Методическая статья

Нанопор секвенирования ДНК для анализа почвы метагеномных

32.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55979

⸱

14 декабря 2017 г.

 ,  , 
1Center for Biotechnology Education, Krieger School of Arts and Sciences, Johns Hopkins University

В этой статье

Краткое содержание

Нанопор технология секвенирования биомолекул имеет широкое применение в области наук о жизни, включая выявление возбудителей, мониторинга продовольственной безопасности, геномного анализа, metagenomic мониторинга окружающей среды и характеристика бактериальных устойчивость к антибиотикам. В этой статье показана процедура метагеномных почвы секвенирования ДНК для идентификации видов, с использованием технологии виртуализации Нанопор.

Аннотация

Эта статья описывает шаги для построения библиотеки ДНК от почвы, подготовка и использование ячейки Нанопор потока и анализ последовательностей ДНК, определены с использованием компьютерного программного обеспечения. Секвенирования ДНК Нанопор является гибкий метод, который позволяет для быстрого микробного генома для идентификации видов бактериальных и вирусных, характеризуют бактериальных штаммов и выявить генетические мутации, которые наделяют устойчивость к антибиотикам. Преимущества виртуализации (NS) для наук о жизни Нанопор включают его низкой сложности, снижение стоимости и быстрый режиме реального времени последовательности очищенного геномной ДНК, ПЦР ампликонов, образцы cDNA, или РНК. Значение параметра NS — пример «прядь секвенирование», который включает секвенирования ДНК, направляя одну мель молекулы ДНК через Нанопор, которая вставляется в синтетические полимерные мембраны. Мембрана имеет электрического тока применяется через его, так как отдельные базы проходят через Нанопор электрического тока нарушается в различной степени четырех оснований нуклеотидов. Идентификации Каждый нуклеотид происходит путем обнаружения характерной модуляцией электрического тока от разных базы, как они проходят через Нанопор. NS система состоит из КПК, питание USB портативного устройства и одноразовые потока ячейку, которая содержит массив Нанопор. Переносное устройство подключается к стандартной портативный компьютер, который считывает и записывает последовательность ДНК, с помощью компьютерного программного обеспечения.

Введение

Целью этой процедуры является продемонстрировать шаги, необходимые для подготовки экологической библиотеки ДНК для виртуализации, использование Нанопор потока клеток последовательности устройства и для выполнения анализа созданных последовательностей ДНК, с помощью системного программного обеспечения и Национальный центр биотехнологии информации (NCBI) Биоинформатика инструменты для определения видов микроорганизмов в почве. В настоящее время большинство платформ секвенирования ДНК требуют крупных инвестиций в техническую подготовку и сложных инструментария, который не является осуществимым в бедных условиях ресурсов или в области приложений. Платформа виртуализации (NS) Нанопор устраняет эти проблемы с экономически эффективной, простой в использовании библиотеки подготовка протокола и портативное устройство последовательности и проанализировать ряд различных видов нуклеиновые кислоты1,3. Мы включили платформы NS в несколько классов лаборатории для магистрантов.

Нанопор технология секвенирования биомолекул продемонстрировала широкое применение в области наук о жизни, включая выявление бактериальных и вирусных патогенов1,2,6, экологические биоразнообразия исследования, мониторинга продовольственной безопасности, геномный анализ3,5и характеристика бактерий к антибиотикам4. Значение параметра NS — быстрый и точный метод для последовательности нуклеиновых кислот, основанный на принципе «прядь секвенирование» путем обнаружения электрическим нарушение отдельных нуклеотидных баз когда один мель ДНК проходит через Нанопор вставляется в электрифицированных синтетические полимерные мембраны. Этапы подготовки ДНК NS включают генома фрагментации, конец ремонт и 3' dA хвостохранилища геномной фрагментов, адаптер и троса отжига в ДНК, ДНК библиотека очистки и загрузка библиотеки в ячейки устройство Нанопор потока. Фрагментация генома в ~ 8 КБ размеров достигается путем центрифугирования 1-2 мкг геномной ДНК через g-труба фрагментации. Фрагментированные геномной концы затем отремонтировать и хвост с поли да использование коммерчески доступных комплект. Один адаптер мель последовательностей, которые совместимы с Нанопор двигательные белки, добавляются к концам ДНК, которые используются для руководства последовательности ДНК через Нанопор (рис. 1). Троса последовательности требуются для очистки дна и для локализации молекул ДНК в поры мембраны. Шпилька генерируется безлигатурные шпилька адаптер к одному концу да хвостатых библиотеки. Шпилька структур на концах ДНК позволяет чтение смысл и antisense нити ДНК проходит через Нанопор (рис. 2). Затем подготовленный геномная библиотека очищается от реакции с помощью стрептавидина бусины с помощью магнитного поля, а затем загрузив Образец в ячейку Нанопор потока для анализа.

Последовательности ДНК оценивается качество и последовательность чтений, которые приемлемы для анализа затем подвергаются несколько инструментов биоинформатики для идентификации микробов. Последовательности «переведены» на FASTQ в формате FAST5. В FASTQ формате последовательности затем может использоваться в анализе взрыва.

Протокол

Примечание: Метагеномных ДНК очищается от почвы (Балтимор, Мэриленд) использование коммерчески доступных почвы геномной изоляции комплект (см. Таблицу материалы). С помощью УФ спектрофотометры (см. Таблицу материалы), очищенный геномной ДНК должны иметь коэффициент (Нм) 260/280 > 1.8 и 260/230 соотношение между 2,0-2,2 заверить, что образец свободной от загрязнений. Количество геномной ДНК, необходимых для NS колеблется от 200 нг 2 мкг.

1. Быстрый Библиотека метод подготовки (короткий протокол)

Примечание: Это короткий протокол. Смотрите Таблицу материалов в быстрой последовательности комплект.

  1. В 0,2 мл тонкостенной трубы (см. Таблицу материалы) добавить 200 нг высокой молекулярной массой ДНК в финале объем 7,5 мкл дистиллированной воды.
  2. Мкл 2,5 фрагментации смеси (FM) от быстрого библиотеки подготовка комплекта и перемешать аккуратно путем инверсии. Пульс центрифуги крутиться вниз (1000 x g 5 s).
  3. Поместите образец в Термоциклер (см. Таблицу материалы) за один раунд на 30 ° C в течение 1 мин, после чего 75 ° C в течение 1 мин снять трубку и пульс центрифуги крутиться вниз образца.
  4. 1 мкл быстрого адаптера и 0.2 мкл Блант/TA лигаза Мастер-микс, а затем хранить Библиотека адаптирована и привязными на льду.
    Примечание: Если с помощью короткой протокола перейдите к шагу 8

2. Перевязка последовательности протокол (длинный): Фрагментация ДНК в метагеномных

Примечание: См. Таблицу материалов для перевязки последовательности kit.

  1. Разбавьте 1 мкг очищенного геномной ДНК в окончательный объем 46 мкл в деионизированной воде.
  2. Передачи для фрагментацию ДНК образца трубки (см. Таблицу материалы) и центрифуги за 1 мин при комнатной температуре на 8000 x g с помощью microcentrifuge (см. Таблицу материалы), производить геномной фрагменты ~ 8 КБ. Убедитесь, что все жидкости прошло в коллекции трубку.
  3. Инвертируйте фрагментации трубки, возвращение к центрифуги и центрифуги за 1 мин для сбора разрозненных геномной ДНК в нижней палате.
  4. Передать трубку 1,5 мл стерильной низким ДНК-связывающих фрагментированных геномной ДНК и анализировать часть на геле агарозы низкий процент (0,6%), чтобы подтвердить фрагментации в > 30 КБ.

3. фрагментированным геномной ДНК конец подготовка

  1. С помощью 800 ng фрагментированных геномной ДНК в 45 мкл деионизированной воды, добавить 7 мкл конец подготовительные реакции буфера (см. Таблицу материалы), 3 мкл фермент смесь (см. Таблицу материалы) и 5 мкл нуклеиназы свободной воды.
  2. Микс от инверсии и пульс центрифуги (1000 x g 5 s).
  3. Передать образец 0,2 мл тонкостенной трубы и Проинкубируйте образцы для 5 мин при 20 ° C, следуют инкубации при 65 ° C за 5 мин.
  4. Пульс центрифуги довести содержание в нижней части трубки.
  5. Пример передачи к низкой ДНК привязки microcentrifuge 1,5 мл.
  6. Подготовьте магнитные бусы (см. таблицу материалов). Добавьте 60 мкл ресуспензированы бусы в конце подготовительные реакции от шаг 3.5 и микс, закупорить.
  7. Инкубируйте на смесителе ротатор при 100 об/мин (см. Таблицу материалы) для 5 мин при комнатной температуре.
  8. Пульс центрифуга образца Пелле бусы, а затем поместить образец рядом с магнитом.
  9. После того, как бусы привязаны к магниту, Пипетка супернатант и отменить.
  10. Снять трубку из магнита и мыть бисера с 200 мкл свежеприготовленные 70% этанола, нежно закупорить прихваченного образца.
  11. Пульс центрифуги Пелле бисер и вернуться к магниту.
  12. Супернатант снимите и выбросьте. Повторите шаг Стиральная, снова используя 200 мкл на 70% спирте.
  13. Пульс центрифуга трубки, возвращение к магниту и удалить все мыть этанол 70%.
  14. Открыв крышку пробки microcentrifuge, позволяют бусины в воздух сухой для 5 мин при комнатной температуре.
  15. Снять трубку от магнита и приостановить гранулы в 31 мкл стерильные, нуклеиназы свободной воды. Проинкубируйте 2 мин при комнатной температуре.
  16. Трубку можно вернуть магнита до тех пор, пока все швы гранулированных и элюата ясно.
  17. Передать пробки microcentrifuge 1,5 мл элюата. С помощью 1 мкл пример, количественно нацелен конце ДНК, используя Спектрофотометр UV на 260 Нм (см. Таблицу материалы).
    Примечание: Процент восстановления должно быть ~ 70% (700 нг) от начальной концентрации 1 мкг геномной ДНК.

4. адаптер и троса дополнение к End нацелен геномной ДНК фрагментов

  1. Смешать все лигаза Блант/TA мастер смесь трубок, инверсия, и затем пульс центрифуги довести содержание на дно.
  2. С помощью 30 мкл нацелен конце ДНК, добавьте 20 мкл адаптер смеси и 50 мкл Блант/TA лигирование мастер смеси.
  3. Смешать, инверсии, пульс центрифуги и проинкубируйте втечение 10 мин при комнатной температуре.

5. магнитные Bead подготовка

  1. Вихревой бусины и затем передачи 50 мкл взвешенных бисера отцентрифугировать 1,5 мл трубки.
  2. Место трубку на магнит гранул бисер, до тех пор, пока элюата очищает.
  3. Супернатант снимите и выбросьте.
  4. Добавить 100 мкл буфера шарик привязки (см. Таблицу материалы для бисера комплект) к бисеру, вихревой Ресуспензируйте бусины, Пелле бусы на магните, удалить супернатант и отбросить. Повторите стирки с 100 мкл буфера привязки.
  5. Добавьте 100 мкл буфера привязки шарик промывают бусины. Вихрь Ресуспензируйте бисер.

6. Библиотека очистки

  1. С помощью Р200 микропипеткой, мкл 40 бусы из предыдущего шага в адаптированных/привязал геномной ДНК. Смешайте образец тщательно закупорить.
  2. Инкубируйте образец ротатор смеситель при 100 об/мин за 5 мин при комнатной температуре.
  3. Поместите образец на магните и позволить бусины урегулировать. Пипетка с супернатант и выбросьте его.
  4. Ресуспензируйте бисер в 140 мкл буфера привязки шарик, закупорить. Поместите образец против магнит, отменить супернатанта и снова промыть еще 140 мкл буфера привязки из бисера.
  5. Пульс центрифуга трубки, место трубки на магните для 2 мин удалить оставшиеся привязки буфер шарик из гранул.

7. элюции библиотеки из бисера магнит

  1. Ресуспензируйте магнитные шарики в 15 мкл буфера, закупорить. Проинкубируйте образцы для 10 мин при комнатной температуре.
  2. Место трубки против магнит гранул бисер.
Когда решение очищает, удалите 15 мкл элюата и передачи 1,5 мл отцентрифугировать и поместите образец на льду.
  • Количественно библиотеки, используя Спектрофотометр UV.
    Примечание: Процент восстановления должно быть ~ 25% (250 нг) от начальной концентрации 1 мкг геномной ДНК.

    • 8. Запуск Запуск/контроль качества

    1. Удалить ячейку потока из упаковки и присоединить ячейку потока в портативный, реальном времени секвенсор (см. Таблицу материалы).
    2. Прикрепите sequencer к компьютеру через кабель USB и запустить программное обеспечение виртуализации (см. Таблицу материалы).
    3. Нажмите кнопку «Connect» устройство через программное обеспечение виртуализации, выберите «NC_Platform_QC.py» и нажмите кнопку «Пуск».
    4. Контроль качества (КК) занимает приблизительно 6-7 мин для завершения; Ищите «sea of green» (большие части вывода) на КК индикация для подтверждения, что есть достаточно активные поры (> 800) для секвенирования ДНК.

    9. Начиная с запуска последовательности

    1. Открыть программу виртуализации; появится диалоговое окно. В поле Образец ID имя образца.
    2. Нажмите на поле «Поток Cell ID» и введите код, найденных на наклейке на верхней части клетки потока.
    3. Открыть крышку ячейку потока и затем сдвиньте крышку порта образца вправо (по часовой стрелке), так что пример порт становится видимым. После того, как порт открыт, проверка для небольшой пузырек. Удалите несколько микролитров буфера, включая пузырь.
    4. Убедитесь в том, что существует буфера через сенсоров. Сделать буфер грунтовки, смешивая 480 мкл работает буфер с топливной смеси (RBF-1, см. Таблицу материалы) (убедитесь, что смесь тщательно первый) с 520 мкл нуклеиназы свободной воды.
    5. Добавьте 800 мкл буфера грунтовки грунтовка порт. Осторожно поднимите крышку «SpotOn», чтобы сделать его доступным.
    6. После 5 минут добавьте дополнительные 200 мкл буфера грунтовки грунтовка порт.

    10. Загрузка библиотеки

    1. Перед подготовкой библиотека место следующих реагентов на льду: RBF-1 (из комплекта секвенирования), адаптированы и привязал библиотека и библиотека загрузки бусины (LLB; из комплекта последовательности).
    2. Для пластиковых пробирок 0,2 мл добавьте 25.5 мкл РБФ и 12 мкл нуклеиназы свободной воды хранится при комнатной температуре.
    3. Смешайте LLB, закупорить вверх или вниз. 26.5 мкл LLB, на 0,2 мкл трубу. Смешайте реактивы, закупорить вверх или вниз.
      Примечание: Бакалавр стремится урегулировать из смеси.
    4. Мкл 11 библиотеки адаптированы и привязанный к трубе 0.2 мкл. Смешайте инверсии и спин центрифугированием импульса.
    5. Мкл 75 выборки из шага 9.4 в «SpotOn» порт каплям. Убедитесь, что каждая капля впадает в порт перед добавлением следующей.
    6. Тщательно закройте крышку порта образца таким образом, чтобы затыкать заходит в порт и заменить крышку устройства.

    11. Запуск сценария протокол программного обеспечения виртуализации

    1. Открыть в раскрывающемся меню «Выбор программы» и выберите «секвенирование 48 час.»
    2. Нажмите на кнопку «Выполнить», чтобы запустить скрипт.
    3. Проверьте результаты сканирования Mux сообщили в потоке уведомления на количество активных поры в MUX сканирования.
      Примечание: Этот номер может отличаться от числа поры в КК запуска и большая разница может указывать на проблему.
      1. Если есть значительное сокращение активного поры с КК запуска, перезапустите программное обеспечение и если есть еще значительная разница, перезагрузите компьютер.
    4. Убедитесь, что теплоотвод Температура 34 ° C как сообщает сценария виртуализации программного обеспечения.
      Примечание: Если температура не в 34 ° C не будет достаточно активные поры для запуска.
    5. Проверьте гистограмма чтения длины, чтобы определить, если длины последовательностей ожидаемых и подходит для экспериментальный дизайн.
    6. Закрытие рабочего агента с помощью «закрыть» Quit программного обеспечения виртуализации, закрыв веб-интерфейса. Отсоедините устройство от компьютера.

    12. анализ выполнения и результаты

    Примечание: Во время выполнения последовательности, данные можно контролировать с помощью программы «Просмотр отчета», с помощью рабочего агента. Во время или после завершения выполнения файлы доступны в FAST5 формат файла данных → читает → пройти папку (по умолчанию). Если эта папка открыта во время последовательности, компьютер может замерзнуть.

    1. Для просмотра и управления последовательностями, скачайте «HDFViewer».
    2. Для просмотра последовательности файлов, непосредственно открыть ХДФ просмотра → открытых данных папку → выберите все файловые типы → выберите C: диск (по умолчанию) → выбрать данные → выберите читает → выбрать перевал.
    3. Найдите и выберите файл FASTQ в левом выпадающем меню; файлы будут открываться и могут быть сохранены в формате FASTQ.
      Примечание: Для целей эксперимента студент, последовательности нуклеотидов, 350 или дольше были отобраны для дальнейшего анализа. Выход из базового вызова позволяет пользователю сортировать считывает последовательность на основе размера. FASTQ файлы могут быть проанализированы через взрыва (NCBI) или других программ биоинформатики.

    Результаты

    Экспериментальный дизайн и Нанопор технология обеспечивает быстрый и недорогой метод для студентов, чтобы последовательность почвы ДНК. Представитель запуск переданных параметров контроля качества с более чем 800 поры для виртуализации. Запуск в результате более чем 125000 читает доступные для исследования Средний последовательности длиной 5,38 КБ. Последовательности дают показатель качества и затем были проанализированы только те последовательности с приемлемыми показателями. На выходе последовательности реакция — в FAST5 формате, который не принимается программами например ДОМЕННАЯ (NCBI), последовательности рассматриваются в средстве просмотра ХДФ, который преобразует последовательности в FASTQ формате, который совместим для анализа взрыва. В будущем итерациях программного обеспечения, данные будут доступны в формате FASTQ, устраняя необходимость просмотра ХДФ. Смотреть дополнительные цифры 1, 2 и 3.

    Пятьдесят последовательности более 350 нуклеотидов в длину были предметом анализа BLASTN (нуклеотидов против нуклеотидных баз данных) или BLASTX (переведена на аминокислотной последовательности нуклеотидов) (NCBI) для идентификации организмов в пробе почвы. Учитывая время, ограничения класса и что внимание курса на лабораторных методов и не биоинформатики, у нас есть студенты анализировать последовательности в рамках этих параметров. Наши биоинформатики классы могут использовать данные для разработки инструментов анализа трубопровода. Такой уровень анализа биоинформатики в лаборатории на основе класса не рассматривается. В таблице 1 приведен список организмов, которые были выявлены с e значения меньше чем 4 e-04. Как правило e значения меньше, чем 4 e-04 указывают на сильное сходство между входной последовательности (запрос) и совпадающей последовательности. Организмов, выявленные BLASTN (с базой данных без избыточности (nr)) из различных видов и доступны для дальнейшей геномной и анализы белка. Этот образец почвы, который пришел из сада в Балтимор, MD никогда не были протестированы, поэтому отсутствуют предыдущие данные из которого необходимо определить, какие могут быть организмов в почве. BLASTN анализ (против базе nr) анализ также указали последовательности с без сходства в базе nr. Чтобы определить, если они действительно Роман последовательностей, требует дальнейшего изучения. Анализ нескольких последовательностей, BLASTX показал несколько белков от организмов, не представлены в BLASTN анализе. В таблице 2 перечислены несколько возможных белков, включая эндопептидазы и ATPases подобных белков. С помощью этой библиотеки последовательностей, студенты имеют возможность использовать более сложные Биоинформатика инструменты для выполнения дальнейшего анализа, если режиссер инструктор.

    figure-results-1
    Рисунок 1 : Подготовка геномная библиотека. Шаги для подготовки геномной ДНК библиотеки для виртуализации с использованием технологии Нанопор. Эта цифра была изменена с необходимыми разрешениями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

    figure-results-2
    Рисунок 2 . Схема последовательности ДНК с помощью Нанопор. ДНК, проходя через мембрану Нанопор с поколения и база идентификации электрического сигнала. Эта цифра была изменена с необходимыми разрешениями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

    Организмазначение e
    Стрептомицеты sp.3.00E-06
    Nocardoides sp.5.00E-04
    Гордония sp.5.00E-04
    Hyphomicrobium nitrativorens1.00E-139
    Starkeya Новелла1.00E-31
    Hyphomicrobium denitrificans1.00E-30
    Fibomicrobium sp.5.00E-17
    Pseudomonas sp.2.00E-15
    Rhodothemus marinus1.00E-17
    Turneiella parva2.00E-24
    E. coli0, 00E + 00
    Bradyrhizobium sp.3.00E-30
    Gemmatirosa kalamazoonesis1.00E-20
    Burkholderia sp.8.00E-10
    Sphingomonas sp.8.00E-10
    Cellumonas sp.6.00E-11

    Таблица 1: некоторые результаты анализа BLASTN. Последовательности ДНК метагеномики почвы подвергается BLASTN подобия Поиск в базе данных без избыточности нуклеотидов NCBI. Представленные данные имеют e значения 4 x e-4 или меньше.

    БелкаОрганизма
    Гипотетические белкаAcidobacter бактерии
    Сэм зависимых метилтрансферазаХ. denitrificans
    АТФазыJannaschia sp.
    ЭндопептидазыБактерии Shigella sonnei
    Лизис белкаE. coli

    Таблица 2: выбранные результаты анализа BLASTX. Последовательности ДНК метагеномики почвы подвергается BLASTX подобия Поиск в базе данных без избыточности белка NCBI.

    figure-results-3
    Дополнительные рисунок 1: платформа QC результаты. Представлены результаты платформы КК. В правом верхнем углу являются результаты КК для активного поры. Каждый квадрант ячейки потока проверяется на наличие активных поры. Главная страница является динамичным и изменяется как тестирование каждого квадранта. В этой перспективе 1414 одной поры были обнаружены.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

    figure-results-4
    Дополнительные рисунок 2: преобразование FAST5 файлы в файлы FASTQ. На правой стороне, Вот вывод данных из последовательности выполнения. Каждая строка представляет отдельные последовательности. В левой части цифра показывает выделенный последовательность с правой стороны, в средстве просмотра ХДФ, который преобразует последовательность в файл FASTQ, который может использоваться для дальнейшего анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

    figure-results-5
    Дополнительная цифра 3: пример FASTQ последовательность в ХДФ просмотра. Эта последовательность (читай 803) находится в файле FASTQ, который преобразует данные FAST5 в нуклеотидов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

    Обсуждение

    Были созданы многие следующего поколения методы секвенирования и каждый зависит от последовательности путем синтеза, но обнаружения платформ для выявления нуклеотидов различаются. NS, самое последнее дополнение к marketplace, использует другой метод полностью, которая не требует реакции последовательности или маркированы нуклеотидов. Этот метод использует заряда дифференциальных уже включены нуклеотидов как они проходят через электрифицированных поры. Идентификации Каждый нуклеотид происходит путем модуляции электрического тока различных баз, как они проходят через Нанопор. Эта мультиплексной системы позволяет пользователю последовательности много фрагментов одновременно. Секвенирование обе нити ДНК, значительно увеличивается точность последовательности и виртуализации программного обеспечения, которое может быть загружена на портативный компьютер, обрабатывает сигналы и предоставляет сведения о последовательности, могут быть проанализированы.

    В пиросеквенирования, секвенирование методом синтеза (SBS), выявление конкретных базы, включены в шаблон зависит Люцифераза пробирного и поколения хемилюминесцентный сигнал8. В ионная полупроводник последовательности, выпущенные ионов водорода, что снижает рН обнаружен датчик ионного9. Одной молекулы в реальном времени последовательности зависит от нулевой режим волны руководство (ЦМВ)10, который освещает для обнаружения флуоресцентными молекулы с тегами включены нуклеотидов. SBS использует уникальный метод для того чтобы усилить дна цели таковы, что кластеры уникальных последовательностей сгенерированный13. Обнаружение добавленные нуклеотида достигается, когда записывается флуоресценции тегами нуклеотидов. С другой стороны NS имеет уникальное преимущество перед другими методами, в том, что он требует ограниченные технические ресурсы, портативный, производит длинные последовательности читает, требует без предварительного амплификации ДНК и может эксплуатироваться по сниженной цене по сравнению с другими методами. Наши студенты нашли новые, быстрый библиотека приготовительная протокол быть простым и поддаются класс лаборатории три часа. Некоторые из вопросов, которыми мы столкнулись были пузыри в ячейке потока, которые трудно удалить, она требует значительной вычислительной мощности (один терабайт хранения), токовый выход данных находится в файле FAST5 и последовательности потока клетка имеет ограниченный срок годности до его ухудшается. Кроме того другие недостатки последовательности с NS перевязки (длинный протокол) является что требует несколько шагов подготовки Библиотека, требует опыта в методы молекулярной биологии и генерирует снижение последовательности верности по сравнению с некоторыми секвенирование методологии3. Однако последние достижения в комплект новых быстрого библиотека подготовки требует только 10 минут для приготовления библиотека и продемонстрировал снижение последовательности ошибок. Метод подготовки новой библиотеки был очень подходит для использования в классе лаборатории.

    Существует несколько важных шагов в протоколе, особенно в КК потока ячейки. Это включает в себя выполнение первоначальные КК в течение пяти дней с момента получения потока ячейки и их использование в течение 8 недель. Хотя мы использовали потока клетки, которые были за 8 недель, значительно снижается количество открытых активный поры. Важно, что эксперименты планируется подходят временную шкалу, где достигается максимальное использование потока клеток. Мы использовали очистки протокол и повторно потока клетки с успехом.

    Расследование метагеномики почвы представляют неиспользованные генетических резервуар микробного разнообразия. Например, предполагается, что один грамм почвы содержат между 107 - 109 прокариотических клеток14. Кроме того почвенные организмы являются основным источником Роман натуральных продуктов, ферментов и антибиотиков. Таким образом анализ последовательности ДНК метагеномики почвы представляет собой ценную учебные инструмент для студентов на всех уровнях образования. NS технологии простота использования и низкая стоимость делают эту систему очень эффективного учебного пособия. Студенты могут последовательность проб окружающей среды и по завершении последовательности использовать имеющиеся Биоинформатика инструменты для выявления и характеристики микробов и метагеномики последовательностей в испытательных образцов. Используя технологию NS, студенты имеют истинной практический опыт, который имеет до теперь из достичь для использования в лабораторных курсов благодаря передовой технический опыт и высокие издержки реагента, оборудование и техническое обслуживание в других платформах виртуализации. Недавно один из наших студентов (J. Харрисон, личного общения) сообщили об использовании этой технологии в проекте экологического мониторинга сельскохозяйственных почвах. Мы ожидаем, что там будет много больше приложений для этой технологии в образовательном пространстве.

    Раскрытие информации

    Авторы имеют не раскрытия.

    Благодарности

    Этот проект был поддержки в части, Университет Джона Хопкинса, Канцелярии Благочинный через шлюз научная инициатива.

    Материалы

    Список материалов, использованных в этой статье
    ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
    ТермоамплификаторLifeECOBTC42096
    Covaris g-TUBECovaris520079
    NEBNext End Repair ModuleNew England BioLabE7546
    Eppendorf LoBind Centrifuge TubesSigma-AldrichZ666505
    NEB Blunt/TA Ligase Master MixNew England BioLabMO367
    MyOne C1 Strepavidin BeadsThermo Fisher65001
    Eppendorf микроцентрифугаEppendorfModel 5420
    Nanodrop UV спектрофотометрThermo FisherND-2000Model 2000
    Belly Dancer Orbital ShakerSigma-AldrichZ768499
    Power Soil DNA Isolation KitMO BIO12888-50
    Лигирование Набор для секвенирования 2DOxford Nanopore SQK-LSK208
    Набор для быстрого секвенирования геномной ДНКOxford Nanopore SQK-RAD002
    End-Prep Реакционный буфер и смесь ферментов (NEB Blunt/TA Ligase Naster Mix)New England BioLabMO367
    AmPure XP Магнитные бусиныBeckman CoulterA63880
    Basic Starter Pack Оксфордский нанопор Включает в себя MinION  Устройство секвенирования и проточная ячейка
    Программное обеспечение MinKNOW OxfordNanopore 
    Набор для быстрого секвенирования геномной ДНКOxford Nanopore SQK-RAD002включает в себя бегущий буфер с топливом (RBF), фрагментационную смесь (FRM), быстрый адаптер (RAD), библиотеку ложементных шариков (LLB)

    Ссылки

    1. Quick, J., et al. Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance. Nature. 530 (7589), 228-232 (2016).
    2. Greninger, A. L., et al. Rapid metagenomics identification of viral pathogens in clinical samples by real-time nanopore sequencing analysis. Genome Med. 7, 99(2015).
    3. Quick, J., et al. Rapid draft sequencing and real-time nanopore sequencing in a hospital outbreak of Salmonella. Genome Biology. 16, 114(2015).
    4. Ashton, P. M., et al. MinION nanopore sequencing identifies the position and structure of a bacterial antibiotic resistance island. Nat Biotechnol. 33, 296-300 (2015).
    5. Loman, N. J., Quick, J., Simpson, J. T. A complete bacterial genome assembled de novo. using only nanopore sequencing data. Nat Method. 12, 733-735 (2015).
    6. Hoenen, T., et al. Nanopore Sequencing as a Rapidly Deployable Outbreak Tool. Emerg Infect Dis. 22 (2), 331-334 (2016).
    7. Petrosino, J. F., Highlander, S., Luna, R. A., Gibbs, R. A., Versalovic, J. Metagenomic pyrosequencing and microbial identification. Clin Chem. 55 (5), 856-866 (2009).
    8. Cummings, P. J., Ahmed, R., Durocher, J. A., Jessen, A., Vardi, T., Obom, K. M. Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization. J. Vis. Exp. (78), e50405(2013).
    9. Rothberg, J. W., et al. An integrated semi-conductor device that enabling non-optical genome sequencing. Nature. 475, 348-352 (2011).
    10. Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. Zero-mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at high concentrations. Science. 299, 682-686 (2003).
    11. Eid, J., et al. Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules. Science. 323, 133-138 (2009).
    12. Stoddart, D., Heron, A. J., Mikhailova, E., Maglia, G., Bayley, H. Single-nucleotide discrimination in immobilized DNA oligonucleotides with a biological nanopore. PNAS. 106, 7702-7707 (2009).
    13. Shendure, J., Hanlee, J. Next generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).
    14. Daniel, R. The Metagenomics of Soil. Nat Rev Microbiol. 3, 470-478 (2005).

    Перепечатки и разрешения

    Теги

    BLAST
    Нанопор секвенирования ДНК для анализа почвы метагеномных
    Свяжитесь с нами
    Рекомендовать библиотеке

    Конфиденциальность

    Условия эксплуатации

    Политика

    Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.