Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Электросудорожная изъятий в крыс и фракционирование их гиппокампах для изучения захват индуцированные изменения в постсинаптической плотность белки

12K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56016

⸱

15 августа 2017 г.

 ,  , 
1Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Neuroscience Program, University of Illinois at Urbana-Champaign

В этой статье

Краткое содержание

Электросудорожная захват (ECS) является модель экспериментальных животных электросудорожной терапии для тяжелой депрессии. ECS глобально стимулирует активность в гиппокампе, приводит к synaptogenesis и синаптической пластичности. Здесь мы описываем методы для ECS индукции в крыс и внутриклеточных фракционирование их гиппокампах захват индуцированные изменения в синаптических белков.

Аннотация

Электросудорожная захват (ECS) является модель экспериментальных животных электросудорожной терапии, наиболее эффективное лечение для тяжелой депрессии. ECS индуцирует обобщенных тоник клонические припадки с низкой смертности и нейрональных смерти и представляет собой широко используется модель экрана анти-эпилептических наркотиков. Здесь мы описываем метод индукции ECS в которой краткий 55-мА ток поставляется для 0.5 s для мужчин крысы 200-250 г веса через электроды клип ухо. Такие двусторонние стимуляции производства стадии 4-5 клонические судороги, которые длились около 10 s. После прекращения острой или хронической ECS большинство крыс, восстановлены быть поведенчески неотличим от липовые «не взятие» крыс. Потому что ECS глобально повышает активность мозга, он также использовался для изучения деятельности зависимые изменения синаптических белков и их воздействие на синаптической силы, используя несколько методов. В частности субцеллюлярные фракционирование постсинаптических плотности (PSD) в сочетании с Западный blotting позволяет для количественного определения обилие синаптических белков в этой специализированной структуре синаптических. В отличие от предыдущих метод фракционирования, который требует большого количества грызунов мозги опишем здесь мелких фракционирование метод, чтобы изолировать PSD от гиппокампах одной крысы, без сахарозы градиентного центрифугирования. С помощью этого метода, мы показывают, что изолированные фракции PSD содержит белки постсинаптической мембраны, включая PSD95, GluN2B и GluA2. Пресинаптический маркер synaptophysin и растворимых цитоплазматический белок α-тубулина были исключены из PSD дроби, демонстрируя успешное PSD изоляции. Кроме того хронические ECS уменьшилось GluN2B выражение в PSD, указав, что наши мелкие PSD фракционирование метод может применяться для обнаружения изменений в гиппокампа PSD белки от одного крыс после генетических, фармакологическим или механических обработок .

Введение

Электросудорожной терапии был использован для лечения пациентов с основными депрессивных расстройств, включая лекарственно-тяжелой депрессии, биполярной депрессии, болезни Паркинсона и шизофрении1,2. В этой терапии захват генерируется электрические стимула доставляется глава наркотизированных пациентов через надчерепное электроды1,2,3. Повторяющихся администрация ECS была клинически полезным лекарственно-депрессивные расстройства1,2,3. Однако точный механизм, лежащий в основе долгосрочной эффективности антидепрессивный эффект в организме человека остается недостижимой. ECS животной модели электросудорожной терапии и широко используется расследовать его терапевтический механизм. Грызунов острый ECS и лечение хронических ECS поощрять взрослых нейрогенез в гиппокампах и реорганизовать нейронной сети4,5, который может вносить усовершенствования в когнитивной гибкости. Кроме того глобального повышения активности мозга, ECS изменяет обилие стенограммы, такие, как мозг производные нейротропные фактор6и несколько белков, включая Метаботропные глутамата приемного устройства 17 и N-метил D-аспартат (NMDA) типа глутамата рецептор субблоков7. Эти изменения участвуют в посреднических долгосрочные изменения числа синапсов, структуры и силы в гиппокампе7,8,9.

В моделях ECS электрической стимуляции доставляется грызунов через stereotaxically имплантированных электродов, роговицы электродов или уха электроды вызывают обобщенных тонизирующий клонические судороги10,11. Стереотаксического имплантация электродов предполагает хирургии и требует значительного времени для улучшения экспериментатора хирургических навыков для сведения к минимуму ущерба. Менее инвазивные роговицы электродов может вызвать сухость и роговицы ссадины и требует анестезии. Использование электродов клип ухо обходит эти ограничения, потому что они могут быть использованы на грызунов без хирургического вмешательства или анестезии и вызвать минимальной травмы. Действительно мы обнаружили, что текущий доставлены к просыпаются крыс через электроды клип ухо надежно индуцирует стадии 4-5 тонизирующий клонические судороги и изменяет синаптических белков в их гиппокампах10.

Для изучения ECS-индуцированных обилием синаптических белков в регионах конкретных мозга грызунов, важно выбрать экспериментальные методы, которые являются наиболее подходящими для их обнаружения и количественного определения. Субцеллюлярные фракционирование головного мозга позволяет для сырой изоляции растворимые белки цитозольной; Мембранные белки; органеллы границы белков; и даже белки в специальных внутриклеточных структур, таких как PSD12,,1314. PSD — густой и хорошо организованной субцеллюлярные домен в нейроны, в которых сконцентрированы на и вблизи постсинаптической мембраны12,13,15синаптических белков. Изоляция PSD является полезным для изучения синаптических белков обогащенного в PSD, поскольку динамические изменения в изобилии и функции рецепторов постсинаптической глутамата, леса белков и белков трансдукции сигнала в PSD12 , 15 , 16 , 17 коррелируют с синаптической пластичности и synaptopathy наблюдается в нескольких неврологических расстройств17,18. Предыдущих субцеллюлярные фракционирование метод, используемый для очистки PSD участие изоляции моющих средств нерастворимые дроби от сырой мембранные часть мозга, дифференциального центрифугирования сахарозы градиенты14, 19. Основная проблема с этим традиционным методом является, что она требует большого количества грызунов мозги14,19. Подготовка 10-20 грызунов изолировать PSD фракция за лечение требует обширных стоимости и времени инвестиций и не является практически осуществимым, если есть много лечения.

Чтобы преодолеть эту проблему, мы адаптировали более простой метод, который непосредственно изолирует PSD фракции, без сахарозы градиентного центрифугирования20,21и внес в него должна применяться к PSD изоляции от гиппокампах одного крыса мозг. Наши мелкие метод фракционирования PSD дает о 30-50 мкг PSD белков из 2 гиппокампах, достаточных для использования в нескольких биохимических анализов, включая иммунопреципитации и Западный blotting. Западный blotting демонстрирует успех нашего метода для изоляции PSD, раскрывая обогащения постсинаптических плотность белка 95 (PSD-95) и исключение Пресинаптический маркер synaptophysin и растворимых цитоплазматический белок α-тубулина. Наши ECS индукции и мелких PSD фракционирование методы легко приспосабливаются в другие регионы грызунов мозга и относительно простой и надежный способ для оценки воздействия ECS на экспрессию белков PSD.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все экспериментальные процедуры, включая животных темы были одобрены институциональный уход животных и использования Комитетом в Университете Иллинойса в Урбана-Шампейн.

1. поддержание колонии крыс

  1. Порода крысах Sprague-Dawley (см. Таблицу материалы) и сохранять их в стандартных условиях с 12-h свето тени цикла и ad libitum доступ к продовольствию и воде.
  2. Отучить потомства крыс в день послеродового (P) 28 и их группами по 2-4 мужского или женского пола однопометники.
  3. Марк хвосты самцов крыс с токсичными постоянного черным маркером для идентификации.
  4. Вес самцов крыс 3 раза в неделю и записывать их особи.

2. Подготовка машины ECS

  1. В 7:30 утра продезинфицируйте скамейке в зале животных подготовки и место ECS машина (генератор импульсов) на скамейке.
  2. Место отдельные мужчина крыса, весом 200-250 г в чистой, пустой клетке с крышкой. Повторите это действие для всех самцов крыс следует относиться с ECS индукции. Пусть крысы приучать за 30 мин.
  3. В то время как крысы habituating в их клетках, установить генератор импульсов для ECS индукции частоты 100 импульсов в секунду, импульса 0,5 мс, шок, продолжительностью 0,5 s и тока 55 мА (рис. 1А).
  4. Подготовьте генератор импульсов, нажав кнопку «RESET» и обеспечения того, что горит кнопку «Готово». Убедитесь, что уха клипы не прикреплены к генератор импульсов и затем нажмите кнопку «Шок» на несколько секунд.
    Примечание: на данный момент, генератор импульсов готов к индукции ECS.
  5. Подключите уха клипы в генератор импульсов.

3. индукция острого ECS

: Примечание Рисунок 1B, верхней панели.

  1. Намочите уха клипы с стерильного физиологического раствора и убедитесь, что они являются насыщенными.
  2. Влажные крыса уши с стерильного физиологического раствора, завернув их в марлей, смоченной соленой. Как только они влажные, удалите марлю.
  3. Присоедините один клип за ухо, положение за полосе главной хряща.
  4. Подтверждение на машине ECS что установлен верно цикла; Если нет, появится сообщение об ошибке или чтение «1» на компьютере.
  5. Носите толстые, неметаллических перчатку. Удерживая крысы аккуратно в перчатке, нажмите на кнопку «Шок» на несколько секунд и медленно отпустите ручку на крыса наблюдать за захват. Для Шам «не захват» (NS) управления, одинаково обрабатывать крыса, но не доставить ток.
  6. Отсоедините уха клипы как пассивные начинается и записывать захват поведение согласно пересмотренной Расин шкалы22 , включающий «рот и лицевого движения» (этап 1), «кивал головой» (этап 2), «передних конечностей Клонус» (этап 3), «воспитание с передних конечностей Клонус» (этап 4) и «воспитания и падения с передних конечностей Клонус» (этап 5). Захват должен длиться приблизительно 10 s; рекорд продолжительности захвата с помощью таймера.
  7. После прекращения захвата вернуть его домой клетке крыса. Контролировать крыс для еще 5 минут чтобы убедиться восстановления крысы от изъятия. Держите его в клетке поодиночке здании и вернуть клетку в комнате восстановления.
  8. Повторите ECS индукции на следующий крыса.
  9. Контролировать крыс на протяжении оставшейся в день и по крайней мере один раз утром и один раз в день следующий день до тех пор, пока они являются умерщвлено для экспериментов.
    Примечание: Метод индукции ECS может привести к клинические признаки как случайный побочный эффект, который требует внимания. Например протокол индукции ECS может вызвать судороги, которые длятся дольше, чем 15 s и причиной ненужных бедствия для крыс. В этом случае прекратить захват с помощью диазепама (10 мг/кг, и.п.) или Пентобарбитал (25-30 мг/кг, и.п.). Если крысы респираторного дистресса или серьезные поведенческие аномалии, после прекращения захвата, усыпить их вдыханием двуокиси углерода, следуют обезглавливание.

4. индукция хронических ECS

Примечание: См. рис. 1Б, нижней панели.

  1. Вызвать одну ECS в день в то же время в первой половине дня, как описано в шагах 1-3, выше, за семь дней подряд.
  2. Монитор, крысы два раза в день после их возвращения в свои дома клетки.

5. гомогенизации и фракционирования гиппокампах крыса

Примечание: Смотрите Рисунок 2.

  1. Подготовьте свежие гомогенизации буфера (решение A), который содержит Пирофосфат натрия 5 мм, 1 мм ЭДТА, сахароза 320 мм, 10 мм HEPES рН 7,4, 200 Нм okadaic кислоты и ингибиторов протеазы. Фильтр стерилизуйте буфер с помощью фильтров с размером пор 0,22 мкм для вакуумной фильтрации и поместите его на льду.
  2. В данный момент точку после ECS острой или хронической ECS (рис. 1), усыпить крысы на CO2 ингаляции 5-10 мин, следуют обезглавливание с помощью гильотины.
  3. Удаление мозга и вскрыть гиппокампах на металлической пластине, размещены на льду, как описано ранее,23,24.
  4. Место два гиппокампах от одной крысы на 30-мм тканевой культуры блюдо и размельчите их на мелкие кусочки с помощью ножниц.
  5. Передать фарш гиппокампах ручной стекла гомогенизатор, с помощью пипетки 1 мл и добавьте 1 mL ледяной гомогенизации буфера (решение A, шаг 5.1). Вставьте круглый пестиком в гомогенизатор стекла. Хотя стекло гомогенизатор на льду, мягко и постепенно удар вверх и вниз на пестик 10 - 15 раз за 1 мин, пока исчезают мелкие кусочки ткани, гиппокампа.
  6. Передача огневки до 1,7 мл microcentrifuge с помощью пипетки 1 мл и центрифуги огневки на 800 x g 10 мин при 4 ° C для разделения шпагу супернатант (S1 фракция) от Пелле, содержащих нерастворимые ткани и ядер (P1 дробь). Передача 50 мкл и 950 мкл S1 дроби для двух отдельных, новый 1,7 мл microcentrifuge трубок с помощью пипетки 1 мл и хранить эти трубы на льду. Сохраните P1 фракция гранул на льду.
  7. Центрифуга для S1 дроби (950 мкл) для 10 мин в 13800 x g и 4 ° C для разделения супернатант (S2 фракция), обогащенный цитозольной растворимые белки, и Пелле (P2 фракция), обогащенный с белками мембраны привязкой, включая синаптосомальных белков. Передать новые microcentrifuge 1,7 мл с помощью пипетки 1 мл S2 дроби и хранить его на льду.
  8. Ресуспензируйте Пелле (P2 фракция) в 498 мкл ледяной очищенной воды с помощью пипетки 1 мл. 2 мкл 1 М HEPES (рН 7,4) с помощью пипетки 20 мкл для достижения конечной концентрации 4 мм HEPES (рН 7,4). Инкубируйте на 4 ° C с агитации за 30 мин магазина ресуспензированы фракция P2 на льду.
  9. Определите концентрацию белка S1, S2 и P2 фракций, с использованием пробирного BCA. Добавьте 50 мм HEPES (рН 7,4) для каждой фракции для достижения 1 мг/мл, концентрация и хранить при температуре-80 ° C до использования, или обработать P2 фракция изолировать PSD.

6. изоляция PSD от сырой мембранных белков (P2) фракция

  1. Центрифуга P2 дроби (500 мкл) для 20 минут 25 000 x g и 4 ° C для разделения лизированных супернатант (LS2 фракция) и лизированных Пелле (LP1 дробь). Передать новой microcentrifuge 1,7 мл трубки с помощью пипетки 1 мл LS2 дроби и хранить его на льду.
  2. Ресуспензируйте LP1 Пелле в 250 мкл 50 мм HEPES (рН 7,4), смешанного с 250 мкл 1% стирального порошка в 1 x PBS буфер с помощью пипетки 1 мл. Инкубируйте на 4 ° C с нежным агитации за 15 мин.
  3. Центрифуга ресуспензированы LP1 Пелле за 3 ч при 25 000 x g и 4 ° C для разделения супернатант (фракция-PSD) от Пелле (PSD фракция). Удалить супернатант microcentrifuge 1.7-мл пробирку и Ресуспензируйте Пелле PSD в 100 мкл 50 мм HEPES (рН 7,4) с помощью пипетки 200 мкл.
  4. Определите концентрацию белка LS2, -PSD и PSD фракций с использованием пробирного BCA. Добавьте 50 мм HEPES (рН 7,4) для каждой фракции для достижения 1 мг/мл, концентрация и хранить при температуре-80 ° C до использования.
    Примечание: Все решения, используемые в шагах 5-6 (то есть, решение, HEPES буфер и PBS буфер) следует с очищенной водой бесплатно ионных и органических загрязняющих веществ и твердых частиц.

7. западный Blotting

  1. Оттепель каждый белковые фракции на льду. Передача 12 мкл каждой фракции (S2, P2 и PSD в 1 мг/мл) для новой microcentrifuge 1,7 мл трубки с помощью пипетки 20 мкл.
  2. 3 мкл буфера выборки SDS 5 x и Инкубируйте на 75 ° C за 30 минут на водяной бане. Прохладный образца до комнатной температуры (RT).
  3. Загрузка 10 мкл пример белка в каждой скважине 4-20% градиента 15-Ну гребень гель полиакриламида SDS электрофореза (SDS-PAGE) гель с помощью пипетки 20 мкл. Запустите геля SDS-PAGE аппарат и на 80-100 V в управлении буфера (25 мм трис, 190 мм глицин и 0.1% SDS; рН 8.3).
    Примечание: Каждый гель должен содержать образцы протеина от крыс NS и ECS крыс в разное время точках после острой или хронической ECS.
  4. Передача белки от SDS-PAGE гель поливинил дифторид (PVDF) мембраны в передаче аппарат на 25-30 V (60 мА) для 9-12 ч в буфер передачи (25 мм трис, 190 мм глицин и 20% метанола; рН 8.3).
  5. Удаление PVDF мембрану из аппарата передачи и промойте его в трис буфер солевой раствор (TBS) за 5 мин на многоцелевой ротатор на RT.
  6. Блокировать мембрану в 5% молока и 0.1% Tween-20 в TBS 1 ч. Инкубируйте в первичных антител (Таблица 1) в Отмывающий буфер (молоко 1% и 0,1% Tween-20 в TBS) на ночь на многоцелевой ротатор на 4 ° C (см. Таблицу материалов для разведения).
  7. Вымойте мембраны 4 раза по 10 мин в буфере мыть и проинкубируйте его с пероксидазой хрена (ПХ)-конъюгированных вторичные антитела в отмывающего буфера для 1 h на многоцелевой ротатор на RT.
  8. Вымойте мембраны 4 раза по 10 мин в мыть буфера и затем с TBS за 5 мин.
  9. Проинкубируйте мембрану с расширенной chemifluorescence субстрата за 1 мин и подвергать рентгеновской пленки. Разработка открытых фильм с процессором фильм.

8. Количественная оценка западных помарок

  1. Сканирования в западной помарки в виде файла TIFF и сохраните этот файл на компьютере.
  2. Откройте файл западной помарки в программе ImageJ как изображение в градациях серого, под «Файл», «Открыть изображение,» стрелка вправо «серого.»
  3. Выберем инструмент Прямоугольное выделение панели ImageJ и нарисуйте прямоугольник, который охватывает один иммуноблоттинга полоса протеина интереса.
  4. Под «Анализировать,» хит «Мера» для получения области и средняя плотность выбранной группы.
  5. Переместите прямоугольник в область фона не изменяя его размер и форму. Повторите шаг 8.4 области и средней плотности фона.
  6. Вычтите значение средней плотности фон полосы от того из группы западной помарки, давая фон вычитается группы плотность протеина интереса.
  7. Повторите шаги 8.2-8,6 для всех полос иммуноблоттинга интерес.
  8. Разделите фон вычитается группы плотность протеина интереса, фон вычитается группы плотности продукта гена хозяйствования, например α-тубулина; Этот шаг дает нормализованное значение протеина интереса.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Подробная процедура с использованием представленные здесь, один электрическим током (55 мА, 100 импульсов в секунду для 0.5 s) доставлено через ухо клип электроды индуцированной неповторяющегося стадии 4-5 тонизирующий клонические судороги у крыс (рис. 1A-B). Всего 8 крыс получил острый ECS индукции и отображается стадии 4-5 тонизирующий клонические судороги. Судороги длилось около 10 s и все крысы, восстановлена в течение 1-2 мин прекращения...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы описываем метод индукции ECS крыс, который вызывает глобальные стимуляции активности нейронов в их гиппокампах. ECS — животное модель электросудорожной терапии, которая клинически используется для лечения наркотиков огнеупорных депрессивных расстройств в людей1,2,3. Несмотря на применение электросудорожной терапии для лечения тяжелой депрессии точный механизм остается неясным. Потому что ECS индуцирует depressant-как фу...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Благодарности

Авторы благодарят д-р Эрик C. Bolton за предоставленную нам возможность использовать его центрифуги для фракционирования и д-р Грэм х. Diering в лаборатории д-р Ричард л Huganir в университете Джона Хопкинса для предоставления нам с мелким протоколом для фракционирования PSD.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Крыса Spargue-DawleyCharles River LaboratoriesECS поставляет
импульсный генераторUgo Bsile, Комерио, Италия57800ECS поставляет
систему очистки воды MilliQEMD MilliporeZ00Q0VWWСубклеточное фракционирование
расходует SucroseEm scienceSX 1075-3Субклеточное
фракционированиеNa4O7P2SIGMA-ALDRICH221368Субклеточное фракционирование
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)SIGMA-ALDRICHE9884Субклеточное фракционирование
HEPESSIGMA-ALDRICHH0527Субклеточное фракционирование
Окадаиновая кислотаTOCRIS1136Поставки субклеточного фракционирования
Ингибитор протеазы HaltThermo Scientific78429Расходные материалы для субклеточного фракционирования
NaVO3SIGMA-ALDRICH72060Расходные материалы для субклеточного фракционирования
EMD Millipore Sterito Стерильные вакуумные бутылочные фильтрыFisher ScientificSCGPS05REСубклеточное фракционирование Iris
ScissorsWPI (World Precision Приборы)500216-GСубклеточное фракционирование Расходные материалы
30 мм Чашка для культуры тканейFisher Scientific08-772BРасходные материалы для субклеточного фракционирования
Стеклянный гомогенизатор и тефлоновый пестикVWR89026-384Субклеточное фракционирование
Микроцентрифужная пробирка объемом 1,7 млDENVILLE SCIENTIFIC INC. C2170 (1001002)Субклеточное фракционирование поставляет
центрифугу Sorvall Legend XT/XF Расходные материалы для субклеточного фракционированияThermo Fisher75004521
Pierce BCA Protein Assay Reagent A, 500 млThermo Fisher#23228Western blot supplies
Pierce BCA Protein Assay Reagent B, 25 млThermo Fisher#1859078Western blot supplies
SDS-полиакриламидный гель (SDS-PAGE)BIO-RADWestern blot supplies
Running БуферСделано в лабораторииВестерн Блот
Вертикальная электрофорсическая ячейка Mini-PROTEAN Tetra для мини-сборных гелей, 4-гельBIO-RAD#1658004Western blot поставляет
мембрану из поливинилдифторида (PVDF) MiliporeIPVH00010Western blot supplies
Transfer BufferMade in labblot supplies. 
Трис-базаFisher ScientificBP152-1Вестерн блот
ГлицинFisher ScientificBP381-5Вестерн блот
Додецилсульфат натрияSIGMA-ALDRICH436143Вестерн блот
Метанол Fisher ScientificA454-4Western blot поставляет
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500моющее средство для изоляции PSD
Mini Trans-Blot Module BIO-RAD#1703935Western blot поставляет
обезжиренное быстрорастворимое сухое молокоОтличная ценностьWestern blot supplies
Многоцелевой ротатор Thermo ScientificModel-2314Western Blot поставляет
авторадиографическую пленку Hyblot CLDENVILLE SCIENTIFIC INC. E3018 (1001365)Вестерн-блоттинг поставляет
усиленный хемифлуоресцентный субстрат Thermo Scientific32106Western blot поставляет
пленочный процессор Konica SRX-101AKONICA MINOLTASRX-101AWestern blot supplies
Name of Antibody
PSD-95Cell Signaling#2507Разведение антител = 1:500 - 1,000, время = 9 - 12 ч, температура реакции = 4 ° c, вид хозяина = передача сигналов кроличьих
синаптофизиновыхклеток#4329Разведение антител = 1:500 - 1,000, время = 9 - 12 ч, температура реакции = 4 ° C, Вид хозяина = Кролик
альфа-тубулинSantacruzSC-5286Разведение антител = 1:500 - 1,000, время = 9 - 12 ч, Температура реакции = 4 °°; c, вид хозяина = мышиный
GluN2BNeuromab75-097Разведение антител = 1:500 - 1,000, время = 9 - 12 ч, температура реакции = 4 °°; c, вид хозяина = мышиный
GluA2Sigma-aldrichSab 4501295разведение антител = 1:500 - 1,000, время = 9 - 12 ч, температура реакции = 4 ° c, вид хозяина = кролик
STEPSantacruzSC-23892Разведение антител = 1:200 - 500, время = 9 - 12 ч, температура реакции = 4 ° C, Вид хозяина = Мышиный
Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoReserch laboratory715-035-150Разведение антител = 1:2,000-5,000, время = 1 ч, Температура реакции = RT, Вид хозяина = Donkey
Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoReserch laboratory711-035-152Разведение антител = 1:2,000-5,000, время = 1 ч, Температура реакции = RT, Вид хозяина = Осел
#4561086S . Western

Ссылки

  1. Dierckx, B., Heijnen, W. T., van den Broek, W. W., Birkenhager, T. K. Efficacy of electroconvulsive therapy in bipolar versus unipolar major depression: a meta-analysis. Bipolar Disord. 14 (2), 146-150 (2012).
  2. McClintock, S. M., et al. Multifactorial determinants of the neurocognitive effects of electroconvulsive therapy. J ECT. 30 (2), 165-176 (2014).
  3. Jelovac, A., Kolshus, E., McLoughlin, D. M. Relapse following successful electroconvulsive therapy for major depression: a meta-analysis. Neuropsychopharmacology. 38 (12), 2467-2474 (2013).
  4. Inta, D., et al. Electroconvulsive therapy induces neurogenesis in frontal rat brain areas. PLoS One. 8 (7), 69869(2013).
  5. Segi-Nishida, E., Warner-Schmidt, J. L., Duman, R. S. Electroconvulsive seizure and VEGF increase the proliferation of neural stem-like cells in rat hippocampus. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (32), 11352-11357 (2008).
  6. Zetterstrom, T. S., Pei, Q., Grahame-Smith, D. G. Repeated electroconvulsive shock extends the duration of enhanced gene expression for BDNF in rat brain compared with a single administration. Brain Res Mol Brain Res. 57 (1), 106-110 (1998).
  7. Altar, C. A., et al. Electroconvulsive seizures regulate gene expression of distinct neurotrophic signaling pathways. J Neurosci. 24 (11), 2667-2677 (2004).
  8. Ploski, J. E., Newton, S. S., Duman, R. S. Electroconvulsive seizure-induced gene expression profile of the hippocampus dentate gyrus granule cell layer. J Neurochem. 99 (4), 1122-1132 (2006).
  9. Pusalkar, M., et al. Acute and Chronic Electroconvulsive Seizures (ECS) Differentially Regulate the Expression of Epigenetic Machinery in the Adult Rat Hippocampus. Int J Neuropsychopharmacol. 19 (9), (2016).
  10. Jang, S. S., Royston, S. E., Lee, G., Wang, S., Chung, H. J. Seizure-Induced Regulations of Amyloid-beta, STEP61, and STEP61 Substrates Involved in Hippocampal Synaptic Plasticity. Neural Plast. 2016 (2123748), 1-13 (2016).
  11. Limoa, E., et al. Electroconvulsive shock attenuated microgliosis and astrogliosis in the hippocampus and ameliorated schizophrenia-like behavior of Gunn rat. J Neuroinflammation. 13 (1), 230(2016).
  12. Vinade, L., et al. Affinity purification of PSD-95-containing postsynaptic complexes. J Neurochem. 87 (5), 1255-1261 (2003).
  13. Dosemeci, A., Tao-Cheng, J. H., Vinade, L., Jaffe, H. Preparation of postsynaptic density fraction from hippocampal slices and proteomic analysis. Biochem Biophys Res Commun. 339 (2), 687-694 (2006).
  14. Westmark, P. R., Westmark, C. J., Jeevananthan, A., Malter, J. S. Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient. J Vis Exp. (3196), e1-e9 (2011).
  15. Sheng, M. Molecular organization of the postsynaptic specialization. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (13), 7058-7061 (2001).
  16. Sheng, M., Hoogenraad, C. C. The postsynaptic architecture of excitatory synapses: a more quantitative view. Annu Rev Biochem. 76, 823-847 (2007).
  17. Ehrlich, I., Malinow, R. Postsynaptic density 95 controls AMPA receptor incorporation during long-term potentiation and experience-driven synaptic plasticity. J Neurosci. 24 (4), 916-927 (2004).
  18. Schnell, E., et al. Direct interactions between PSD-95 and stargazin control synaptic AMPA receptor number. Proc Natl Acad Sci USA. 99 (21), 13902-13907 (2002).
  19. Bermejo, M. K., Milenkovic, M., Salahpour, A., Ramsey, A. J. Preparation of synaptic plasma membrane and postsynaptic density proteins using a discontinuous sucrose gradient. J Vis Exp. (91), e51896(2014).
  20. Tan, H. L., Queenan, B. N., Huganir, R. L. GRIP1 is required for homeostatic regulation of AMPAR trafficking. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (32), 10026-10031 (2015).
  21. Diering, G. H., Gustina, A. S., Huganir, R. L. PKA-GluA1 coupling via AKAP5 controls AMPA receptor phosphorylation and cell-surface targeting during bidirectional homeostatic plasticity. Neuron. 84 (4), 790-805 (2014).
  22. Luttjohann, A., Fabene, P. F., van Luijtelaar, G. A revised Racine's scale for PTZ-induced seizures in rats. Physiol Behav. 98 (5), 579-586 (2009).
  23. Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. -F., Chang, R. C. -C. Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region. J Vis Exp. (7), e269(2007).
  24. Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse. J Vis Exp. (1543), e1-e6 (2009).
  25. Kim, M. J., et al. Synaptic accumulation of PSD-95 and synaptic function regulated by phosphorylation of serine-295 of PSD-95. Neuron. 56 (3), 488-502 (2007).
  26. Won, S., Incontro, S., Nicoll, R. A., Roche, K. W. PSD-95 stabilizes NMDA receptors by inducing the degradation of STEP61. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (32), 4736-4744 (2016).
  27. Qu, L., Akbergenova, Y., Hu, Y., Schikorski, T. Synapse-to-synapse variation in mean synaptic vesicle size and its relationship with synaptic morphology and function. J Comp Neurol. 514 (4), 343-352 (2009).
  28. Delaney, A. J., Sedlak, P. L., Autuori, E., Power, J. M., Sah, P. Synaptic NMDA receptors in basolateral amygdala principal neurons are triheteromeric proteins: physiological role of GluN2B subunits. J Neurophysiol. 109 (5), 1391-1402 (2013).
  29. Zhang, Y., et al. The tyrosine phosphatase STEP mediates AMPA receptor endocytosis after metabotropic glutamate receptor stimulation. J Neurosci. 28 (42), 10561-10566 (2008).
  30. Braithwaite, S. P., et al. Regulation of NMDA receptor trafficking and function by striatal-enriched tyrosine phosphatase (STEP). Eur J Neurosci. 23 (11), 2847-2856 (2006).
  31. Paul, S., Nairn, A. C., Wang, P., Lombroso, P. J. NMDA-mediated activation of the tyrosine phosphatase STEP regulates the duration of ERK signaling. Nat Neurosci. 6 (1), 34-42 (2003).
  32. Malberg, J. E., Eisch, A. J., Nestler, E. J., Duman, R. S. Chronic antidepressant treatment increases neurogenesis in adult rat hippocampus. J Neurosci. 20 (24), 9104-9110 (2000).
  33. Kandratavicius, L., et al. Animal models of epilepsy: use and limitations. Neuropsychiatr Dis Treat. 10, 1693-1705 (2014).
  34. Loscher, W. Animal models of epilepsy for the development of antiepileptogenic and disease-modifying drugs. A comparison of the pharmacology of kindling and post-status epilepticus models of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Res. 50 (1-2), 105-123 (2002).
  35. Stromgren, L. S., Juul-Jensen, P. EEG in unilateral and bilateral electroconvulsive therapy. Acta Psychiatr Scand. 51 (5), 340-360 (1975).
  36. Abrams, R., Volavka, J., Fink, M. EEG seizure patterns during multiple unilateral and bilateral ECT. Compr Psychiatry. 14 (1), 25-28 (1973).
  37. Duman, R. S., Vaidya, V. A. Molecular and cellular actions of chronic electroconvulsive seizures. J ECT. 14 (3), 181-193 (1998).
  38. Andre, V., Ferrandon, A., Marescaux, C., Nehlig, A. Electroshocks delay seizures and subsequent epileptogenesis but do not prevent neuronal damage in the lithium-pilocarpine model of epilepsy. Epilepsy Res. 42 (1), 7-22 (2000).
  39. Sinclair, D., et al. Effects of sex and DTNBP1 (dysbindin) null gene mutation on the developmental GluN2B-GluN2A switch in the mouse cortex and hippocampus. J Neurodev Disord. 8 (14), 1-19 (2016).
  40. Sakaida, M., et al. Electroconvulsive seizure-induced changes in gene expression in the mouse hypothalamic paraventricular nucleus. J Psychopharmacol. 27 (11), 1058-1069 (2013).
  41. Hu, J. H., et al. Homeostatic scaling requires group I mGluR activation mediated by Homer1a. Neuron. 68 (6), 1128-1142 (2010).
  42. Blackstone, C. D., et al. Biochemical characterization and localization of a non-N-methyl-D-aspartate glutamate receptor in rat brain. J Neurochem. 58 (3), 1118-1126 (1992).
  43. Blackstone, C. D., Levey, A. I., Martin, L. J., Price, D. L., Huganir, R. L. Immunological detection of glutamate receptor subtypes in human central nervous system. Ann Neurol. 31 (6), 680-683 (1992).
  44. Lau, L. F., et al. Interaction of the N-methyl-D-aspartate receptor complex with a novel synapse-associated protein, SAP102. J Biol Chem. 271 (35), 21622-21628 (1996).
  45. Braithwaite, S. P., Paul, S., Nairn, A. C., Lombroso, P. J. Synaptic plasticity: one STEP at a time. Trends Neurosci. 29 (8), 452-458 (2006).
  46. Jang, S. S., et al. Regulation of STEP61 and tyrosine-phosphorylation of NMDA and AMPA receptors during homeostatic synaptic plasticity. Mol Brain. 8 (1), 55(2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Электросудорожный припадокфракционирование гиппокампавестерн-блоттинганализ синаптических белковэкспрессия GluN2Bопределение PSD95маломасштабное фракционированиевыделение гиппокампаиндуцирование судорог
Электросудорожная изъятий в крыс и фракционирование их гиппокампах для изучения захват индуцированные изменения в постсинаптической плотность белки
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.