит является химически индуцированных мышиных модель кишечного воспаления, что напоминает человека IBD и приводит к потере веса, ректальное кровотечение, поверхностные изъязвления и повреждение слизистой оболочки в восприимчивых мышей15. Это особенно полезно для изучения вклада иммунной системы к развитию воспаления кишечного10

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Discussion

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Хотя медицинские методы визуализации быстро эволюционировали в последние годы, мы по-прежнему ограничены в нашу способность обнаруживать воспалительных процессов или опухоли, а также других заболеваний на ранних стадиях развития. Однако это имеет решающее значение для понимания опухолевого роста, вторжения, или развития метастазов и клеточных процессов в развитии воспалительных и дегенеративных, сердечно-сосудистой и иммунологических заболеваний. Хотя традиционные методы визуализации полагаются на физических или физиолог...

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Disclosures

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Авторы не имеют ничего сообщать.

    Acknowledgements

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Мы благодарим г-жа Соня Dufentester, г-жа Elke Вебер и миссис Klaudia Niepagenkämper за отличную техническую помощь.

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Materials

    List of materials used in this article
    NameCompanyCatalog NumberComments
    <сильно>Реагенты
    Безлюцерновая диетаHarlan Laboritories, Мэдисон, США2014
    Бепантенская глазная мазьBayer, Леверкузен, Германия80469764
    Декстрана сульфат натрия (DSS)TdB Consulatancy, Уппсала, ШвецияDB001
    EosinSigma - Aldrich, Deisenhofen, ГерманияE 4382
    Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)                                                 Sigma - Aldrich, Дайзенхофен, ГерманияE 9884
    Florene 100V/VAbbott, Wiesbaden, ГерманияB506
    Гематоксилин                                                                                                       Sigma - Aldrich, Дайзенхофен, ГерманияHHS32-1L
    O.C.T. Тканевый Тек компаунд                                                                 Sakura, Zoeterwonde, Нидерланды4583фиксатор для гистологических анализов
    Фосфат буферизованный физиологический раствор, PBSLonza, Verviers, Бельгия4629
    Хлорид натрия 0,9%Braun, Мельзунген, Германия5/12211095/0411
    Порошок бикарбоната натрияSigma Aldrich Deisenhofen,Германия S5761
    Стандартная диетаAltromin, Lage, Германия1320
    Tissue-Tek CryomoldSakura, Лейден, Нидерланды4566
    Hemoccult (бумажный тест на гваяковой бумаге)Beckmann Coulter, Германия3060
    Биотин-анти-мышиный анти-F4/80 антителоSerotec, Оксфорд, ВеликобританияMCA497B
    Биотин-крыса-анти-мышь анти-GR-1 BD Pharmingen, Гейдельберг Германия553125
    Streptavidin-Alexa546, Дармштадт, ГерманияS-11225556/573 нм
    Anti-CD11b антитело против мыши TCCalteg, Берлингейм, СШАR2b06
    Очищенное антитело против мыши F4/80BioLegend, Лондон, Великобритания123102
    DAPISigma-Aldrich, Deisenhoffen, ГерманияD9542
    FITC-конъюгированное антитело против Ly6C крысы и мышиBD Pharmingen, Гейдельберг, Германия553104
    буфер FACSBD Pharmingen, Гейдельберг, Германия342003
    Cy7 NHS EsterGE Healthcare  Европа, Фрайбург, ГерманияPA17104
    MPO ELISAImmundiagnostik AG, Бенсхайм, ГерманияK 6631B
    Cy5.5 меченое антитело против мыши F4/80BioLegend, Лондон, Великобритания123127готовые к применению меченые антитела (альтернатива)
    Anti-mouse F4/80 Antigen PerCP-Cyanine5.5eBioscience, Waltham, США45-4801-80готовые к применению меченые антитела (альтернатива)
    ДМСО (диметилсульфоксид)Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Германия67-68-5
    ИзофлуранSigma-Aldrich, Deisenhoffen, Германия792632
    этанолSigma-Aldrich, Deisenhoffen, Германия64-17-5
    Бычьи сывороточные альбумины (BSA)Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, ГерманияA4612
    Трис-буферизованный физиологический раствор (TBS)Sigma-Aldrich, Дайзенхоффен, ГерманияSRE0032
    Название<strong>CompanyНомер в каталогеКомментарии
    Equipment
    FACS Система проточной цитометрии Calibur BDBiosciences GmbH, Гейдельберг, Германия
    FMT 2000 Система визуализации in vivoPerkinElmer Inc., Уолтем, Массачусетс, США FMT2000
    Программное обеспечение для анализа изображений True Quant 3.1PerkinElmer Inc., Уолтем, Массачусетс, СШАвключено в FMT2000
    Флуоресцентный микроскоп Leica DMLB Leica,  35578 Вецлар, Германия DMLB
    Bandelin Sonopuls HD 2070Bandelin, 12207 Berlin, ГерманияHD 2070ультразвуковой гомогенизатор
    Одноразовый скальпель No 10Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, ГерманияZ692395-10EA
    Metzenbaum ножницы 14cmEhrhardt Medizinprodukte GmbH, Гайслинген, Германия22398330
    люэр лок шприц 5млSigma-Aldrich, Deisenhoffen, ГерманияZ248010
    иглы для шприцевSigma-Aldrich, Deisenhoffen, ГерманияZ192368 
    Falcon Tube 50 млBD Biosciences, Erembodegem, Бельгия352070
    Молекулярные зонды Максимальное возбуждение/излучение :

    References

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. J Vis Exp. (90), (2014).
    2. Lewis, J. S., Achilefu, S., Garbow, J. R., Laforest, R., Welch, M. J. Small animal imaging. current technology and perspectives for oncological imaging. Eur J Cancer. 38 (16), 2173-2188 (2002).
    3. Bettenworth, D., et al. Translational 18F-FDG PET/CT imaging to monitor lesion activity in intestinal inflammation. J Nucl Med. 54 (5), 748-755 (2013).
    4. Vowinkel, T., et al. Apolipoprotein A-IV inhibits experimental colitis. J Clin Invest. 114 (2), 260-269 (2004).
    5. Korlach, J., Schwille, P., Webb, W. W., Feigenson, G. W. Characterization of lipid bilayer phases by confocal microscopy and fluorescence correlation spectroscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 96 (15), 8461-8466 (1999).
    6. Ntziachristos, V., Tung, C. H., Bremer, C., Weissleder, R. Fluorescence molecular tomography resolves protease activity in vivo. Nat Med. 8 (7), 757-760 (2002).
    7. Ntziachristos, V., Bremer, C., Weissleder, R. Fluorescence imaging with near-infrared light: new technological advances that enable in vivo molecular imaging. Eur Radiol. 13 (1), 195-208 (2003).
    8. Ntziachristos, V., Bremer, C., Graves, E. E., Ripoll, J., Weissleder, R. In vivo tomographic imaging of near-infrared fluorescent probes. Mol Imaging. 1 (2), 82-88 (2002).
    9. Ballou, B., et al. Tumor labeling in vivo using cyanine-conjugated monoclonal antibodies. Cancer Immunol Immunother. 41 (4), 257-263 (1995).
    10. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat Protoc. 2 (3), 541-546 (2007).
    11. Kawada, M., Arihiro, A., Mizoguchi, E. Insights from advances in research of chemically induced experimental models of human inflammatory bowel disease. World J Gastroenterol. 13 (42), 5581-5593 (2007).
    12. Nowacki, T. M., et al. The 5A apolipoprotein A-I (apoA-I) mimetic peptide ameliorates experimental colitis by regulating monocyte infiltration. Br J Pharmacol. 173 (18), 2780-2792 (2016).
    13. Hansch, A., et al. In vivo imaging of experimental arthritis with near-infrared fluorescence. Arthritis Rheum. 50 (3), 961-967 (2004).
    14. Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses. J Vis Exp. (113), (2016).
    15. Diaz-Granados, N., Howe, K., Lu, J., McKay, D. M. Dextran sulfate sodium-induced colonic histopathology, but not altered epithelial ion transport, is reduced by inhibition of phosphodiesterase activity. Am J Pathol. 156 (6), 2169-2177 (2000).
    16. Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating intestinal inflammation in DSS-induced model of IBD. J Vis Exp. (60), e3678(2012).
    17. Dieleman, L. A., et al. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clin Exp Immunol. 114 (3), 385-391 (1998).
    18. Kojouharoff, G., et al. Neutralization of tumour necrosis factor (TNF) but not of IL-1 reduces inflammation in chronic dextran sulphate sodium-induced colitis in mice. Clin Exp Immunol. 107 (2), 353-358 (1997).
    19. Sunderkotter, C., et al. Subpopulations of mouse blood monocytes differ in maturation stage and inflammatory response. J Immunol. 172 (7), 4410-4417 (2004).
    20. Willmann, J. K., van Bruggen, N., Dinkelborg, L. M., Gambhir, S. S. Molecular imaging in drug development. Nat Rev Drug Discov. 7 (7), 591-607 (2008).
    21. Ntziachristos, V., Ripoll, J., Wang, L. V., Weissleder, R. Looking and listening to light: the evolution of whole-body photonic imaging. Nat Biotechnol. 23 (3), 313-320 (2005).
    22. Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nat Methods. 7 (8), 603-614 (2010).
    23. Stuker, F., Ripoll, J., Rudin, M. Fluorescence molecular tomography: principles and potential for pharmaceutical research. Pharmaceutics. 3 (2), 229-274 (2011).
    24. Beziere, N., Ntziachristos, V. Optoacoustic imaging: an emerging modality for the gastrointestinal tract. Gastroenterology. 141 (6), 1979-1985 (2011).
    25. Habtezion, A., Nguyen, L. P., Hadeiba, H., Butcher, E. C. Leukocyte Trafficking to the Small Intestine and Colon. Gastroenterology. 150 (2), 340-354 (2016).
    26. Ungar, B., Kopylov, U. Advances in the development of new biologics in inflammatory bowel disease. Ann Gastroenterol. 29 (3), 243-248 (2016).
    27. Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn's disease. N Engl J Med. 369 (8), 711-721 (2013).
    28. Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384 (9940), 309-318 (2014).
    29. Coskun, M., Vermeire, S., Nielsen, O. H. Novel Targeted Therapies for Inflammatory Bowel Disease. Trends Pharmacol Sci. , (2016).
    30. Vermeire, S., et al. The mucosal addressin cell adhesion molecule antibody PF-00547,659 in ulcerative colitis: a randomised study. Gut. 60 (8), 1068-1075 (2011).
    31. Terai, T., Nagano, T. Small-molecule fluorophores and fluorescent probes for bioimaging. Pflugers Arch. 465 (3), 347-359 (2013).
    32. Ren, W., et al. Dynamic Measurement of Tumor Vascular Permeability and Perfusion using a Hybrid System for Simultaneous Magnetic Resonance and Fluorescence Imaging. Mol Imaging Biol. 18 (2), 191-200 (2016).
    33. Ale, A., Ermolayev, V., Deliolanis, N. C., Ntziachristos, V. Fluorescence background subtraction technique for hybrid fluorescence molecular tomography/x-ray computed tomography imaging of a mouse model of early stage lung cancer. J Biomed Opt. 18 (5), 56006(2013).
    34. Chames, P., Van Regenmortel, M., Weiss, E., Baty, D. Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. Br J Pharmacol. 157 (2), 220-233 (2009).
    35. Faust, A., Hermann, S., Schafers, M., Holtke, C. Optical imaging probes and their potential contribution to radiotracer development. Nuklearmedizin. 55 (2), 51-62 (2016).
    36. Mahler, M., et al. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274 (3 Pt 1), G544-G551 (1998).

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Reprints and Permissions

    Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

    Request Permission

    Tags

    Fluorescence mediated TomographyMacrophage DetectionIntestinal InflammationMurine Colitis ModelF4 80 AntibodyNon invasive Imaging3D ReconstructionAntibody TracerDisease Activity MonitoringIn Vivo Tracking

    Related Articles