1. Сбор и транспортировка живой рыбы
ПРИМЕЧАНИЕ. В этом протоколе описывается, как собирать рыбу, которая имеет газовый пузырь, с глубины ≥15 м до поверхности. Быстрая транспортировка на поверхность вызовет расширение газового пузыря путем изменения давления, которое может серьезно повредить или убить рыбу. Предостережение оправданно, так как ущерб, нанесенный рыбе во время этого первого шага, отрицательно скажется на их выживании и последующем поведении.
- Перед погружением в SCUBA соберите следующие материалы: ручную сетку, подходящую для захвата целевых видов под водой; Двойные полиэтиленовые пакеты, которые достаточно велики для рыбы; Резиновые ленты (ø 80 мм x 6 мм); Кислородный баллон для надувания сборных мешков на поверхности; Эльбагин, который является противомикробным, содержит 10% ниферстиролата натрия; Коробка из пенополистирола, в которую помещают сборные мешки; пипеток; И, при необходимости (см. Шаг 1.4), веревку с длинойЭквивалентную максимальной глубине погружения, а также весу не менее 2 кг.
- Собирайте целевые виды рыб, используя ручную сеть во время дайвинга; Пока еще под водой, поместите захваченную рыбу в полиэтиленовый пакет и завяжите рот мешка резиновой лентой. Если для транспортировки рыбы в аквариум потребуется ≥1 день, также сохраните воду из естественной среды обитания в других мешках, чтобы использовать ее для обновления воды для хранения рыбы.
ПРИМЕЧАНИЕ. Для обеспечения безопасности подводные задачи должны выполняться как минимум двумя людьми. - Поверхность от точки сбора с мешками рыбы со скоростью не более 1 м / мин: при глубине 10 м и более останавливайте подъем по 1 - 5 минут каждые 2 м; И с глубины 10 м до упора поверхности в течение 1 - 5 минут каждые 1 м. Когда пойманная рыба не может поддерживать свою плавучесть в сумке ( т. Е. Если они всплывают с расширенным газовым пузырем, все еще пытаясь поплыть к дну), либо поддерживать ту же глубину в течение 1 - 5 мин, либоНа 1 - 2 м глубже. Как только рыба, похоже, восстановит свою плавучесть, возобновите восхождение на поверхность.
ПРИМЕЧАНИЕ. Если есть вероятность того, что воздух в резервуаре SCUBA истечет при подъеме, закрепите веревку в полиэтиленовый пакет и прикрепите вес ≥2 кг; После того, как подводный оператор благополучно поднялся, вытащите его на поверхность с теми же скоростями, которые указаны выше. - На пляже или на лодке растворите 10 ppm Elbagin в воде каждого полиэтиленового пакета после наплавки.
ПРИМЕЧАНИЕ. Хотя некоторые рыбы могут не поддерживать свою плавучесть сразу после того, как их вывезли на поверхность, можно ожидать, что большинство из них восстановится в течение одного дня. - Если плотность рыбы в сборном мешке высока, разделите рыбу между большим количеством мешков, чтобы предотвратить их повреждение друг друга, протирая друг друга во время транспортировки. Если рыба является агрессивным видом, разделите их отдельно между мешками.
- Наполните мешок для сбора кислородом и снова запечатайте рот мешка, используя rubberbands. При введении кислорода в мешок опустите сопло в воду мешка для увеличения содержания растворенного кислорода; Полностью вскрытый мешок должен быть на 1/4 наполнен водой.
- Храните сумки для сбора с рыбой в коробке из пенополистирола, чтобы поддерживать стабильную температуру воды и уменьшать напряжение рыбы в темных условиях.
- Если для транспортировки рыбы в аквариум потребуется ≥1 день, один раз в день обменивайте 1/4 до 1/3 воды в каждой сумке для хранения рыбы, используя воду, сохраненную из среды обитания, к которой добавлено 10 ppm Elbagin , И переупаковать каждый кислородом. Каждый день удаляйте мертвую рыбу и экскременты на дно вручную или пипеткой.
ПРИМЕЧАНИЕ. Если задействована перевозка самолета, подождите, по крайней мере, 1 день, чтобы приспособить рыбу к атмосферному давлению на поверхности перед транспортировкой, потому что в два этапа изменение давления (от подводного к поверхности и от поверхности к верхнему воздуху) в краткосрочной перспективе может отрицательно повлиять Выживание рыбы. я>
2. Акклиматизация рыбы в аквариум
- Поплавьте мешок с рыбой в аквариуме в течение 30 минут, чтобы уравнять температуру воды.
- В течение 10 минут постепенно обменивайте мешочную воду с аквариумной водой, чтобы избежать шока, вызванного внезапной разницей в химическом составе воды ( например , pH, солености).
ПРИМЕЧАНИЕ. Рыба, которая шокирована слишком большой разницей в химии воды, может показать аномальное изменение цвета и / или поведения тела. Следите за этим во время акклиматизации. - Растворите 10 м.д. Эльбаджин в аквариумной воде.
- После этого, один раз в день в течение 3 дней, обновите 1/3 аквариумной воды, добавив 10 ppm Elbagin к заменяемой воде.
- Наконец, начните устранять Эльбагин, обменивая половину аквариумной воды один раз в день, пока цвет не исчезнет.
3. Инъекция метки видимого имплантата (VIE) для идентификации отдельной рыбы
T "> ПРИМЕЧАНИЕ. В этой работе отдельные рыбы идентифицируются с использованием тегов VIE, например, см. Фредерик
10 , Олсен и Vøllestad
11 , Leblanc и Noakes
12. Кроме того, если изучаемые виды достаточно велики, чтобы держать их в руке , Хирургическая таблица, используемая на этапе 3.2, не требуется.
- Определите положение инъекции и цвет меток для каждого человека. Самый безопасный вариант - выбрать точку инъекции в толстой мышечной дорсальной или хвостовой части тела и не вводить ее в брюшную полость, где могут быть проколоты внутренние органы.
ПРИМЕЧАНИЕ. Система нумерации описана на рисунке 1 : если исследуемые виды достаточно велики для инъекций в 8 возможных положений, эта система позволит идентифицировать 154 человека, использующих один цвет. Десять цветов ярлыков VIE доступны в продаже. Выберите различающийся цвет, основанный на цвете тела рыбы. - Для рыб, которые меньше, чем можно держать в руке, подготовьте хирургическую таблицу следующим образом (см. Также Kinkel et al ., 13 ) ( рисунок 2 ).
- Вырежьте мягкую губку размером 5 см L x 5 см W и которая, по крайней мере, на 5-10 мм ниже высоты чашки Петри.
- Вырежьте канавку в губке глубиной приблизительно 5 - 10 мм и отрегулируйте ее ширину до ширины приблизительной ширины тела рыбы. Отрежьте плиту из поливинилхлорида (ПВХ) толщиной 0,3 мм до 5 см L x 5 см W и согните ее в складку долины (или М-образную форму).
- Установите рифленую ПВХ-плату поверх губчатой губки, а затем установите губку в чашку Петри (ø 160 мм, глубина 30 мм). Используйте воду из бака для регенерации, чтобы заполнить чашку Петри, пока плита из ПВХ не будет надлежащим образом погружена.
- Подготовьте теги VIE в соответствии с руководством по маркировке VIE. Смешайте эластомерные материалы и добавьте смесь к 3-мл сириNge с иглой 29-го калибра, которая содержится в комплекте.
- Подготовьте два резервуара для воды, которые нужно использовать при выполнении инъекций тегов: один для анестезии и один для восстановления; Отрегулируйте концентрацию температуры и солености в соответствии с водой в аквариуме для выращивания. Используйте воздушный насос с воздушным камнем, чтобы слегка циркулировать в резервуаре для сбора воды.
- Подготовьте жидкость для анестезии путем смешивания 2-метилхинолина с равным объемом 99,5% этанола; Добавьте это в резервуар для анестезии, чтобы достичь концентрации 18 ppm.
ПРИМЕЧАНИЕ. Оптимальная концентрация жидкости для анестезии будет зависеть от вида и размера тела индивидуумов. Поэтому изучите оптимальную концентрацию для исследуемых видов заблаговременно. - Перенесите отдельную рыбу в резервуар для анестезии и дайте им возможность обезболивать, то есть дождитесь, пока рыба не отреагирует на то, чтобы ее касались, или колебания воды, когда снаружи танка постучали. Поскольку цвет тела изменяется, когда он является анестезиейZed у многих рыб, также тщательно контролировать цвет тела и судить, обезболивается ли рыба из-за его изменений. Поскольку есть вероятность, что рыба может выпрыгнуть из резервуара для анестезии, держите ее закрытой с помощью прозрачной акриловой доски, по крайней мере, до тех пор, пока рыба не начнет медленно двигаться.
ПРИМЕЧАНИЕ. Точная настройка времени, необходимого для обезболивания и / или корректировки концентрации жидкости для анестезии, в зависимости от вида исследования и его размера тела. Если движение оперкулиума останавливается под наркозом, рыба будет подвергаться высокому риску смерти. - Поскольку рыба будет ослабевать, если их тело нагревается, держите пальцы в относительно холодной воде при обезболивании рыбы.
- Поднимите рыбу из анестезирующего резервуара и быстро измерьте ее или запишите необходимые данные (общая длина, пол и т . Д.). Если рыба, по-видимому, восстанавливается во время измерения, немедленно переведите ее обратно в резервуар для анестезии.
- Перенесите рыбу в хирургический стол. Установите вентральную сторону рыбы вниз в tОн ПВХ паз. Если размер тела очень мал, используйте бинокулярный микроскоп, делая инъекцию. Если изучаемый вид достаточно велик, чтобы держать его в руке, приложите ярлык VIE во время его удерживания.
- Расположите скошенную сторону иглы по направлению к внешней стороне и надавите на голову рыбы. Вставьте иглу подкожно, более или менее параллельно телу и как можно ближе к коже. Отрегулируйте глубину вставки в зависимости от размера тела рыбы и легкости, чтобы в конечном итоге увидеть метку.
- Вставляйте ярлык VIE во время снятия иглы и прекратите инъекцию до того, как скос иглы достигнет точки ввода иглы (это будет легко распознать, если вставить ярлык в относительно широкую область).
- По завершении инъекции тегов немедленно переместите рыбу в резервуар для регенерации. Если восстановление происходит слишком медленно, осторожно перемещайте воду вручную.
- После выздоровления верните рыбу в аквариум для выращивания и продолжайте добавлять 10 ppm ElБагина в воду в течение 3 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ. В условиях низкой видимости для тегов VIE, фильтр с фильтром UVA облегчит распознавание тегов.
4. Подсчет дождевых адгезивных яиц
- Чтобы создать искусственное нерестовое гнездо, на которое рыба может откладывать клейкие яйца, разрежьте непрозрачную трубу из ПВХ (длиной 5 см, 6 см) пополам, перпендикулярную диаметру.
ПРИМЕЧАНИЕ. Вышеуказанный размер трубы подходит для нереста относительно небольших goby T. marinae . Таким образом, отрегулируйте размер и форму трубы ПВХ, подходящую для исследуемых видов. - Распечатайте сетку 5 мм x 5 мм на водонепроницаемом листе и вырежьте ее, чтобы она соответствовала внутренней поверхности трубы из ПВХ.
- Закрепите водонепроницаемый лист на внутренней стороне трубы из ПВХ с помощью резиновой ленты.
ПРИМЕЧАНИЕ. Если женщинам сложно прикреплять яйца на непромокаемом листе, а яйца выпадают из листа, сделайте лист текстурированным наждачной бумагой. - Покройте дно аквариума слоем песка, 1- 2 см толщиной. Вставьте приблизительно одну треть трубы ПВХ наклонно в песок, с неподвижной стороной вниз.
- После успешного нереста рыбой удалите лист с яичной массой из трубы из ПВХ и поместите его в чашку Петри с аквариумной водой. Закрепите новый лист внутри трубы из ПВХ и поместите его обратно на дно аквариума. Наконец, подсчитайте яйца, сфотографируя массу яйца.
- В качестве альтернативы, если наблюдения за ухода за родительскими яйцами должны проводиться после нереста, будьте осторожны, чтобы не вывести яйца из воды. Скорее, используйте чашку Петри, чтобы зачерпнуть яйца и лист вместе с аквариумной водой, быстро сфотографировать массу яйца, а затем осторожно перевернуть лист с массой яйца обратно в ту же самую трубу из ПВХ, прежде чем вернуть все это в исходное положение на Нижней части аквариума. Наконец, подсчитайте яйца, используя изображение.
- Подсчитайте яйца с помощью ImageJ ( рисунок 3 ). Эти автоматические и ручные методы подсчета ячеек подробно описаны ниже: Базовый подсчет клеток (Чикагский университет, Комплексная интегральная микроскопия, http://digital.bsd.uchicago.edu/image_j.php); Анализ частиц (http://imagej.net/Particle_Analysis); Сотовый счетчик (https://imagej.net/Cell_Counter).
- В противном случае, если яйца осаждаются плотно, оцените количество яиц, вычислив отношение площади к площади: подсчитайте яйца в напечатанной сетке 5 × 5 мм 2, чтобы рассчитать плотность яйца, измерьте площадь поверхности, покрытую яйцами ImageJ, И оценивают общее количество яиц с указанной выше плотности на единицу площади и площадь поверхности. Вышеуказанный метод измерения площади поверхности с помощью ImageJ объясняется следующим: Установить масштаб ... (Отдел исследований услуг, https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html); В нем объясняется, как определить пространственный масштаб изображения; Использование ImageJ для измерения площади поверхности (Keene State college, AcademicТехнология, https://dept.keene.edu/at/2011/04/15/by-matthew-ragan/).
ПРИМЕЧАНИЕ. Если яйца прозрачны, черный водонепроницаемый лист более подходит для автоматического метода подсчета, потому что ImageJ может распознать контур яиц индивидуально.