Представлен протокол создания генно-инженерной мышиной модели колоректального рака с помощью сегментарной адено-кремовой инфекции и ее наблюдения с помощью колоноскопии высокого разрешения.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Генетически спроектированная мышь Модель спорадического колоректального рака
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Несмотря на преимущества легкой применимости и экономической эффективности, мышиные модели колоректального рака, основанные на инъекции опухолевых клеток, имеют серьезные ограничения и не точно имитируют биологию опухоли и распространение опухолевых клеток. Для преодоления этих ограничений были введены генно-инженерные мышиные модели; Однако такие модели технически требуются, особенно в больших органах, таких как толстая кишка, в которой желательна только одна опухоль.
В результате была разработана иммунокомпетентная генетически модифицированная мышечная модель колоректального рака, которая развивает сильно однородные опухоли и может быть использована для исследований опухолевой биологии, а также для терапевтических испытаний. Развитие опухоли инициируется хирургической, сегментарной инфекцией дистальной кишки с адено-кре-вирусом у сложных условно мутантных мышей. Опухоли можно легко обнаружить и контролировать с помощью колоноскопии. Мы здесь описываем хирургическую методику сегментарной аденоскопной инфекцииОбодочную кишку, наблюдение за опухолью с помощью колоноскопии высокого разрешения и представление полученных колоректальных опухолей.
Введение
Колоректальный рак (CRC) по-прежнему является одной из ведущих причин смертности от рака в западных странах. 1 Хотя прогноз пациентов с ранней стадией заболевания хорош, многие опухоли диагностируются на более поздних стадиях, в которых, несмотря на многочисленные варианты лечения, прогноз ограничен. 2 , 3 , 4 , 5
Большинство современных моделей мыши CRC основаны на имплантации опухолевых клеток, полученных из клеточных линий или опухолей пациентов, на иммунодефицитных мышей. 6 , 7 , 8 Это приводит к локальному и, в зависимости от места инъекции и опухолевым клеткам, используемым для инъекций, иногда метастатическим опухолям. 9 , 10 Однако полученные модели ксенотрансплантатов имеют майоR ограничений. Они должны быть установлены у иммунодефицитных мышей, что устраняет сложное взаимодействие между опухолью и иммунной системой хозяина. Кроме того, поскольку строма опухоли получена из клеток-хозяев, взаимодействие между паренхимой опухоли человека и стромой мыши является дефектной и поэтому не является репрезентативным для данного заболевания. Эти недостатки можно избежать с помощью мышиных клеточных линий для инъекций. Однако доступны только несколько линий клеток CRC мыши и, подобно большинству доступных человеческих CRC-клеточных линий, являются моноклональными и сильно анапластичными. 11 Таким образом, большинство доступных в настоящее время моделей мышей CRC являются очень искусственными и не полностью репрезентативными для болезни человека.
Генетически спроектированные мышиные модели (GEMM) CRC могут избежать этих недостатков, поскольку они показывают истинные мышечные опухоли, которые создаются посредством индукции ключевых мутаций CRC в толстой кишке. 12 , 13 ,14 Это может быть достигнуто путем активации условных (floxed) мутаций зародышевой линии путем рекомбиназы в слизистой оболочке колоректального отдела. В то время как в GEMMs многих других опухолевых сущностей используется зародышевая (индуцибельная) экспрессия cre, обусловленная тканеспецифическими промоторами, зародышевая структура не может использоваться в толстой кишке, так как это приводит к большому количеству аденом во всей толстой кишке, вызывающему смерть при доброкачественной опухолевой нагрузке при Очень молодой возраст. Поэтому в описанной здесь модели используется аденовирусный вектор, выражающий cre, для заражения короткого сегмента толстой кишки. Это приводит к индукции опухолевого генеза в этом сегменте слизистой оболочки в момент времени, определенный исследователем, в результате чего аденомы в конечном итоге прогрессируют до инвазивной и метастатической карциномы. Опухоли являются настоящими мышечными опухолями, растут в интактном микроокружении и поэтому способны имитировать полноту колоректального онкогенеза, включая взаимодействие опухоли-хозяина и метастатический каскад. Эта модельПоэтому является привлекательной платформой для исследований биологии рака и доклинических терапевтических испытаний.
Основным недостатком генно-инженерных моделей мыши CRC является их техническая сложность. Ранее была описана локальная сборка с использованием ректальных аденоцитарных клизмов у мышей, несущих аллергические аллели Apx. Однако, частота, множественность и расположение опухолей кишечника могут быть весьма переменными с помощью этой техники. Таким образом, была разработана методика ограничения адено-крестовой инфекции хирургическим зажимом сегмента, который должен быть индуцирован. 13 Мы изменили эту процедуру, чтобы улучшить благосостояние животных, а также снизить смертность и число возникающих опухолей. С помощью этого протокола все лаборатории, обладающие опытом в малой хирургии грызунов, должны иметь возможность воспроизводить модель и производить опухоли, которые очень воспроизводимы и легко доступны для колоноскопии. В зависимости от условного mUtations, используемых для опухолегенеза, можно наблюдать полный спектр аденомы, инвазивной карциномы и метастазов. Поскольку опухоли расположены в дистальной кишке, серийная эндоскопическая оценка легко возможна в этой модели.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Представленные здесь эксперименты на животных были независимо рассмотрены и одобрены институциональным и правительственным комитетом по уходу и использованию животных и проводились в соответствии с руководящими принципами Федерации лабораторных ассоциаций животных (FELASA). Были приняты все возможные меры для минимизации страданий, включая анестезию и анальгезию, или, при необходимости, преждевременную эвтаназию.
1. Индукция локальной опухоли через хирургическую адено-кремовую инфекцию
- Подготовка животных к хирургии
ПРИМЕЧАНИЕ. Практически любая условная («floxed») мутация может быть вызвана посредством описанного здесь метода. Рекомендуется использовать мутации в генах, подходящих для колоректального рака, таких как Apc, Kras или Tp53. Эффективность cre-рекомбинации зависит от размера вырезаемой конструкции. Большие флуксовые последовательности вырезаются менее эффективно. Рекомбинация всех аллелей должна быть подтверждена в опухолях ПКР.- Для развития колоректальных опухолей используйте крестик следующих условных аллелей для базовой модели CRC (номер базы MGI в скобках):
Apc tm2Rak (MGI: 3688435) 16
Красный tm4Tyj (MGI: 2429948) 17
Tp53 tm2Tyj (MGI: 3039263) 18 - Если требуется аллель репортера флуоресценции ( например , для обнаружения микрометастаз), используйте следующий аллель:
Gt (ROSA) 26Sor tm6 (CAG-ZsGreen1) Hze (MGI: 3809522) 19
ПРИМЕЧАНИЕ. Все вышеперечисленные штаммы доступны через репозиторий мыши NCI или лабораторию Джексона. Пост не требуется, так как все оставшиеся фекальные вещества могут быть вымыты до аденовирусной инфекции. Предоперационный пост приводит к более высокой периоперационной смертности и представляет собой огромный стресс для мелких грызунов. - Используйте севофлуран при 3 - 3,5 об.% Для общей анестезии. Потеря tОн указывает на достаточную анестезию.
- Перед первым разрезом вводят 0,05 мг / кг бупренорфина подкожно.
- Накройте глаза анестезированной мышью глазной мазью, чтобы избежать высыхания роговицы.
- Поместите мышь в лежачее положение на маленьком столе. Используйте невращающиеся клейкие ленты, чтобы сдержать мышь.
- Бритье живота с помощью электробритвы (в качестве альтернативного варианта можно использовать депиляционный крем) и дезинфицировать спиртовыми тампонами или йодом. Используйте время контакта, рекомендованное производителем.
- Покройте хирургическое поле стерильными драпировками.
ПРИМЕЧАНИЕ. Использование периоперационных антибиотиков является факультативным и подлежит институциональным руководящим принципам. - Используйте стерильные одноразовые или стерилизованные инструменты для всех хирургических процедур.
- Для развития колоректальных опухолей используйте крестик следующих условных аллелей для базовой модели CRC (номер базы MGI в скобках):
- Средняя лапаротомия и воздействие толстой кишки
- Используйте ножницы (скальпели можно использовать альтернативно), чтобы сделать срединный разрез(~ 15 мм) кожи на нижней части живота.
- Возьмите мускулатуру брюшной стенки с помощью щипцов и аккуратно поднимите ее ножницами, открыв таким образом брюшную полость.
- Определите дистальную кишку, только коснитесь ее атравматическими щипцами. Закрепите толстую кишку тонким зажимом ( например , сосудистым зажимом Micro Serrefine) примерно на 15 мм в проксимальном направлении заднего прохода.
ПРИМЕЧАНИЕ. Уделяйте особое внимание уязвимости двоеточия во все времена. Перфорация неизбежно приводит к перитониту и сепсису и требует эвтаназии животного.
- Сегментарная инфекция двоеточия вирусом Adeno-cre
- Вставьте гибкую тефлоновую трубку трансанально и осторожно продвиньте ее до тех пор, пока она не достигнет окклюзии просвета, достигнутой зажимом, ранее установленным на расстоянии 15 мм от анального края. Не используйте избыточную силу, так как это может привести к перфорации.
- Канюлируйте трубку с канюлей 30G, соедините стандартный 1 мл шприц и промойте колостьN с нормальным физиологическим раствором для эвакуации оставшегося фекального вещества. Это может потребовать несколько мл физиологического раствора.
- Как только дистальная толстая кишка пуста, удалите трубку и замените ее свежей тефлоновой трубкой и снова поместите ее прямо на дистальную сторону зажима, как описано выше.
- Окуните двоеточие со вторым зажимом ~ 3 мм, дистальным к проксимальному зажиму ( то есть через вставленную трубку, ~ 12 мм от анального края), в результате чего изолированный сегмент 3 мм будет инфицирован.
ПРИМЕЧАНИЕ. Для дистальной окклюзии сегмента зажимы коронарной артерии Fogarty оказались наиболее подходящими, поскольку они прорезинизированы, что приводит к плотной закупорке толстой кишки, несмотря на внутрипросветную трубку между ветвями зажима. - Используйте второй шприц (стандартный 1 мл с канюлей 30G), чтобы осторожно влить 50 - 80 мкл 0,25% трипсина-ЭДТА в отрезанный сегмент толстой кишки и инкубировать в течение 10 мин. Оставьте канюлю и шприц, прикрепленные к тефлоновой трубке, чтобы предотвратить утечку жидкости.
ПРИМЕЧАНИЕ. Двоеточие необходимо раздувать, чтобы разрушить слизистый барьер и достичь стволовых клеток склепа, но не слишком сильно накачан, чтобы избежать перфорации зажатого сегмента. - Сначала удалите дистальный зажим, а затем трипсиновую трубку.
- Промойте дистальную кишку с помощью 500 мл нормального физиологического раствора, чтобы удалить оставшийся трипсин.
- Вставьте новую тефлоновую трубку, верните дистальный зажим на место и надуйте сегмент толстой кишки 50 - 80 мкл аденовирусного раствора (10 11 единиц образования бляшек (PFU) / мл в забуференном фосфатом физиологическом растворе) и инкубируйте в течение 30 мин ( Рисунок 2A ).
ПРИМЕЧАНИЕ. Не проливайте вирусный раствор, поскольку контакт с адено-креамином может привести к развитию опухоли в любой ткани условно мутантных мышей. - Снимите зажимы и трубку.
- Закрытие брюшной полости и послеоперационное восстановление
- Закройте брюшную стенку с 6-0 быстро абсорбируемым бегом su( Например , полидиоксанон (PDS)).
- Закройте кожу хирургическими раневыми зажимами.
- Поместите мышь на нагревательную подушку, установленную на 38 ° C, пока она полностью не восстановится после анестезии.
- Администрировать еще один болюс 0,05 мг / кг бупренорфина через 12 ч после операции, а затем дополнительные бупренорфиновые болюсы каждые 12 ч, если это необходимо.
- Наблюдайте за мышами не реже одного раза в день за признаки дистресса из-за роста опухоли.
2. Колоноскопия
ПРИМЕЧАНИЕ. В зависимости от условных мутаций аденовирусная инфекция приводит к эндоскопически видимым опухолям в течение 2-4 недель. Поэтому выполните первую послеоперационную колоноскопию через 2 недели после индукции аденовируса и повторите каждые 2 недели. Для мышечной колоноскопии рекомендуется использовать коммерчески доступную систему. 20
- Подготовка животных к колоноскопии
ПРИМЕЧАНИЕ. Пост не требуется.редактор Оставшееся фекальное вещество обычно хорошо формируется в дистальной толстой кишке и может вытесняться за пределы опухоли во время колоноскопии, что делает ненужным стрессовый процесс повторного поста.- Используйте севофлуран при 3 - 3,5 об.% Для общей анестезии. Потеря рефлекса пинча пальца указывает на достаточную анестезию.
- Накройте глаза анестезированных мышей офтальмической мазью, чтобы избежать высыхания роговицы.
- Удерживайте мышей в лежачем положении на маленьком столе.
- Колоноскопия
- Вставьте область (диаметр 1,9 мм, длина 10 см) в кишечный тракт через задний проход и тщательно инсуффляционный воздух под визуальным контролем, чтобы растянуть толстую кишку. Не вдыхайте больше воздуха, чем требуется для обследования.
ПРИМЕЧАНИЕ. Для вдувания воздуха можно использовать противотуманный воздушный насос колоноскопической системы. Если не имеется противотуманный пневматический насос, можно использовать любой другой воздушный насос с настройками очень низкого давления или предварительноСжатый воздух с нежным редукционным клапаном. Двуокись углерода (CO 2 ) легко приводит к ацидозу у мелких грызунов и поэтому его следует избегать. - Тщательно продвиньте область вперед, пока не будет обнаружено повреждение слизистой оболочки в дистальной ободочной кишке ( рис. 1A-1D ).
- Сохраните эндоскопические изображения для последующей оценки. Ранее была описана эндоскопическая система подсчета для внутрипросветных опухолей. 20
- Осторожно снимите область и поместите мышь на нагревательную колодку, установленную на 38 ° C, пока она полностью не восстановится после анестезии.
- Вставьте область (диаметр 1,9 мм, длина 10 см) в кишечный тракт через задний проход и тщательно инсуффляционный воздух под визуальным контролем, чтобы растянуть толстую кишку. Не вдыхайте больше воздуха, чем требуется для обследования.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Если выполнить адекватно,> 85% животных развивают опухоли. Смертность представленной здесь хирургической процедуры составляет <5%, смертность колоноскопии практически не существует. У большинства мышей обнаружено одно поражение; Около 30% может быть обнаружено 2 - 3 небольших аденомы, которые обычно сливаются с одной опухолью в течение 2 - 3 недель после индукции опухоли.
Фенотип и биологическое поведение результирующих ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Хотя их, как правило, легко создавать и поддерживать, классические мышиные модели CRC, основанные на инъекции клеточной линии, являются искусственными и не в состоянии полностью повторить человеческую болезнь. Как следствие, были разработаны GEMM. Первым CRC GEMM была мышь Apc Min , которая содержит гетерозиготную нулевую мутацию в гене Apc, поэтому имитирует семейный аденоматозный полипоз человека (FAP). Однако у мышей Apc Min неизменно развиваются множественные аденомы кишечника, не ограниченные ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа посвящена памяти профессора Морица Коха.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <сильно>Реагенты / расходные материалы | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Salt | Life Technologies GmbH | 14190169 | |
| Трипсин-ЭДТА (0,25%, фенол-красный) | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
| Нормальный физиологический раствор 0,9% (Е154) | Serumwerk Bernburg AG | 10013 | |
| Aqua ad injectabilia | B. Braun Melsungen AG | 235144 | |
| Ad5CMV-Cre (аденовирус, c = 2E+11 PFU/мл) | Вектор переноса генов Core University of Iowa | ||
| 15 мл, 50 мл центрифужные пробирки | Greiner Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
| Eppendorf tubes 1,5 мл/ 2 мл | Sarstedt AG & Co. | 72,695,400 | |
| Чашка Петри PS 100/15 мм (стерильная, Нуклон) | Fisher Scientific GmbH | 10508921/ NUNC150350 | |
| 1 мл Шприц (без мертвого объема) - Injekt-F SOLO | Braun/neoLab | 194291661 | |
| игла для инъекций 30G | BECTON DICKINSON | 304000 | |
| Name | Company | Каталожный номер< | strong>Комментарии |
| >Анальгезия / анестезия | |||
| Sevoflurane (Sevoflurane AbbVie) | AbbVie Germany GmbH & Co. KG-Медицинский | ||
| кислород | Air Liquide Medical | GmbH-Бупренорфин | |
| (Temgesic) | Indivior Eu Ltd. | - | |
| Бепантен - офтальмологическая мазь | Bayer Vital GmbH | 10047757 | |
| Настольный исследовательский наркозный аппарат x/O2 Flush с испарителем севофлурана Parkland | Scientific | V3000PS/PK | |
| strong>Название< | strong>Company | Номер в каталоге | Комментарии |
| <сильно>хирургическое оборудование | |||
| целлюлозные тампоны | Lohmann & Rauscher Deutschland | 13356 | |
| Инсулиновый шприц EMG 1 мл (с канюлей 30G) | B. Braun Melsungen AG | 9161627S | |
| Трубка тонкого отверстия (диаметр: 0,28 мм/ диаметр: 0,61 мм) | Smiths Medical Deutschland | 800/100/100 | |
| Щипцы Micro-Adson | Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Ножницы с диафрагмой - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Иглодержатель Olsen-Hegar | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| AutoClip Kit | Fine Science Tools | 12020-00 | |
| PDS Z1012H 6/0 C1 (хирургический шов) | Johnson & Johnson Medical GmbH | Z1012H | |
| Изогнутый микро серрефинный сосудистый зажим | Fine Science Tools | 18055-05 | |
| Фогарти Пружинные зажимы | Edwards | CDSAFE 6 | |
| Горячая плита 062 | Labotect | 13854 | |
| Isis - Бритва для волос | Aesculap - Braun | - | |
| >Name | Company | Каталожный номер | Комментарии |
| Colonoscopy | |||
| Cold Light Fountain XENON 175 SCB | Karl Storz | 20132101-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| Волоконно-оптический световой кабель | Karl Storz | 69495NL | Karl Storz Coloview System Mainz |
| TRICAM Трехчиповая головка камеры | Karl Storz | 20221030 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| TRICAM SLII Блок управления камерой | Karl Storz | 20223011-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| 15" Монитор с плоским экраном EndoVue | Karl Storz | 9415NN | Karl Storz Coloview System Mainz |
| телескоп HOPKINS Straight Forward Telescope диаметр 1,9 мм; длина 10 см автоклавируемый оптоволоконный светопропускающий встроенный | Karl Storz | 64301AA | |
| Защитный и смотровой чехол | Karl Storz | 61029C |
Ссылки
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2016. CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).
- Weitz, J., et al. Colorectal cancer. Lancet. 365 (9454), 153-165 (2005).
- Bork, U., et al. Prognostic relevance of minimal residual disease in colorectal cancer. World J Gastroenterol. 20 (30), 10296-10304 (2014).
- Steinert, G., Schölch, S., Koch, M., Weitz, J. Biology and significance of circulating and disseminated tumour cells in colorectal cancer. Langenbecks Arch Surg. 397 (4), 535-542 (2012).
- García, S. A., et al. LDB1 overexpression is a negative prognostic factor in colorectal cancer. Oncotarget. 7 (51), 84258-84270 (2016).
- van Noort, V., et al. Novel Drug Candidates for the Treatment of Metastatic Colorectal Cancer through Global Inverse Gene-Expression Profiling. Cancer Res. 74 (20), 5690-5699 (2014).
- Nanduri, L. K., García, S., Weitz, J., Schölch, S. Mouse Models of Colorectal Cancer-Derived Circulating Tumor Cells. Med Chem (Los Angeles). 6 (7), 497-499 (2016).
- Taketo, M. M., Edelmann, W. Mouse models of colon cancer. Gastroenterology. 136 (3), 780-798 (2009).
- Schölch, S., et al. Circulating tumor cells exhibit stem cell characteristics in an orthotopic mouse model of colorectal cancer. Oncotarget. 7 (19), 27232-27242 (2016).
- Schölch, S., et al. Radiotherapy combined with TLR7/8 activation induces strong immune responses against gastrointestinal tumors. Oncotarget. 6 (7), 4663-4676 (2015).
- Corbett, T. H., Griswold, D. P., Roberts, B. J., Peckham, J. C., Schabel, F. M. Jr Tumor induction relationships in development of transplantable cancers of the colon in mice for chemotherapy assays, with a note on carcinogen structure. Cancer Res. 35 (9), 2434-2439 (1975).
- Roper, J., Hung, K. E. Priceless GEMMs: genetically engineered mouse models for colorectal cancer drug development. Trends Pharmacol Sci. 33 (8), 449-455 (2012).
- Hung, K. E., et al. Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (4), 1565-1570 (2010).
- Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
- Shibata, H., et al. Rapid colorectal adenoma formation initiated by conditional targeting of the Apc gene. Science. 278 (5335), 120-123 (1997).
- Kuraguchi, M., et al. Adenomatous polyposis coli (APC) is required for normal development of skin and thymus. PLoS Genet. 2 (9), e146(2006).
- Jackson, E. L., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes Dev. 15 (24), 3243-3248 (2001).
- Olive, K. P., et al. Mutant p53 gain of function in two mouse models of Li-Fraumeni syndrome. Cell. 119 (6), 847-860 (2004).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).
- Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nat Protoc. 1 (6), 2900-2904 (2006).
- Moser, A. R., Pitot, H. C., Dove, W. F. A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse. Science. 247 (4940), 322-324 (1990).
- de Wind, N., Dekker, M., Berns, A., Radman, M., te Riele, H. Inactivation of the mouse Msh2 gene results in mismatch repair deficiency, methylation tolerance, hyperrecombination, and predisposition to cancer. Cell. 82 (2), 321-330 (1995).
- Reitmair, A. H., et al. Spontaneous intestinal carcinomas and skin neoplasms in Msh2-deficient mice. Cancer Res. 56 (16), 3842-3849 (1996).
- Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Dis Model Mech. 3 (9-10), 525-534 (2010).
- Jensen, T. L., Kiersgaard, M. K., Sørensen, D. B., Mikkelsen, L. F. Fasting of mice: a review. Lab Anim. 47 (4), 225-240 (2013).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Больше статей
Мышиная модель колоректального ракаинъекция аденовируса Creсегментарное инфицирование толстой кишкиколоноскопия высокого разрешенияметод мониторинга опухолейгенетически модифицированные мышихирургическая процедура на толстой кишкемеры биобезопасности при работе с аденовирусамифлуоресцентный Cre-репортерный аллельопухоли дистального отдела толстой кишки
