Методическая статья

Очистка отсеке мембраны эндоплазматического ретикулума связаны деградации Экзогенные антигены в кросс презентация

7.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55949

⸱

21 августа 2017 г.

 ,  ,  , 
1Laboratory of Physiological Chemistry, Faculty of Pharmacy, Takasaki University of Health and Welfare

В этой статье

Краткое содержание

Метод, описанный здесь — это новый Протокол изоляции везикул, который позволяет для очистки сотовой отсеков, где Экзогенные антигены обрабатываются эндоплазматического ретикулума связаны деградация в кросс презентации.

Аннотация

Дендритные клетки (DCs) весьма способны обработки и представления интернализированных Экзогенные антигены класса гистосовместимости (MHC) я молекулы также известный как крест презентация (CP). CP играет важную роль не только в стимуляции наивно CD8+ T памяти CD8 клетки и+ T-клеток для инфекционных и опухоли иммунитета, но и в инактивации автоматической наивно T клетки Т-клеток анергия или удаления Т-клеток. Хотя критические молекулярный механизм CP предстоит быть выяснены, накапливая свидетельствуют, что Экзогенные антигены обрабатываются через эндоплазматического ретикулума связаны деградация (ERAD) после экспорта из Неклассические endocytic отсеков. До недавнего времени, характеристики этих endocytic отсеков были ограничены, потому что там было без конкретных молекулярных маркеров помимо Экзогенные антигены. Метод, описанный здесь — это новый Протокол изоляции везикул, который позволяет для очистки этих endocytic отсеков. Используя этот очищенный микросомы, мы восстановленный ERAD-как транспорт, ubiquitination и обработки экзогенных антигена в пробирке, предполагая, что убиквитин протеасом системы обработки экзогенных антигена после экспорта из этого Сотовый отсек. Этот протокол может применяться в других типах клеток для уточнения молекулярный механизм CP.

Введение

MHC I молекулы выражаются на поверхности всех ядерных клеток, с короткие антигенные пептиды, производный от эндогенные антигены, которые обрабатываются системой убиквитин протеасом в цитозоль1. После обработки, антигенные пептиды переносятся в эндоплазматический ретикулум (ER) просвета пептида перевозчика крана. В просвете ER ряд конкретных сопровождающих помочь загрузки пептидной и правильный складывающиеся MHC I комплекс. Эта серия молекул называется загрузки пептидной комплекс (PLC), указав, что ER является центральный отсек для пептида, загрузки на MHC2. После загрузки, пептид MHC I молекулы переносятся на поверхност....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. рост клетки и добавлением Экзогенные антигены

  1. подготовить Бова, с помощью биотин белка маркировки комплект после производитель ' протокол s.
    Примечание: Обычно, Бова содержит биотина 2 М на 1 М OVA среднем.
  2. Клетки растут DC2.4 в RPMI 1640 с 2 мм L-глютамином, пируват натрия 1 мм, 0,1 мм заменимые аминокислоты, 100 ед/мл пенициллин стрептомицином, 2-меркаптоэтанол 55 мм, 10 мм HEPES (рН 7,5) и 10% плода телячьей сыворотки (далее RPMI) при 37 ° C в 5 % CO 2 в увлажненные инкубатора (далее без упоминания, клетки инкубируют в это условие). Это также можно использовать с 10% плода телячьей сыворотки, 3,7 г/Л NaHCO 3 ....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для выяснения молекулярный механизм CP, это необходимо для выявления клеточных отсеков, где Экзогенные антигены пройти ERAD-как транспорта и обработки. Хотя замечания immunofluorescent микроскопии или электронной микроскопии выявлены сотовой отсек, где Экзогенные антигены накопленных,16,,1718,19 30.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В предыдущих исследованиях CP включены Экзогенные антигены накопленных в запретной зоне конце endosome или ER immunofluorescent микроскопии16,30,,3132. Предполагается, что ERAD-как транспорта и обработки Экзогенные антигены осуществляется в таких специализированных областях, ER или поздно endosome, как сотовой отсек был опознан сахарозы или с использованием градиентного центрифугирования плотно.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа поддерживается Такасаки университет здравоохранения и социального обеспечения.

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
RPMI 1640gibco by life technologies11875-093
Фетальная бычья сывороткаEquitech bioSFB30
Пируват натрияgibco by life technologies11360-070
MEM заменимые аминокислотыgibco by life technologies11140-050
HEPESgibco by life technologies15630-080
2-меркаптоэтанолgibco by life technologies21985-023
L-глутаминgibco by life technologies25030-164
Пенисициллин-стрептомицинgibco by life technologies15140-122
DMEMgibco by life technologies12100-46
OVA SIGMAA5503
Биотин-белок набор для маркировкиThermo Fisher ScientificF6347
MG-132Santa Cruz Biotechnology201270
лактацистинSIGMAL6785
Dounce гомогенизаторIUCHI131703
ингибитор протеазы коктейлиSIGMAP8340
йодиксанолCosmo bio1114542
SA-магнитные бусиныNew England Biolabs201270
контрольные магнитные бусиныChemagenM-PVA012
магнитный стендBD Biosciences552311
набор для анализа белка BCA ThermoFisher Scientific23225
наборы для окрашивания серебромCosmo bio423413
Reticulocyte LysatePromega
Помеченный флажком убиквитинSIGMAU5382
анти-овальбумин (OVA, мышь)Магазин антителHYB 094-06
ant-мульти-убиквитин (мышь)MBLD058−
антифлажок (мышь)SIGMAF3165
трипсинSIGMA85450C
17307143

Ссылки

  1. van Endert, P. Providing ligands for MHC class I molecules. Cell Mol Life Sci. 68 (9), 1467-1469 (2011).
  2. Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. , 5th ed, Garland Press. New York. (2001).
  3. McDevitt, H. O.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

ERAD

Похожие статьи