Методическая статья

Определение оптимального расположения хромосомных ДНК элемента в Escherichia coli с помощью Роман Transposon опосредованный подход

DOI:

10.3791/55946

⸱

11 сентября 2017 г.

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Section for Functional Genomics and Center for Bacterial Stress Response and Persistence (BASP), University of Copenhagen, 2Department of Microbiology and Infection Control, Statens Serum Institut

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мощность transposon опосредованной случайные вставки элемента-кодирования ДНК использовался для разрешения его оптимального хромосомные положения.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Оптимальной хромосомных позиции данного элемента ДНК была/были определены transposon опосредованной случайные вставки после отбора фитнес. В бактерии влияние генетических контекста на функции генетического элемента может быть трудно оценить. Ряд механизмов, включая топологических эффекты, транскрипционный анализ помехи от соседних генов, и/или репликации связанных генов дозировки, может повлиять на функции данного генетического элемента. Здесь мы описываем метод, который позволяет случайных интеграции элемента ДНК в хромосоме Escherichia coli и выберите наиболее благоприятных мест, с помощью простого роста конкуренции эксперимент. Этот метод принимает преимущество хорошо описано на базе transposon системы случайные вставки, в сочетании с выбором приспособленных clone(s) роста преимущество, процедура, которая легко регулируются для экспериментальной потребности. Характер приспособленных clone(s) может определяться всего генома на сложных мульти клоновых населения или легко гена, ходьба для быстрой идентификации отдельных клонов. Здесь без кодирования ДНК региона DARS2, которая контролирует инициации репликации хромосомы в E. coli, был использован в качестве примера. Функция DARS2 , как известно, быть затронуты дозировка репликации связанных генов; ближе DARS2 получает происхождения репликации ДНК, тем более активной становится. DARS2 случайно был вставлен в хромосоме DARS2-исключить деформации. Результирующая клоны, содержащие отдельные вставки были объединены и соревновались друг с другом для сотни поколений. Наконец приспособленных клоны были характерны и содержит DARS2 вставлены в непосредственной близости от первоначального места DARS2 .

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Функцию любого генетического элемента могут быть затронуты его расположение в геноме. В бактерии это главным образом результатом вмешательства по транскрипции соседних генов, местные ДНК топологии или репликации связанных генов дозировка. В частности процесс репликации ДНК и сегрегации находятся под контролем, по крайней мере в части, некодирующих хромосомных регионов1и правильного функционирования этих регионов зависит геномной местоположение/контекста. В E.coli, примерами являются сайт НСВРС , необходимые для сестра хромосомы резолюции2; КОПС последовательности, необходимые для хромосома сегрегации3; данных, DARS1и DARS2 регионов, требуется для надлежащей репликации хромосомных управления (ниже; 4). Мы представляем метод, позволяющий для случайного перемещения, выбора и определения оптимального генетических контекста любого данного генетического элемента, здесь свидетельствует исследование некодирующих региона DARS2 .

В E. coli, DnaA отвечает инициатор белка для открытия на одной репликации происхожденияОричстренге дна и для найма helicase DnaB5,6,7. DnaA принадлежит к AAA+ (т.е., ATPases, связанные с различными мероприятиями) белки и можно привязать АТФ и АДФ с аналогичными высокой работоспособностью5. УровеньАТФ DnaA пики на начало8, где DnaAСПС образует multimer на Орич что вызывает ДНК дуплекс открытия9. После посвящения Орич производится механизм связывания белка SeqA, чтобы hemimethylated временно недоступен для повторного запуска из-за поглощения Орич10,11. Во время связывания, уровень DnaAАТФ снижается, по крайней мере два механизма: регулирования инактивации DnaA (RIDA)12,13 и данных-зависимых DnaAСПС гидролиз (DDAH)14 ,15. Рида и DDAH способствуют преобразование DnaAСПС DnaAADP. До нового раунда посвящения, DnaAADP повторную активацию с DnaAАТФ в специфических последовательностей реактивации DnaA (DARS): DARS1 и DARS216,17. Хромосомная данных, DARS1и DARS2 регионах некодирующих и действовать шаперонов как для модуляции DnaAАТФ/DnaAADP взаимное преобразование. Эти районы, расположенные за пределами происхождения репликации, чтобы Ассамблея DnaA комплекс либо инактивация (данные; 14) или активации (DARS1 и DARS2; 17) из DnaA. Удаление DARS2 в клетке не меняет массы удвоение время, но результаты асинхронной репликации начало15,16,18. Однако DARS2-дефицит клетки имеют фитнес стоимость по сравнению с иначе isogenic wildtype во время обоих непрерывного роста конкуренции в богатой среде или создания колонизации кишечника мыши18. Это означает, что даже незначительные изменения в концентрации асинхронности/происхождения имеют негативное воздействие на бактериальных фитнес. В E. coliсуществует селективного давления для поддержания хромосома симметрии (т.е. два почти одинаковой длины оружия репликации)19. Данных, DARS1и DARS2 регионы имеют же относительное расстояние до Орич всех E. coli штаммов виртуализированных18, несмотря на большие различия в размер хромосомы.

Здесь мы используем DARS2 региона кишечной палочки в качестве примера для выявления хромосомных положении(ях), оптимальный для его функции. DARS2 был вставлен в NKBOR transposon и результирующая NKBOR::DARS2 transposon, впоследствии вставлены случайно в геном MG1655 ΔDARS2. Таким образом, мы создали коллекцию ячеек, каждый обладающий DARS2 размещены в другом месте на хромосоме. В vitro конкуренции эксперимент, где все клетки в коллекции были объединены и соревновались друг с другом во время непрерывного роста в LB для примерно 700 поколений, была выполнена. Итоги конкурса эксперимента мониторинг/определялся с помощью Южная помарка, легко гена ходьбу и всего генома (РГ; Рисунок 1). Концевой клоны, решаются ходьба легко гена характеризовались проточной цитометрии для оценки параметров клеточного цикла. В анализе гранулярных потока размер ячейки, содержание ДНК и инициации синхронии может измеряться для большого числа клеток. При проточной цитометрии, поток одиночных клеток проходит луч света соответствующей длины волны для возбуждения окрашенных ДНК, которая затем одновременно зарегистрирована в photomultipliers, которые собирают испускаемого флуоресценции, мера содержания ДНК, условии клетки витражи для ДНК. Рассеянном свете является мерой массы клеток20.

В vitro конкуренции эксперимент, который мы представляем здесь используется для решения вопросов, касающихся важности хромосомных позиции и геномных контексте генетического элемента. Метод объективной и легко в использовании.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Коллекция библиотеки Transposon

Примечание: хромосомном локусе DARS2 был клонирован в мини-Tn 10-на основе transposon, NKBOR (на pNKBOR) 21, что приводит к NKBOR:: DARS2 (pJFM1). pNKBOR можно получить онлайн 22. pNKBOR — на основе R6K самоубийства вектор, который требует инициатор белка π для репликации 23. Поэтому плазмида pJFM1 способен воспроизвести в штамм E. coli (например, Dh5α, Пир λ), содержащий копию хромосомных генов Пир. Однако, когда pJFM1 преобразуется в пир недостаточным wildtype MG1655, pJFM1 не может реплицировать, приводит к выбору канамицин устойчивостью клонов, порожденных случайных вставок NKBOR:: DARS2 в бактериальной хромосоме. Для простоты они называются DARS2 вставки. Смотрите Рисунок 1 для схематическое изложение методологии.

  1. Δ electrocompetent MG1655 подготовить DARS2 от активно растущих клеток в Lysogeny бульон (LB) выросли на 37 ° C 24.
  2. Electroporate pJFM1 в electrocompetent MG1655 Δ DARS2, согласно Гонсалес и др. 24
    1. Добавить 1 мкг pJFM1 (в 1 мкл воды) до 40 мкл electrocompetent E. coli MG1655 Δ DARS2 и передать эту смесь предварительно охлажденных, стерильные разрыв 0,2 см кювета. Вставьте кювета в зале электропорации. Electroporate в 18 кв, 500 Ω и 25 МКФ; Постоянная времени должно быть ~5.0 мс, и дуги не должно происходить.
    2. Быстро восстановить бактериальных подвеска, resuspending в 1 мл подогретым LB отвара и передачи в 15 мл пробирку.
    3. Позволяют восстановить путем инкубации пористый роста условиях при 37 ° C за 30 минут, без антибиотика выбора ячейки. Пластина бактерий на плиты агара LB дополнена 50µg/мл канамицин и инкубировать при 37 ° C ночь и.
  3. Подсчета колоний от электропорации: одна колония считается равным одной вставки хромосомных transposon.
    Примечание: Колонии могут быть отнесены на глаз или с счетчиком колонии. Количество колоний пропорциональна среднее расстояние, разделяющее транспозоны, расположенный в хромосоме каждого клона.
  4. Добавить 1 мл LB отвара для каждой пластины и смыть все колонии; 1 мл LB отвара должно быть достаточно для смыть ~ 100000 колоний. Повторное использование же 1 мл LB отвара для увеличения бактериальных концентратов. Объединить всех колоний в том же Тюбик 50 мл.
  5. Вихревой трубе и заморозить Пуск материала (t = 0). Чтобы заморозить, смешайте 1 мл суспензии клеток с 1 мл 50% глицерина на льду. Передача трубки сухим льдом за 10 мин. После замораживания культур, перенести их в морозильник-80 ° С.
    Примечание: На данном этапе ожидается концентрации клеток как минимум 50000 кое/мл.

2. Конкурс эксперимент в LB

  1. оттепели transposon библиотеки от-80 ° C на льду. Микс, закупорить.
  2. Передачи 100 мкл transposon библиотеки до 10 мл фунтов в 15 мл пробирку.
  3. Рост клеток, пористый, постоянно встряхивая (250 об/мин), за 8 ч при 37 ° C для стационарной фазы (то есть, ОД 600 = ~ 4.0). Настроить эти параметры для роста различных условий, по желанию.
  4. Распространение бактериальной населения путем непрерывной передачи в свежие подогретую среднего каждые ~ 10 поколений. Сделать это путем передачи 10 мкл культуры предыдущих стационарной фазы до 10 мл свежего фунтов и расти еще 8 ч для стационарной фазы (то есть, ОД 600 = ~ 4.0).
    Примечание: Как начало и конец оптической плотности совпадают, кратное разрежения соответствует ~ 10 поколений роста (2 10 = 1024). Бактериальная популяция можно либо передаются непосредственно в свежие подогретую среднего или сохранены на 0-4 ° C (на льду) и распространяются на следующий день. LB здесь используется для обеспечения как много клеточных удвоений в кратчайшие сроки (удвоение время недалеко от 22 min).
  5. После каждого 100 поколений конкуренции, сохранить пять образцов 1 мл-80 ° c (как описано в шаге 3.3).
  6. Если Фитнес различия между ячейками, содержащими вставок отдельных transposon, как ожидается, будет небольшой, сохранить продолжительность конкурса долго; здесь, 700 поколений (t = 700) были использованы.

3. Южный блот анализ следить за конкуренции эксперимент над времени

  1. подготовить зонд для южных блот (раздел 1-kb NKBOR), выполняя полимеразной цепной реакции (ПЦР) усиление с помощью конкретных грунты: NKBOR_Probe_FW : gatgttggacgagtcggaat и NKBOR_Probe_RV: cgttacatccctggcttgtt.
    1. Инкубировать на 98 ° C за 30 s для первоначального денатурации. Затем выполните 35 циклов на 98 ° C 10 сек, 60 ° C за 30 s и 72 ° C для 45 s. Для окончательного расширения, используйте 72 ° C для 10 мин
      Примечание: Шаблон для реакции PCR был очищенный pNKBOR плазмиды 21.
    2. Ярлык фрагмента результирующего ПЦР с [α - 32P] dATP, с использованием системы случайного праймера, согласно Смит 25.
  2. Подготовить общее клеточной ДНК согласно Løbner-Олесен и фон Freiesleben 26 t = 0 и отдельных пунктов до t = 700, по оценкам поколений конкуренции.
  3. Дайджест всего клеточной ДНК с Pvu я, который режет NKBOR, содержащие региона интерес один раз только в регионе, не охватываемых зонд; 1 единица Pvu я может использоваться для полностью дайджест 1 мкг субстрат ДНК.
    Примечание: Датчик распознает фрагменты, содержащие часть transposon, наряду с хромосомной ДНК различных длин, в зависимости от вставки сайт.
  4. Выполнять Южная помарка, используя 0,7% агарозном геле согласно Løbner-Олесен и фон Freiesleben- 26.

4. Выявление сильнейших клонов

  1. легко гена использования ходить, как описано в Харрисон и др. 27, для выявления DARS2 вставки сайты из одного клонов (изолированные на тарелках LB) после 700 оценкам поколений конкуренции; больше полос на Южная помарка, больше изолирует необходимы для покрытия всех вставок transposon.
    1. Изолировать genomic дна PCR шаблона. Распространение бактерий на плите агар LB содержащие 50 мкг/мл канамицин и инкубировать и при 37 ° C на ночь. Расти одной колонии на ночь в LB отвара при 37 ° C и впоследствии перевести 20 мкл в 200 мкл газобетона дистиллированной воды (или использовать ДНК очистки, как в шаге 3.2).
      1. Vortex смешивать. Нагреть смесь на 100 ° C, в 10 мин и центрифуги на Макс скорость на 5 мин, за исключением клеток lysate при-20 ° C для использования в будущем.
    2. Дизайн три вложенных Праймеры для отжига в пределах transposon выбора (см. рис. 2 для графического представления стратегии ПЦР).
      Примечание: Проектирование вложенных грунты следует обеспечить, что вложенные грунт 3 находится ближе всего к известным 5 ' конец transposon ДНК, следуют вложенных грунтовки 2 и 1. Расстояние между вложенными грунт 3 и 5 ' конец известных transposon ДНК должно быть достаточно для сквозного последовательности из известных ДНК неизвестных ДНК (чтобы найти конкретные хромосомных transposon вставки сайт). Для NKBOR были использованы следующие вложенные грунты: pNKBOR_Nested3_RV: gcagggctttattgattcca, pNKBOR_Nested2_RV: tcagcaacaccttcttcacg и pNKBOR_Nested1_RV: actttctggctggatgatgg. Используются также случайных праймеров, содержащие признание сайты известных энзимов ограничения. Для обеспечения результата, следует использовать по крайней мере два различных случайных праймеров. Ограничение места для энзимов ограничения (e.g.,Sau 3AI и Хин dIII) должны быть расположены на 3 ' конец и предшествует десяти случайных баз так что 5 ' - NNNNNNNNNNGATC - 3 ' и 5 ' - NNNNNNNNNNAAGCTT - 3 ' являются праймеры содержащие САУ 3AI сайта (GATC) и Хин dIII сайта (AAGCTT), соответственно, где N = A, T, G или C.
    3. Использование 200 ng геномной ДНК в 20 мкл реакции PCR. Инкубируйте на 98 ° C за 30 s для первоначального денатурации. Выполнение 25 циклов в 98 ° C за 30 s, 50 ° C 15 s и 72 ° C на 4 мин. Для окончательного расширения, используйте 72 ° C для 10 минут использования грунтовки пар состоящий из вложенных грунтовка 1 и один из случайных праймеров.
    4. Использовать грунт пары состоящие из вложенных 2 праймера и же случайные грунт от второго амплификация, используя 1 мкл своей предыдущей реакции как шаблон.
    5. Повторите шаг 4.1.4 парами грунт, состоящий из вложенных грунт 3 и же случайного праймера.
    6. Запуск продуктов из окончательной реакции PCR на 1,5% агарозном геле и пятно бромидом ethidium. Вырезать полосы в диапазоне 100-800 bp и изолировать ДНК, используя любой коммерческой ДНК гель, извлечение комплект по заявлению производителя ' направлении. Ресуспензируйте ДНК в 15 мкл воды.
      Примечание: осторожно. Бромид ethidium токсичных и должны быть обработаны с осторожностью.
    7. Последовательности группы, изолированные на предыдущем шаге (шаг 4.1.6), с вложенными грунт 3 как последовательность праймера, используя Сэнгер секвенирования коммерческого поставщика.
  2. Выполняют WGS.
    1. Выполнить РГ на ДНК извлеченные из всего выбранных образцов, собранных в ходе конкуренции эксперимента, как описано в Frimodt-Моллер et al 4.
  3. Анализ последовательности.
    1. Выровнять паре конец читает 150 НС, прилегающих к NKBOR, AF310136.1 1,904 … 2204, используя Bowtie2 28 с интервалом между семян подстрок (S, 1, 1.15) и максимальное количество неоднозначных символов (L 0, 0,9).
    2. Выберите соответствие читает и затем повторно выравнивать к обоим MG1655 ref | NC_000913.3 и NKBOR gb | AF310136 с использованием blastN 29
    3. назначить транспонирования позиции вставки на перекрестках MG1655-NKBOR.

5. Проточная цитометрия

  1. собирать образцы для проточной цитометрии.
    1. Баланс каждой культуры, поддерживая его в фазе экспоненциального роста по крайней мере 10 поколений. Проверьте ОД 600 и убедитесь, что он никогда не превышает 0,3.
    2. Собирать два типа потока проб.
      1. На риф биение, передачи 1 мл культуры 15 мл, содержащих 30 мкл риф-CEF (300 мкг/мл рифампицин и цефалексин 36 мкг/мл, растворенных в 12,5 мм NaOH). Оставить его при 37 ° C для минимум 4 часа тряски.
        Примечание: Рифампицин косвенно блокирует инициации репликации хромосомы, позволяя при этом для текущего раунда репликации продолжать прекращения. Цефалексин предотвращает деление клеток, что приводит к репликации биение (RIF-биение) и накопления клеток с полностью реплицированные хромосомы. Количество полностью реплицированных хромосом равен числу происхождения во время лечения с рифампицин и цефалексин- 20.
      2. EXP - пример передачи 1 мл экспоненциально растущей культуры до 1,5 мл на ДВС.
  2. Исправить клетки следующим образом. Урожай клетки центрифугированием на 15000 x g 5 мин на 4 ° C. Ресуспензируйте гранулы в 100 мкл ледяной 10 мм трис рН 7,5 и добавьте 1 mL ледяной 77% этанола. Хранить образцы на 4 ° C до использования.
  3. Пятно следующим клетки. Урожай 100-300 мкл фиксированные клетки центрифугированием на 15000 x g 15 мин удалить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 130 мкл " окрашивание ДНК раствор " (90 мкг/мл mithramycin, 20 бромид ethidium мкг/мл, 10 мм 2 MgCl и 10 мм трис pH 7.5). Поместите образцы на льду и в темноте; образцы готовы для анализа потока cytometry после 10 мин
    Примечание: Другие ДНК пятна чем бромид ethidium и mithramycin также может быть использоваться 30 , 31.
  4. Определить происхождение клеток, относительная масса, и относительное содержание ДНК путем анализа потока цитометрии.
    1. Выполнения проточной цитометрии, как описано выше 32. Риф биение и EXP-образцы с использованием потока цитометр производитель ' s инструкции . Для mithramycin - и ethidium бромид окрашенных клеток, использовать возбуждение волн 395 и 440 Нм и собирать флуоресценции выше 565 Нм.
      1. Для определения относительной массы и относительной ДНК содержимое ячейки, запуска EXP-образцы для получения одного параметра вперед свет разброс против ячейку число гистограмм и интенсивности флуоресценции против ячейки номер гистограммы для минимум 30 000 событий соответствующий сигнал клетки.
      2. Использование рассеянном сингл параметр распределения света для измерения средней относительной ячейки Массачусетс
        Примечание: Рассеянном свете является мерой Средняя ячейка массы 20.
      3. Использование флуоресценции интенсивности одного параметра распределений для измерения средней ДНК контент- 20.
      4. Получения концентрации ДНК как отношение среднего содержания ДНК в среднем клетки массы 20.
    2. Определить количество происхождение в клетку.
      1. Бежать риф биение образцы для получения интенсивности флуоресценции сингл параметр против сотовый номер гистограммы для минимум 30 000 событий, соответствующий сигнал клетки.
      2. Использование флуоресценции интенсивности одного параметра распределений для определения числа хромосом в каждой ячейке 20.
  5. Рассчитать индекс асинхронности (Ai).
    1. Calculate ии, как описано в Løbner-Олесен и др. 32, используя дистрибутивов один параметр интенсивности флуоресценции риф биение образцов и формула Ai = (f3 + f5 + f6 + f7) / (f2 f4 + f8), где fx является фракция клетки с x количество полностью реплицированные хромосомы. Рассмотреть возможность посвящения асинхронных когда A > 0.1.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Южная помарка было сделано, чтобы убедиться, что DARS2 был распространен случайным образом хромосомы в библиотеке transposon (t = 0) и что со временем будет сохраняться приспособленных клонов. Южная помарка была выполнена на ДНК, извлеченные из первоначального transposon бассейн (при t = 0) и каждый примерно 100 из 700 поколений конкурса (рис. 3). Здесь было всего клеточной ДНК каждой точки время переваривается с Pvuэнзима ограничения, извес...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Методология, используемая здесь преимущества методов ответить трудный вопрос относительно оптимального геномной положение генетического элемента. Случайные вставки генетического элемента, (при посредничестве transposon) позволяет быстро и легко коллекция из тысяч клонов, которые затем могут быть сделаны конкурировать друг с другом, чтобы выбрать для оптимального положения элемента исследуемого генетических (т.е. приспособленных клон).

Здесь, DARS2 был вставлен в мини Tn10...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы имеют не конкурирующие финансового интереса.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы были финансируемых за счет грантов из Ново Нордиск фонд, Фонд Lundbeck и датский национальный исследовательский фонд (DNRF120) через центр для бактериальных реакции на стресс и настойчивость (BASP).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
электропорации воды Autoclaved Mili-QNone,
LB Агар, порошок (Lennox L agar)Thermo Fisher Scientific22700025
глицеринThermo Fisher Scientific17904
Fisherbrand  Пластиковые чашки ПетриFisher ScientificS33580A
Falcon 50mL Конические центрифужные пробиркиFisher Scientific14-432-22
Falcon 15mL Конические центрифужные пробиркиFisherScientific 14-959-53A
Nunc  КриотрубкиSigma-AldrichV7634 
Высокоточная ДНК-полимераза phusion (2 U/µ L)Thermo Fisher ScientificF530S
dATP, [α-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml, 250 &; CiPerkinElmerBLU012H250UC
DECAprime II Набор для мечения ДНКСпектрофотометр Thermo Fisher ScientificAM1455
  SF/MBV/03.32Фармация
Центрифуга Hermle      SF/MBV/03.46Hermle
Ole Dich  SF/MBV/03.29Ole Dich
Eppendorftubes 1,5 млSigma-AldrichT9661
Eppendorftubes 2,0 млSigma-AldrichT2795
Хлорид натрияMerck6404
96% этанолSigma-Aldrich16368
Trizma HClSigma-AldrichT-3253
Фенол УльтрачистыйBRL5509UA
ХлороформMerck2445
Рибонуклеаза А тип II АСигма-ОлдричR5000
Содийдодецилсульфат (SDS)Merck13760
ЛизоцимСигма-ОлдричL 6876
ИзопропанолСигма-Олдрич405-7
0,5М Na-ЭДТА pH 8.0BRL5575 UA
Канамицина сульфатSigma-Aldrich10106801001
PvuI (10 U/&микро; L)Thermo Fisher ScientificER0621
UltraPure AgaroseThermo Fisher Scientific16500500
ДНК-гель для загрузки красителя (6X)Thermo Fisher ScientificR0611
Трис-Борат-ЭДТА буферSigma-AldrichT4415
Бромид этидияSigma-AldrichE7637
Соляная кислотаSigma-Aldrich433160
Гидроксид натрияSigma-Aldrich71687
Whatman  3ММ бумагиSigma-AldrichWHA3030931
SSC Buffer 20× КонцентратSigma-AldrichS6639
Amersham Hybond-N+GE HealthcareRPN119B
Ficoll  400Sigma-AldrichF8016
ПоливинилпирролидонSigma-AldrichPVP40
Бычья сыворотка Альбумин - фракция VSigma-Aldrich85040C
Дезоксирибонуклеиновая кислота натриевая соль из семенников лососяSigma-AldrichD1626
Carestream Kodak   БиоМакс   световая пленкаSigma-AldrichZ373494
GenElute   Набор для экстракции геляSigma-AldrichNA1111 
GenElute   Набор для чистки ПЦРSigma-AldrichNA1020
T100  ТермоамплификаторBio-Rad
SmartSpec Plus СпектрофотометрBio-Rad
RifampicinServa34514.01
ЦефалексинSigma-AldrichC4895
МитрамицинServa29803.02
Магния хлорид гексагидратSigma-Aldrich246964
Инструмент Apogee A10Apogee
Кюветы для 0,1 см Thermo Fisher Scientific P41050 Bio-Rad MicroPulser Electroporation System Bio-Rad 165-2100 LB Бульон Thermo Fisher Scientific 12780029  Центрифуга

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Lobner-Olesen, A. Control of bacterial chromosome replication by non-coding regions outside the origin. Curr Genet. , (2016).
  2. Sherratt, D. J., et al. Recombination and chromosome segregation. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 359 (1441), 61-69 (2004).
  3. Bigot, S., et al. DNA motifs that control E. coli chromosome segregation by orienting the FtsK translocase. EMBO J. 24 (21), 3770-3780 (2005).
  4. Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Krogfelt, K. A., Lobner-Olesen, A. DNA Replication Control Is Linked to Genomic Positioning of Control Regions in Escherichia coli. PLoS Genet. 12 (9), 1006286(2016).
  5. Kornberg, A., Baker, T. A. DNA Replication, Second Edition. , University Science Books. (1992).
  6. Kaguni, J. M. Replication initiation at the Escherichia coli chromosomal origin. Curr Opin Chem Biol. 15 (5), 606-613 (2011).
  7. Leonard, A. C., Grimwade, J. E. Regulation of DnaA assembly and activity: taking directions from the genome. Annu Rev Microbiol. 65, 19-35 (2011).
  8. Kurokawa, K., Nishida, S., Emoto, A., Sekimizu, K., Katayama, T. Replication cycle-coordinated change of the adenine nucleotide-bound forms of DnaA protein in Escherichia coli. EMBO J. 18 (23), 6642-6652 (1999).
  9. Sekimizu, K., Bramhill, D., Kornberg, A. ATP activates dnaA protein in initiating replication of plasmids bearing the origin of the E. coli chromosome. Cell. 50 (2), 259-265 (1987).
  10. Brendler, T., Austin, S. Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences. EMBO J. 18 (8), 2304-2310 (1999).
  11. Lu, M., Campbell, J. L., Boye, E., Kleckner, N. SeqA: a negative modulator of replication initiation in E. coli. Cell. 77 (3), 413-426 (1994).
  12. Katayama, T., Kubota, T., Kurokawa, K., Crooke, E., Sekimizu, K. The initiator function of DnaA protein is negatively regulated by the sliding clamp of the E. coli chromosomal replicase. Cell. 94 (1), 61-71 (1998).
  13. Kato, J., Katayama, T. Hda, a novel DnaA-related protein, regulates the replication cycle in Escherichia coli. EMBO J. 20 (15), 4253-4262 (2001).
  14. Kasho, K., Katayama, T. DnaA binding locus datA promotes DnaA-ATP hydrolysis to enable cell cycle-coordinated replication initiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (3), 936-941 (2013).
  15. Kitagawa, R., Ozaki, T., Moriya, S., Ogawa, T. Negative control of replication initiation by a novel chromosomal locus exhibiting exceptional affinity for Escherichia coli DnaA protein. Genes Dev. 12 (19), 3032-3043 (1998).
  16. Fujimitsu, K., Senriuchi, T., Katayama, T. Specific genomic sequences of E. coli promote replicational initiation by directly reactivating ADP-DnaA. Genes Dev. 23 (10), 1221-1233 (2009).
  17. Kasho, K., Fujimitsu, K., Matoba, T., Oshima, T., Katayama, T. Timely binding of IHF and Fis to DARS2 regulates ATP-DnaA production and replication initiation. Nucleic Acids Res. 42 (21), 13134-13149 (2014).
  18. Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Krogfelt, K. A., Lobner-Olesen, A. Control regions for chromosome replication are conserved with respect to sequence and location among Escherichia coli strains. Front Microbiol. 6, 1011(2015).
  19. Bergthorsson, U., Ochman, H. Distribution of chromosome length variation in natural isolates of Escherichia coli. Mol Biol Evol. 15 (1), 6-16 (1998).
  20. Boye, E., Steen, H. B., Skarstad, K. Flow cytometry of bacteria: a promising tool in experimental and clinical microbiology. J Gen Microbiol. 129 (4), 973-980 (1983).
  21. Rossignol, M., Basset, A., Espeli, O., Boccard, F. NKBOR, a mini-Tn10-based transposon for random insertion in the chromosome of Gram-negative bacteria and the rapid recovery of sequences flanking the insertion sites in Escherichia coli. Res Microbiol. 152 (5), 481-485 (2001).
  22. SHIGEN. , Available from: http://shigen.nig.ac.jp (2017).
  23. Shafferman, A., Helinski, D. R. Structural properties of the beta origin of replication of plasmid R6K. J Biol Chem. 258 (7), 4083-4090 (1983).
  24. Gonzales, M. F., Brooks, T., Pukatzki, S. U., Provenzano, D. Rapid protocol for preparation of electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae. J Vis Exp. (80), (2013).
  25. Smith, D. R. Random primed labeling of DNA. Methods Mol Biol. 18, 445-447 (1993).
  26. Lobner-Olesen, A., von Freiesleben, U. Chromosomal replication incompatibility in Dam methyltransferase deficient Escherichia coli cells. EMBO J. 15 (21), 5999-6008 (1996).
  27. Harrison, R. W., Miller, J. C., D'Souza, M. J., Kampo, G. Easy gene walking. Biotechniques. 22 (4), 650-653 (1997).
  28. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  29. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
  30. Stepankiw, N., Kaidow, A., Boye, E., Bates, D. The right half of the Escherichia coli replication origin is not essential for viability, but facilitates multi-forked replication. Mol Microbiol. 74 (2), 467-479 (2009).
  31. Lobner-Olesen, A. Distribution of minichromosomes in individual Escherichia coli cells: implications for replication control. EMBO J. 18 (6), 1712-1721 (1999).
  32. Lobner-Olesen, A., Skarstad, K., Hansen, F. G., von Meyenburg, K., Boye, E. The DnaA protein determines the initiation mass of Escherichia coli K-12. Cell. 57 (5), 881-889 (1989).
  33. Carver, T., Thomson, N., Bleasby, A., Berriman, M., Parkhill, J. DNAPlotter: circular and linear interactive genome visualization. Bioinformatics. 25 (1), 119-120 (2009).
  34. Eckert, S. E., et al. Retrospective application of transposon-directed insertion site sequencing to a library of signature-tagged mini-Tn5Km2 mutants of Escherichia coli O157:H7 screened in cattle. J Bacteriol. 193 (7), 1771-1776 (2011).
  35. van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nat Methods. 6 (10), 767-772 (2009).
  36. van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nat Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).
  37. Jeong, H., Lee, S. J., Kim, P. Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat. J Vis Exp. (115), (2016).
  38. Bryant, J. A., Sellars, L. E., Busby, S. J., Lee, D. J. Chromosome position effects on gene expression in Escherichia coli K-12. Nucleic Acids Res. 42 (18), 11383-11392 (2014).
  39. Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

DARS2

Похожие статьи