Описанная гидропонная система кокультивации поддерживает интактные растения с металлическими сетчатыми экранами и кокультивирует их бактериями. Растительные ткани, бактерии и секретируемые молекулы затем могут быть отдельно собраны для последующих анализов, одновременно позволяя исследовать молекулярные реакции как хозяев растений, так и взаимодействующих микробов или микробиомов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Система гидропонной совместной культивации для одновременного и систематического анализа молекулярных взаимодействий растений и микробов и сигнализации
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Экспериментальная разработка, имитирующая естественные взаимодействия с растениями-микробами, очень важна для определения сложных процессов передачи сигналов микроорганизмов растений. Arabidopsis thaliana - Agrobacterium tumefaciens Обеспечивает отличную модельную систему для изучения бактериального патогенеза и взаимодействия растений. Предыдущие исследования взаимодействия растений -Агробактерий в значительной степени опирались на культуры суспензий растительных клеток, искусственное ранение растений или искусственную индукцию микробных факторов вирулентности или защиту растений синтетическими химическими веществами. Однако эти методы отличаются от естественной сигнализации в planta , где растения и микробы распознают и реагируют в пространственных и временных манерах. В этой работе представлена гидропонная система кокультивации, в которой интактные растения поддерживаются сетками из металлической сетки и кокультивируются Agrobacterium . В этой системе кокультивации нет синтетического фитогормона или химического вещества, которое индуцирует micrБожественная вирулентность или защита растений дополняются. Гидропонная система кокультивации очень похожа на естественные взаимодействия растений и микробов и сигнализирует гомеостаз в пласте . Корни растений можно отделить от среды, содержащей Agrobacterium , и сигналы и реакции как хозяев растений, так и взаимодействующих микробов можно исследовать одновременно и систематически. В любой момент времени / интервал растительные ткани или бактерии могут собираться отдельно для различных анализов «омикшей», демонстрируя силу и эффективность этой системы. Гидропонная система кокультивации может быть легко адаптирована для изучения: 1) обратная сигнализация различных систем растений-микробов, 2) сигнализация между хозяином растения и несколькими видами микроорганизмов ( т.е. микробными консорциумами или микробиомами), 3) как связаны питательные вещества и химические вещества В сигнале растений-микробов и 4) как микробы взаимодействуют с хозяевами растений и способствуют устойчивости растений к биотическому oR абиотические стрессы.
Введение
Микроорганизмы, связанные с растениями, играют важную роль в биогеохимическом циклировании, биоремедиации, смягчении последствий изменения климата, роста растений и здоровья и устойчивости растений к биотическим и абиотическим стрессам. Микроорганизмы взаимодействуют с растениями как непосредственно через контакт стенки стенки растения, так и косвенно через химическую секрецию и сигнализацию 1 , 2 , 3 . В качестве сидячих организмов растения разработали прямые и косвенные механизмы противодействия инфекции патогенами. Прямые защитные средства включают структурную защиту и эк....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Экспериментальное планирование
- Определите конкретные цели эксперимента.
- Прочитайте весь протокол ниже. Определите, какие разделы имеют отношение к конкретным целям и должны ли быть сделаны какие-либо изменения. Ниже приведены примеры.
- Рассмотрим, будут ли в экспериментах использовать растения A. thaliana и бактерию A. tumefaciens , как показано ниже, или другую комбинацию растений-микробов.
ПРИМЕЧАНИЕ. Хотя можно использовать различные виды растений, толщина корней растений может потребовать сетку разного размера (шаг 3.3) и параметры роста (этапы 3.10-3.11 и 4.4) и размер гидропонног....
- Рассмотрим, будут ли в экспериментах использовать растения A. thaliana и бактерию A. tumefaciens , как показано ниже, или другую комбинацию растений-микробов.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Рост в гидропонной системе совместного культивирования
Кривая роста A. tumefaciens C58 продемонстрировала значительную лаг-фазу в первые 16 ч кокультивации, а затем очень стабильный рост при совместном культивировании с A. thaliana Col-0 до максимального OD 600 около 0,9, начиная с 48 ч постинокуляция. Напротив, по существу, бактериальный рост не наблюдался в контрольной культуре без A. thaliana
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Учитывая постепенный характер секреции корней, концентрация вызывающих вирулентность химических веществ, продуцируемых в planta, и их влияние на динамические взаимодействия растений и микробов происходят в пространственных и временных градиентах. В этой системе гидропонной совместной культивирования не добавляется синтетический фитогормон или химическое вещество, которое индуцирует микробную вирулентность или защиту растений. Напротив, используя обычные подходы, добавление синтетических химических веществ, таки.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить Брайана Веселовского и Александра У. Истмана за помощь и полезную дискуссию. Мы также хотели бы поблагодарить доктора. Юджин Нестер, Лингруй Чжан, Хайтао Шен, Юхай Цуй и Грег Торн за помощь, полезные обсуждения и критическое чтение рукописи. Это исследование было профинансировано сельским хозяйством и агропродовольственной Канадой, Growing Forward-AgriFlex (RBPI № 2555) и проектом «Рост вперед II» № 1670, проведенным авторами в рамках их обязанностей. Это исследование было также частично профинансировано Советом по исследованиям естественных наук и инженерных исследований Канады (NSERC) RGPIN-2015-06052, присуждаемым ZC Yuan.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| семена растений (Arabidopsis thaliana Col-0) | Arabidopsis Biological Resource Centre | CS7000 | https://abrc.osu.edu/order-stocks |
| бактерии (Agrobacterium tumefaciens C58) | Университет Вашингтона N/A | ||
| меченые бактерии | внутри компании | опционально, зависит от последующих анализов | |
| vortex | (различные) | ||
| микроцентрифуги | (разные) | ||
| микроцентрифуги | (разные) | ||
| 5% гипохлорита натрия | (разные) | ||
| двойная дистиллированная вода | (разные) | ||
| автоклав | разные) | ||
| микропипетки | (различные) | ||
| 70% этанол | (разные) | ||
| Мурашиге и Скуг (MS) базальные соли | Sigma-Aldrich | M5524 | |
| сахароза | (разные) | ||
| MES( | разные) | ||
| B5 витаминная смесь | Sigma-Aldrich | G1019 | |
| фитоагар | (разные) | ||
| Глубокие чашки Петри | (разные) | ||
| сетка из нержавеющей стали | Ferrier Wire Goods Company Ltd | Н/А | марка: 304; количество ячеек: 40 & 40; проволока DIA: 0,01 |
| микропористая лента, 1" | 3M | 1530-1 | |
| суточная камера для выращивания | (разные) | ||
| цилиндрические стеклянные баки, 100 & раз; 80 мм | Можно использовать Pyrex | 3250 | других размеров, в этом случае может потребоваться регулировка |
| содержимого жидкости | (различный) | ||
| forcepts | (различный) | ||
| экстракт дрожжей | различный) | ||
| триптон | (различный) | ||
| MgSO4( | различный) | ||
| встряхивающий инкубатор | (различный) | ||
| спектрофотометр | (различный) | ||
| шейкер | (различный) | ||
| ножницы | (различный) | опционально, зависит от последующих анализов | |
| флуоресцентный микроскоп | (различный) | опционально, зависит от последующего анализы | |
| предметные стекла микроскопа и защитные стекла | (различные) | опционально, зависит от последующих анализов | |
| лак для ногтей | (разные) | опционально, зависят от последующих анализов | |
| Набор для экстракции бактериальной РНК | (различный) | опционально, зависит от последующих анализов | |
| набор для экстракции растительных РНК (RNeasy Plant Mini Kit) | Qiagen | 74903 или 74904 | опционально, зависит от последующих анализов |
| материал и оборудование для qRT-PCR | (различное) | опционально, зависит от последующих анализов | |
| материал и оборудование для анализа микрочипов | (различное) | опционально, зависит от последующих анализов | |
| жидкий азот | (разное) | опционально, зависит от последующих анализов | |
| ступка и пестик | (различно) | опционально, зависит от последующих анализов | |
| 0,2 & микро; m поровый фильтр | (различный) | опционально, зависит от последующих анализов | |
| конические пробирки объемом 50 мл | (различные) | опционально, зависит от последующих анализов | |
| сублимационная сушилка | (различный) | опционально, зависит от последующих анализов | |
| герметичные пробирки | (различный) | опционально, зависит от последующих анализов | |
| этилацетат | (различный) | опционально, зависит от последующих анализов | |
| газообразный азот | (различный) | опционально, зависит от последующих анализов | |
| материал и оборудование для ВЭЖХ | (различный) | опционально, зависит от последующих анализов | |
| материал и оборудование для ESI-TOF-MS | (различный) | опционально, зависит от последующих анализов |
Ссылки
- Lambers, H., Mougel, C., Jaillard, B., Hinsinger, P. Plant-microbe-soil interactions in the rhizosphere: An evolutionary perspective. Plant Soil. 321 (1), 83-115 (2009).
- Philippot, L., Raaijmakers, J. M., Lemanceau, P., vander Putten, W. H. Going back to the roots: The microbial ecology of the rhizosphere. Nat. Rev. Microbiol. 11 (11), 789-799....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
