Method Article

Применение автоматизированного патч-зажима для изображений для изучения нейронов в средах мозга

DOI:

10.3791/56010

⸱

July 31st, 2017

 , 
1Department of Biological Sciences, Purdue University, 2Purdue Institute for Integrative Neuroscience, Purdue University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе описывается, как проводить автоматические эксперименты по патч-зажимам с использованием изображений с использованием системы, недавно разработанной для стандартного электрофизиологического оборудования in vitro .

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цельноклеточный патч-зажим является золотым стандартным методом для измерения электрических свойств отдельных клеток. Тем не менее, патч-фиксатор in vitro остается сложной и малопроизводительной техникой из-за ее сложности и высокой зависимости от работы и управления пользователем. В этой рукописи демонстрируется автоматическая система патч-фиксации, управляемая ими, для экспериментов с целыми клеточными зажимами in vitro в острых срезах мозга. Наша система реализует алгоритм, основанный на компьютерном зрении, для обнаружения флюоресцентно меченых ячеек и нацеливания на их полностью автоматическое исправление с использованием микроманипулятора и внутреннего контроля давления пипетки. Весь процесс очень автоматизирован, с минимальными требованиями к вмешательству человека. Экспериментальная информация в режиме реального времени, включая электрическое сопротивление и внутреннее давление пипетки, документируется в электронном виде для будущего анализа и оптимизации для разных типов ячеек. Хотя наша система описывается в контексте острого braiN, она также может быть применена к автоматизированному патч-клипу с ориентацией на изображение диссоциированных нейронов, органотипических культур срезов и других типов нейнерональных клеток.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Техника патч-зажима была впервые разработана Нехером и Сакманом в 1970-х годах для изучения ионных каналов возбудимых мембран 1 . С тех пор патч-зажим был применен к изучению многих разных субъектов на клеточном, синаптическом и контурном уровне - как in vitro, так и in vivo - во многих разных типах клеток, включая нейроны, кардиомиоциты, ооциты Xenopus и искусственные липосомы 2 , Этот процесс включает в себя правильную идентификацию и нацеливание ячейки, представляющей интерес, сложное управление микроманипулятора для перемещения пипетки патча в непосредственной близости от клетки, применение положительного и отрицательного давления к пипетке в надлежащее время для создания плотного гигасеального пластыря, И взлом, чтобы установить конфигурацию патчей цельной ячейки. Зажим патча, как правило, проводится вручную и требует обширного обучения. Даже для исследователя, испытывающего патчЗажим, уровень успеха относительно низок. Совсем недавно было предпринято несколько попыток автоматизировать эксперименты по патч-зажимам. Для достижения автоматизации были разработаны две основные стратегии: расширение стандартного оборудования для зажима патчей для обеспечения автоматического контроля процесса исправления и разработки нового оборудования и технологий с нуля. Бывшая стратегия адаптируется к существующим аппаратным средствам и может использоваться в различных приложениях патч-зажима, в том числе in vivo слепой патч-зажим 3 , 4 , 5 , патч-зажим in vitro острых срезов головного мозга, органотипические срезы кусочков и культивированные диссоциированные нейроны 6 , Это позволяет проводить опрос сложных локальных схем с одновременным использованием нескольких микроманипуляторов. 7 . Метод планарных патчей является примером новой стратегии разработки, которая может обеспечить одновременное выполнение высокопроизводительной pФиксация клеток в суспензии для скрининга наркотиков 8 . Однако метод планарных пятен не применим ко всем типам клеток, особенно к нейронам с длинными процессами или целыми цепями, содержащими обширные соединения. Это ограничивает его применение для картирования сложных схем нервной системы, что является ключевым преимуществом традиционной технологии патч-зажима.

Мы разработали систему, которая автоматизирует процесс ручного патч-клеща in vitro , дополняя стандартное аппаратное обеспечение патча. Наша система, Autopatcher IG, обеспечивает автоматическую калибровку пипетки, идентификацию целевых ячеек флуоресцентных клеток, автоматическое управление перемещением пипетки, автоматическое клонирование целых ячеек и регистрацию данных. Система может автоматически получать множественные изображения срезов мозга на разных глубинах; Анализировать их с помощью компьютерного зрения; И извлекают информацию, включая координаты флюоресцентно меченных клеток. Затем эта информация может бытьИспользуется для таргетинга и автоматического исправления интересующих ячеек. Программное обеспечение написано на Python - свободном языке программирования с открытым исходным кодом - с использованием нескольких библиотек с открытым исходным кодом. Это обеспечивает его доступность для других исследователей и улучшает воспроизводимость и строгость экспериментов по электрофизиологии. Система имеет модульную конструкцию, так что дополнительное оборудование может быть легко сопряжено с текущей системой, продемонстрированной здесь.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Настройка системы

  1. Постройте блок управления давлением.
    1. Соберите блок управления давлением в соответствии с картой схемы ( рис. 1 ). Припаяйте необходимые детали к печатной плате (PCB), изготовленной в соответствии с схемами электрических схем ( рис. 1b ). Используйте стандартные резисторы, светодиоды, полупроводниковые транзисторы с полевым эпитаксием (MOSFET), конденсаторы и разъемы (см. Таблицу материалов ). Припаяйте электромагнитные клапаны к печатной плате. Подключите воздушный насос и датчик давления воздуха к печатной плате с помощью электрического провода.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Для создания блока управления давлением необходимо сделать около 2 часов со всеми необходимыми деталями.
  2. Подключите плату вторичного сбора данных (DAQ).
    1. Подключите выходные данные данных от печатной платы к плате DAQ, следуя таблице 1 .
      ПРИМЕЧАНИЕ. Плата DAQ wilЯ работаю в режиме «Односторонний». Карту порта можно найти в руководстве пользователя (см. Таблицу ).
    2. Подключите «AIn Pr S» к одному из каналов аналогового входа (AI) и «R-Gr» к одному из аналоговых оснований на вторичной плате DAQ.
    3. Подключите первичный выход усилителя к одному из каналов AI и заземлению к аналоговому заземлению вторичной платы DAQ.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Стандартный кабель BNC можно использовать для подключения первичного выхода усилителя.
    4. Слейте другой конец и соедините положительный сигнал ( например, медный сердечник) с каналом AI и землей ( т. Е. Тонким проводом вокруг сердечника) с аналоговым заземлением. Повторите этот шаг для второго канала, если используется более одного канала патча.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Аналоговый вход на плату DAQ будет настроен на следующих этапах.
    5. Подключите питание к выходной мощности вторичной платы DAQ. Используйте отдельную мощность 12 В, поэтомуДля насоса.
  3. Подключите трубку.
    1. Подсоедините воздушный насос и два клапана в соответствии с таблицей 2 . Используйте 3-контактный разъем для соединения мягкой трубки с верхним портом клапана 2, датчиком давления и держателем пипетки на последнем шаге.
    2. Добавьте еще один 3-контактный разъем к трубке, подключенной к держателю пипетки, если используются две пипетки. Вручную переключайтесь между клапанами и пипетками, которые используются при патче.
  4. Установите Autopatcher IG.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Системное требование: Autopatcher IG тестировался только на ПК под управлением Windows 7. Он не был проверен для других операционных систем. Описанная процедура применяется конкретно к аппаратным средствам, перечисленным в Таблице материалов.
    1. Загрузите Autopatcher-IG из GitHub (https://github.com/chubykin/AutoPatcher_IG).
    2. Установите Python (см. Таблицу материалов для версии и адреса загрузки).
    3. Удалите PyQt4Библиотеки, набрав «pip uninstall PyQt4» в терминале командной строки.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Для обеспечения совместимости с библиотеками Qwt и Opencv система использует устаревшую версию библиотеки PyQt4.
    4. Установите библиотеки Python из исторических файлов колес (http://www.lfd.uci.edu/~gohlke/pythonlibs/). Найдите следующие файлы: Numpy (pymc-2.3.6-cp27-cp27m-win32.whl), Opencv (opencv_python-2.4.13.2-cp27-cp27m-win32.whl), Pyqt (PyQt4-4.11.4-cp27-none -win32.whl) и Qwt (PyQwt-5.2.1-cp27-none-win32.whl).
      1. Чтобы установить файлы колес, перейдите в каталог, где хранятся файлы, и введите «pip install *** wheelfilename ***. Whl.». Замените «*** wheelfilename ***» с фактическим именем файла.
        ПРИМЕЧАНИЕ: «cp27» в названии файла колеса указывает Python 2.7, а «win32» указывает на 32-битную Windows. Если «win32» не работает, попробуйте «win64».
    5. Чтобы управлять камерой CCD, загрузите и установите установщикДля 64-битного (https://www.qimaging.com/support/software/). Затем загрузите MicroManager для 64-битного (https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release) для управления камерой в Python.
    6. Чтобы управлять манипуляторами и ступенью микроскопа, установите программное обеспечение для управления, предоставленное производителем.
      ПРИМЕЧАНИЕ. При этом также устанавливается драйвер, необходимый для управления манипуляторами. Пакет установки обычно предоставляется на компакт-диске.
    7. Чтобы управлять вторичной платой DAQ, установите Universal Library с компакт-диска, при условии покупки платы DAQ.
  5. Настройте аппаратное обеспечение для Autopatcher IG.
    1. Подключите ступени микроскопа и манипуляторы к компьютеру через USB-порты.
    2. Назначьте номера COM-порта на единицу 0: ступень микроскопа, блок 1: левый манипулятор и блок 2: правый манипулятор в этом порядке в конфигурационном файле «ports.csv» в папке «Конфигурация». LСохраняйте остальные параметры в файле portss.csv ( т.е. «SCI» и «1») без изменений.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Информацию о номере COM-порта можно найти, запустив программное обеспечение конфигурации манипулятора, предоставленное производителем. Перейдите на вкладку «Настройки», выберите «Настройки» и страницу «Движение» и прочитайте метки для каждой вкладки вверху. В качестве альтернативы эту информацию можно найти в диспетчере устройств ПК.
    3. Назначьте номера аналоговых входных каналов на плате DAQ для датчика давления и патч-канала 1 и 2 (соответствует единицам 1 и 2). Введите номер канала в файле «DAQchannels.csv» в папке «Конфигурация».
      ПРИМЕЧАНИЕ. Рекомендуется открыть файлы .csv с помощью приложения «Блокнот» вместо электронной таблицы, так как это может изменить информацию при сохранении изменений.
  6. Запустите Autopatcher IG.
    1. Включите усилитель, контроллер микроскопа и контроллер манипулятора. EnsuЧто программное обеспечение усилителя работает.
    2. Запустите Autopatcher IG с Python из терминала командной строки следующим образом: сначала измените каталог (команда «cd» для большинства распространенных терминалов), где установлен Autopatcher IG, введите «python Autopatcher_IG.pyw» в терминале командной строки и нажмите "Введите ключ.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Не запускайте управляющее программное обеспечение манипулятора перед запуском Autopatcher IG, потому что он будет занимать стадию микроскопа и манипулятор, в результате чего Autopatcher IG не сможет найти аппаратное обеспечение. Программное обеспечение управления манипуляторами можно запускать после полного запуска IGP-автомата, если есть дополнительные модули для управления ( например, встроенный нагреватель).
  7. Откалибруйте основную пипетку.
    1. Вытяните пипетки, как описано выше 9 . Заполните выталкиваемую стеклянную пипетку внутренним раствором и загрузите ее на голову.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Пустые стеклянные пипетки имеют разные контрасты подМикроскоп и может привести к неточной калибровке.
    2. Переместите наконечник пипетки в поле зрения микроскопа и сфокусируйте его. Если панель управления используется для перемещения манипуляторов и / или микроскопа, обновите координаты, нажав «z» на клавиатуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это действие не требуется, если клавиатура (ступень микроскопа: A / D - ось x, ось W / S - y, ось R / F - z, манипуляторы: H / K - ось x, U / J - ось y, O / L - ось z, 1/2 - номер единицы) используется для управления перемещением, поскольку координаты будут обновляться в реальном времени.
    3. Нажмите кнопку «Начать калибровку» на главном графическом пользовательском интерфейсе (GUI) для соответствующего устройства, на котором загружена пипетка ( рисунок 2 ).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Когда калибровка закончится, появится всплывающее окно.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Калибровка будет выполняться автоматически, что займет около 3,5 минут. Нажатие на ту же кнопку (теперь переключается на «отменить калибровку» afTer инициирует калибровку) прервет попытку калибровки.
    4. Сохраните калибровку, нажав «сохранить калибровку» внизу основного графического интерфейса (он сохраняет текущую калибровку для обоих манипуляторов и может быть загружен в будущем).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Поле зрения при низком (4 или 10X) и высоком (40X) увеличении должно быть выровнено для нормальной калибровки вторичной калибровки. Пожалуйста, обратитесь к руководству пользователя оптической системы, используемой для процедур выравнивания.

2. Автоматическая процедура зажима патча

  1. Подготовьте острые срезы головного мозга, как описано ранее 10 .
  2. Подготовьте стеклянные пипетки для патч-клещей.
  3. Поместите один срез мозга в центр камеры записи. Стабилизируйте срез с удержанием ломтика или «арфа».
  4. Обнаружение флуоресцентной ячейки.
    1. Найдите интересующую область под объективом 4X. Переместите ступень микроскопа, включив cliCk-to-move («CTM») и щелкните центр интересующей области. В качестве альтернативы, используйте клавиатуру для перемещения ступени микроскопа (A / D - ось x, W / S - ось y, R / F - ось z).
    2. Переключитесь на объектив с высокой степенью увеличения и отрегулируйте фокус, перемещая микроскоп по оси z, используя R / F на клавиатуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Рекомендуется регулировать уровень водяной бани так, чтобы фокальная плоскость под объективами с низкой и высокой увеличением была одинаковой или похожей на оси z.
    3. Нажмите кнопку «Detect Cell» в главном столбце GUI, «Unit 0.» Если светодиодный или лазерный источник света не может управляться сигналом TTL, вручную включите светодиод / лазер; При обнаружении ячейки появится всплывающее окно.
      1. При необходимости выключите светодиод / лазер; В графическом интерфейсе «Позиции памяти» появится список координат ячейки. Удалите нежелательные ячейки из списка, нажав кнопку «X» рядом с координатами.
      2. Альтернативно, если целевые ячейки не помечены флуоресцентно, нажмите «Режим мыши» в главном графическом интерфейсе. Нажмите на интересующую ячейку; В ячейке появится желтая точка с номером, а координаты ячейки появятся в графическом интерфейсе «Позиции памяти».
  5. Откалибруйте вторичную пипетку.
    1. Заполните 1/3 стеклянной пипетки с внутренним раствором. Загрузите пипетку на держатель пипетки, прикрепленный к головной ступени.
    2. Используйте объектив с малым увеличением. Принесите пипетку в поле зрения и отрегулируйте фокус с помощью клавиатуры (H / K - ось x, ось U / J - y, ось O / L - z). Используйте «1» и «2» для переключения между блоком 1 и блоком 2.
    3. Загрузите основную калибровку, нажав «Загрузить калибровку». Нажмите кнопку «Вторичная калибровка» в главном графическом интерфейсе под используемым устройством. Например, если используется блок 2, нажмите кнопку «Вторичная калибровка» в «Unit 2» column. Следуйте инструкциям всплывающего окна, чтобы переключиться на объектив с высоким увеличением.
  6. Исправить целевую ячейку.
    1. Убедитесь, что программное обеспечение «MultiClamp» ( т.е. усилитель) работает. Нажмите кнопку «Patch control», чтобы открыть графический интерфейс «Patch control»; Для открытия этого графического интерфейса может потребоваться до нескольких минут.
    2. Используйте объектив увеличения 40X, проверив «40X» в главном столбце «Единица 0». Нажмите кнопку «идти» рядом с ячейкой, представляющей интерес, в списке координат в графическом интерфейсе «Позиция памяти»; Микроскоп переместится в ячейку.
    3. Нажмите кнопку CTM устройства, используемого в главном графическом интерфейсе, чтобы включить движение после щелчка мышью. Нажмите на интересующую ячейку; Наконечник пипетки будет перемещаться в ячейку.
    4. Нажмите кнопку «Patch» в графическом интерфейсе «Patch control».
      ПРИМЕЧАНИЕ. Автоматическое исправление начнется, и давление и сопротивление могутГрафический интерфейс «Patch control».
      1. Используйте кнопку «Unit 1 selected» для переключения входного сигнала между двумя блоками.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Система будет приближаться к целевой ячейке, применять отрицательное давление, соответствовать потенциалу клеточной мембраны и обнаруживать гигазальное образование на основе серии порогов давления и сопротивления и логики.
      2. Манипулируйте автоматическим процессом в любой момент, щелкнув соответствующие кнопки в графическом интерфейсе «Patch control». Например, нажмите кнопку «Патч» еще раз, чтобы отменить пробную версию патча и нажать «Следующий этап», чтобы продвинуть процесс исправления на следующий шаг, независимо от порога.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Всплывающее окно уведомляет пользователя о появлении гигаселя, а также возможность применения zap наряду с большим отрицательным давлением.
    5. Выберите «Да», чтобы разбить комбинированный запястье и всасывание. В качестве альтернативы, выберите «Нет», чтобы входить только с отсосом.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Когда успешное завершение целой ячейки завершено, всплывающее окно напомнит пользователю сохранить журнал патча эксперимента.
    6. Сохраните журнал патча эксперимента.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Если пробная версия исправления не удалась, всплывающее окно уведомит пользователя, и процесс исправления будет сброшен.
    7. Вернитесь к шагу 2.4 и повторите шаги с другой ячейкой.
  7. Уточните пороговые значения (необязательно).
    ПРИМЕЧАНИЕ. Пороговые значения для диапазона сопротивления пипетки, положительного и отрицательного давления, гигасеального сопротивления и т . Д. Могут быть изменены из файла конфигурации.
    1. Откройте файл «PatchControlConfiguration.csv» в папке «Конфигурация» в пункте назначения, где установлена ​​система. Измените числа, соответствующие каждому пороговому значению. Не изменяйте имена значений; Это приведет к неузнаваемым записям в системе.
    2. Внесите новые пороговые значения немедленно, нажав «CtRl + L "без перезапуска программы, перезапуск программы будет реализовывать новейшее пороговое значение из файла.

3. Выполнение записей

ПРИМЕЧАНИЕ. Режим в управляемом компьютером микроэлектродном усилителе автоматически устанавливается на текущий зажим («IC») с помощью программного обеспечения автозапуска после успешного завершения патча. Записи цельного клеточного зажима могут быть сделаны с использованием выбранного программного обеспечения для записи (эта система не включает функцию записи). Если было идентифицировано несколько целевых ячеек, после завершения записи вернитесь к шагу 2.4 и попробуйте другую ячейку.

  1. Проведите автоматические местные эксперименты по применению лекарств с использованием пикоприцера (необязательно).
    ПРИМЕЧАНИЕ. Здесь в качестве примера используется локальный эксперимент по применению лекарств для описания того, как использовать дополнительную функцию «Command Sequence» для управления внешним оборудованием через TTL-сигналы.
    1. Подключить порт A chaNnel 0 и заземление на вторичной плате DAQ на вход триггерного запуска на цифровом преобразователе с использованием отсоединенного BNC-кабеля (как описано в шаге 1.2.3). Подключите один цифровой выходной канал на цифровом преобразователе к внешнему триггеру на пикоприцере.
    2. Подготовьте пикоприцеп в соответствии с руководством пользователя. Подключите выход воздуха picospritzer к держателю пипетки с наркотиками, прикрепленному к микроманипулятору.
    3. Загрузите пипетку, наполненную препаратом выбора. Прикрепите его к держателю пипетки. Откалибруйте пипетку, как описано на шаге 1.7.
    4. После исправления ячейки, как описано на шаге 2.6, выберите желаемое место доставки лекарственного средства, щелкнув мышью в графическом интерфейсе камеры в режиме «мыши» (переключившись с основного графического интерфейса). В качестве альтернативы, используйте графический интерфейс «Grid» для создания сетки, причем каждый пиксель в сетке является одним из целевых местоположений.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Сетка можно манипулировать в графическом интерфейсе камеры, перетаскивая мышью.
    5. В «Command Sequ»Ence ", выберите блок манипулятора, на котором смонтирована пипетка. Нажмите« загрузить точки мыши »или« загрузить точки сетки », чтобы импортировать все координаты для доставки лекарств.
      1. Нажмите на каждую запись координат, чтобы отредактировать конкретную команду TTL-сигнала в правом столбце. В первой записи команды нажмите на самую цифровую цифру, чтобы перевести ее с «0» на «1», отправив сигнал TTL + 5-V TTL. Установите время (T) на желаемую длительность сигнала TTL, в мс.
      2. Во второй команде введите все цифры в «0» и установите значение T на длительность записи. Редактируйте команды для всех записей координат. Добавьте записи команд, нажав «+», если необходимо несколько сигналов TTL.
        ПРИМЕЧАНИЕ. 8-разрядные биты представляют собой каналы A-канала 0-7 на вторичном DAQ (порты 1 - 3 заняты насосом и двумя клапанами) могут быть переключены, если необходимо.
    6. Создайте протокол записи в модуле сбора данных, чтобыЧто начало развертки запускается внешним триггером запуска. Отредактируйте протокол для доставки препарата в нужное время.
    7. В графическом интерфейсе «Command Sequence» нажмите «Запустить» слева, чтобы запустить все координаты. Кроме того, нажмите «Запустить» справа, чтобы запустить только выбранную последовательность.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Пипетка будет перемещаться в каждую координату и выполнять TTL-сигнал, как определено для начала развертки записи.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наша система была проверена на ее способность исправлять клетки в острых срезах головного мозга, мышиные индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs), дифференцированные в нейроны, и клетки HEK 293, искусственно выражающие интересующие каналы. На фиг.3 показан эксперимент с использованием трансгенных мышей Thy1-ChR2-YFP (B6.Cg-Tg (Thy1-COP4 / EYFP) 18Gfng / J), предназначенных для флуоресцентно меченных пирамидальных нейронов 5-го слоя в зрительной...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем метод автоматической записи патч-зажима с использованием изображений in vitro . Основные этапы этого процесса суммируются следующим образом. Во-первых, компьютерное зрение используется для автоматического распознавания наконечника пипетки с помощью серии изображений, полученных с помощью микроскопа. Эта информация затем используется для вычисления функции преобразования координат между микроскопом и системами координат манипулятора. Компьютерное зрение используется для автоматического обнаруж...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Неограниченная патентная заявка «СИСТЕМЫ И МЕТОДЫ АВТОМАТИЗИРОВАННОЙ ЭЛЕКТРОФИЗИОЛОГИИ АВТОМАТИЗИРОВАННЫХ ИЗОБРАЖЕНИЙ В ВИТРО», № US 15 / 353,719, была подана 16 ноября 2016 года, Ref. №: PRF 67270-02.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарны за финансовую поддержку Фонда Уайтхолла. Мы хотели бы поблагодарить Самуэля Т. Киссинджера за ценные замечания.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ПЗС-камераQImagingRolera Bolt
Электрофизиологическая установкаScientificaSliceScope Pro 2000Включает в себя микроскоп и манипуляторы. Программное обеспечение для управления манипулятором, представленное в данной рукописи, представлено производителем: « Линлаб2".
УсилительМолекулярные устройстваMultiClamp 700BУправляемый компьютером микроэлектродный усилитель
ДигитайзерМолекулярные устройстваAxon Digidata 1550
Светодиодный источник светаCool LEDpE-100488 нм длина волны
Плата сбора данныхИзмерительныеUSB1208-FSВторичный DAQ.
Смотрите инструкцию по адресу: http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf
электромагнитные клапаныThe Lee Co.
Воздушный насосВиртуальная промышленностьVMP1625MX-12-90-CH
Датчик давления воздухаFreescale полупроводниковыйMPXV7025G
Прижим срезаWarner instruments64-1415 (SHD-40/2)Комплект анкеров для слайса, плоский для камеры RC-40, 2,0 мм, 19,7 мм
PythonAnacondaверсия 2.7 (32-битная для Windows)https://www.continuum.io/downloads
Винтовые клеммыSparkfunPRT - 08084Винтовые клеммы с шагом 3,5 мм (2-pin)
(2-pin)
N-канальный MOSFET 60 В 30 ASparkfunCOM - 10213
DIP Sockets Solder Tail - 8-контактныйSparkfunPRT-07937
LED - базовый красный 5 ммSparkfunCOM-09590
Светодиод - Базовый зеленый 5 ммSparkfunCOM-09592
Разъем / разъем питания постоянного тока (SMD)Настенный адаптер SparkfunPRT-12748
Настенный адаптер Источник питания - 12 В постоянного тока 600 мАSparkfunTOL-09442
Соединительный провод - ассортимент (сплошной сердечник, 22 AWG)SparkfunPRT-11367
Фиксирующая вилка x Гнездо x Гнездо Внутренний стоп-кранARK-PLASRCX10-GP0
Гибкая трубка Fisherbrand Tygon S3 E-3603Fisher scientific14-171-129Внешний диаметр: 1/8 дюйма < > Внутренний диаметр: 1/16 дюйма
Коаксиальный кабель BNC с наружной резьбой BNCКомпоненты BelkinF3K101-06-E
Резистор 560 Ом (допуск 5%)Radioshack2711116
PicospritzerGeneral ValvePicospritzer II
вычисления LHDA0531115H

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
  2. Collins, M. D., Gordon, S. E. Giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology. J Vis Exp. (76), (2013).
  3. Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo. Nat Methods. 9 (6), 585-587 (2012).
  4. Desai, N. S., Siegel, J. J., Taylor, W., Chitwood, R. A., Johnston, D. MATLAB-based automated patch-clamp system for awake behaving mice. J Neurophysiol. 114 (2), 1331-1345 (2015).
  5. Kodandaramaiah, S. B., et al. Assembly and operation of the autopatcher for automated intracellular neural recording in vivo. Nat Protocols. 11 (4), 634-654 (2016).
  6. Wu, Q., et al. Integration of autopatching with automated pipette and cell detection in vitro. J Neurophysiol. 116 (4), 1564-1578 (2016).
  7. Perin, R., Markram, H. A computer-assisted multi-electrode patch-clamp system. J Vis Exp. (80), e50630(2013).
  8. Fertig, N., Blick, R. H., Behrends, J. C. Whole cell patch clamp recording performed on a planar glass chip. Biophys J. 82 (6), 3056-3062 (2002).
  9. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. (20), (2008).
  10. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. J Vis Exp. (112), (2016).
  11. Campagnola, L., Kratz, M. B., Manis, P. B. ACQ4: an open-source software platform for data acquisition and analysis in neurophysiology research. Front Neuroinform. 8 (3), (2014).
  12. Kolb, I., et al. Cleaning patch-clamp pipettes for immediate reuse. Sci Rep. 6, (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Automated Patch ClampImage Guided Patch ClampWhole Cell Patch ClampAcute Brain SlicesComputer Vision AlgorithmFluorescent Cell DetectionMicromanipulator ControlInternal Pipette PressureElectrical Resistance MonitoringGigaseal Formation

Related Articles