Метод на основе фильтрации на основе высококачественных ядер из сшитой скелетной мышцы для иммунопреципитации хроматина

Summary

Мы представляем протокол, основанный на фильтрации, для выделения высококачественных ядер из сшитой скелетной мышцы скрещивания, в результате чего мы устраняем необходимость в ультрацентрифугировании, что делает его легко применимым. Мы показываем, что хроматин, полученный из ядер, подходит для иммунопреципитации хроматина и, вероятно, исследований хромогена иммунопреципитации.

Abstract

Хроматиновая иммунопреципитация (ChIP) является мощным методом определения связывания белка с ДНК хроматина. Однако богатая волокнами скелетная мышца была проблемой для ЧИП из-за технических трудностей в изоляции высококачественных ядер с минимальным загрязнением миофибрилл. Предыдущие протоколы пытались очистить ядра перед сшиванием, что сопряжено с риском изменения взаимодействия ДНК-белка во время процесса подготовки длительных ядер. В текущем протоколе мы сначала скрещивали скелетную мышечную ткань, собранную у мышей, и ткани измельчали ​​и обрабатывали ультразвуком. Поскольку мы обнаружили, что ультрацентрифугирование не способно отделять ядра от миофибрилл, используя сшитую мышечную ткань, мы разработали последовательную процедуру фильтрации для получения высококачественных ядер, лишенных значительного миофибрильного загрязнения. Затем мы получали хроматин с помощью ультразвукового анализатора, а анализы ChIP с антителом против BMAL1 выявили устойчивое циркадное связываниеОбразец BMAL1 для целевых промоторов генов. Этот протокол фильтрации представляет собой легко применимый метод выделения высококачественных ядер из сшитой ткани скелетных мышц, что позволяет проводить последовательную обработку проб для суточных и других чувствительных к времени исследований. В сочетании с секвенированием следующего поколения (NGS) наш метод может быть развернут для различных механистических и геномных исследований с упором на функцию скелетных мышц.

Introduction

Скелетные мышцы играют важную роль в физиологии и поведении. Многонуклеированное мышечное волокно состоит из миофибрилл, где функциональные единицы актина и миозина образуют саркомеры для создания сократительной силы. Скелетные мышцы также являются крупнейшим метаболическим органом в организме, что составляет> 80% потребления постпрандиальной глюкозы на 80% и регулирует реакцию инсулина и метаболический гомеостаз ^{1 , 2} . Физиология мышц и метаболизм тесно регулируются циркадианными часами, внутренним биологическим таймером ^{3 , 4 ,}

Protocol

Уход за животными осуществлялся в соответствии с руководящими принципами Комитета по институциональному уходу и использованию животных (IACUC), и процедуры проводились в соответствии с протоколом животных, одобренным Научным центром здоровья Университета Техаса в Хьюстоне.

1. Изоляция ядер из сшитой скелетной мышцы

1. Взвешивают и сжимают скелетную мышцу задней конечности, изолированную от приблизительно 20-недельных мышей C57BL / 6 самцов, в ледяном забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS), как подробно описано ранее ²² .
   ПРИМЕЧАНИЕ. Обычно мы получаем 1,0-1,5 г скелетной мышцы от одной ....

Results

Здесь мы проводили сшивание формальдегида сразу после сбора ткани для сохранения взаимодействия ДНК-белка в реальном времени. Однако мы обнаружили, что сахароза или коллоидный градиент, обычно используемый для выделения ядер ^{23 , 24} , не эффективен для отделения ядер от миофибрилл (данные не показаны). Причина может заключаться в том, что сшивание придавало аналогичную гравитацию для ядер и миофибрилл. Поэтому мы разработали проц.......

Discussion

Здесь мы опишем надежный метод, в котором сшитые скелетные мышечные ткани использовались для выделения высококачественных ядер. Была проведена последовательная фильтрация для эффективного отделения ядер от мусора, а ультразвуковая акустическая энергия от чашеобразного преобразователя срезала хроматин для анализа ChIP. Результаты показали циркадианное специфическое по времени связывание BMAL1 с целевыми промоторами.

ChIP можно использовать для захвата белка в реальном времени на геномную ДНК .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<сильно>Материалы
Раствор формальдегида	Sigma Aldrich	F8775
Глицин	Fisher Scientific	BP381-5
Трипан Синий раствор (0,4%)	Fisher Scientific	15250061
РНКаза А	Сигма Олдрич	10109142001
протеаза К	сигма Олдрич	3115887001
куриное антитело			анти-BMAL1Получен в курице (Cocalico Biologicals) против антигена aa 318 - 579, а IgY был аффинно очищен с использованием того же антигена.
Осаждающая смола для курицы	IgY GenScript	L00405
Equipment
KINEMATICA  Polytron PT2100 Настольный гомогенизатор	Fisher Scientific	08-451-178
15 мл Измельчитель тканей	Dounce Whearton	357544
Falcon Cell Siters 100 &микро; m	Fisher Scientific	08-771-19
Фильтры для клеток Falcon 70 & микро; m	Fisher Scientific	08-771-1
Фильтры для соколиных клеток 40 & микро; m	Fisher Scientific	08-771-2
pluriStrainer 30 &микро; m	PluriSelect	43-50030-03
pluriСитечко 20 и микро; m	PluriSelect	43-50020-03
pluriСитечко 10 & микро; m	PluriSelect	43-50010-03
Covaris S2 Сфокусированный ультразвуковой аппарат	Covaris	Model S2
Labquake	Thermo Scientific	C415110
Камера для ПЗС-микроскопа	Leica Microsystems	DFC3000 G
Reagent Kit
DNA Extraction	Kit Thermo Scientific	K0691
Buffers
Все компоненты буфера описаны в протоколе. Каждый компонент был закуплен у Sigma Aldrich