Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Intrasplenic трансплантация гепатоцитов после частичной гепатектомии в Нод. ТКИД мышей

14K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56018

⸱

10 февраля 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1National Institute of Immunology

В этой статье

Краткое содержание

Мы описали протокол для выполнения частичной гепатектомии (ФСК) и трансплантации клеток через селезенку в Нод. ТКИД (НОД. CB17-Prkdcscid/j) мышах. В этом протоколе разрез делается разоблачить и иссечения левой доли печени, последовал еще один разрез intrasplenic трансплантации клеток.

Аннотация

Частичной гепатектомии является универсальным и воспроизводимый метод для изучения регенерации печени и эффект терапии на основе клеток при различных патологических состояниях. Частичной гепатектомии также облегчает увеличение приживления и распространение пересаженные клетки путем ускорения неоваскуляризации и миграции клеток к печени. Здесь мы опишем простой протокол для выполнения 30% гепатектомии и трансплантации клеток в селезенке-ожирением диабетом/тяжелой объединены иммунодефицитных КИВНУЛ. ТКИД (НОД. CB17-Prkdcscid/j) мыши.

В этой процедуре две небольшие надрезы. Первый разрез разоблачить и иссечения левой доли печени, и еще один небольшой надрез подвергать intrasplenic трансплантации клеток селезенки. Эта процедура не требует каких-либо специализированных хирургических навыков, и она может быть завершена в течение 5-7 минут с меньше стресса и боли, быстрого восстановления и лучше выживания. Мы продемонстрировали трансплантации гепатоцитов, изолированных от Зеленый флуоресцирующий белок (КГВ), выражая мыши (трансгенные C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J), а также гепатоцитов как клетки человеческого происхождения (NeoHep) в частично hepatectomized КИВНУЛ. ТКИД мышей.

Введение

В настоящее время гепатоцит трансплантации предлагается в качестве альтернативы весь трансплантации для лечения пациентов, имеющих серьезные расстройства печени. Считается, что он может преодолеть пациентам весь орган трансплантации1. Помимо аллогенной гепатоцитов2,3 ксеногенные гепатоцитов и гепатоцитов, производный от стволовых клеток4 изучаются также в животных моделях. В этом контексте, головка самонаведения и приживления потенциал пересаженные клетки в получателя является важным критерием для основе клеточной терапии в острой печеночной недостаточности (ОСН).

Для расследования трансплантации гепатоцитов или гепатоцито подобных клеток5, осн создается в животной модели либо хирургического6 или фармакологических7 процедуры по пересадке клеток. Чтобы сделать AHF животной модели фармакологических реагентов, многие гепатотоксинов d-galactosamine8, ацетаминофен9, тетрахлорид углерода10, thioacetamide11, конканавалина А12, липополисахарида13 , и т.д., были использованы. Из этого списка каждый реагент генерирует уникальный набор функций для осн, но к сожалению без единого реагент имитирует человеческое осн. Кроме того ОСН, вызванных гепатотоксинов занимает длительное время, которое ставит животных под хронический стресс, и трудно получить воспроизводимые результаты.

С другой стороны хирургическая процедура частичной гепатектомии (ФСК) это зависит от мастерства, и воспроизводимые результаты легко получить после разработки необходимых навыков. Чтобы побудить AHF путем хирургического вмешательства только, требуется резекция печени более чем на 70%; Однако меньше, чем 70% гепатектомии все еще могут быть использованы для исследования приживления и распространением пересаженные клетки в печени для анализа их терапевтический потенциал во время повреждения печени14. Трансплантация гепатоцитов были гепатектомии выполненных пост через брюшины15, хвост вен16, печеночная Вена17или селезенки18. В настоящее время печеночная Вена инфузии и intrasplenic трансплантация гепатоцитов являются предпочтительным процедуры, как они проще воспроизвести.

В этой статье мы описали процедуру для 30% частичной гепатектомии в Нод. ТКИД (НОД. CB17-Prkdcscid/J) мышах, в которых вырезана левой доли печени. Это сопровождается трансплантации 0,2 млн GFP-выражая гепатоцитов мыши (C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J), а также человеческого происхождения19 NeoHep в селезенке. Эта процедура приводит к приживления пересаженных клеток в печени. Эта процедура является наименее инвазивных и минимально болезненной технику.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Процедуры, представленные в настоящем протоколе были утверждены Комитетом по этике институциональных животных Национального Института иммунологии, Нью-Дели. Серийный номер официального утверждения является ИКАЭ № 319/13.

Примечание: Есть отличные ресурсы по общей хирургии процедуры20 и конкретных протоколов для грызунов хирургии21. Для тех, кто делает животных хирургия в первый раз рекомендуется активно заниматься хирургических процедур на чайников перед началом работы на животных.

1. Подготовка

  1. До эксперимента Храните стерильные фосфатный буфер (PBS) или физиологический готовы.
  2. Соберите комплект хирургии, содержащий ножницы, зубчатыми щипцы, щипцы ткани, хлопок, ватные палочки, нитки капроновые и различных микро иглы держатели. Автоклав комплект хирургии. Особое внимание следует использовать, если ослабленным иммунитетом КИВНУЛ. ТКИД мыши включен в протокол.
  3. Выполнение полной экспериментальной процедуры, от подготовки к концу хирургии, в био безопасности класса I кабинета.
  4. Весят КИВНУТЬ. ТКИД мыши 6-8 недель до операции. В этом исследовании используются мышей, веся между 14-18 g.
  5. Бриться верхней центральной и ипохондрик области живота мыши с машинку для стрижки волос. Примените кремы равномерно во всем регионе с помощью шпателя, чтобы полностью удалить обрезанные волосы волосы. Удалите волосы аккуратно с помощью куска влажной стерильной хлопка после 2-5 мин.
  6. Поместите указатель мыши в изофлюрановая камере и разблокировать клапан кислородный баллон. Поддерживать поток кислорода в размере 4 Л/мин и изофлюрановая испарения в 4% побудить анестезии.
    1. Убедитесь, что мышь должным образом наркоз, нежный мыс щипать.
  7. Уложите под него доску хирургии внутри биобезопасности кабинета. Поместите животное на доске, хирургии, что брюшной части мыши вверх и передней части мыши помещается внутри носовой конус, подключен к изофлюрановая и кислорода.
  8. Уменьшить испарение изофлюрановая до 2% и поддерживать его на протяжении хирургической процедуры.
  9. Дезинфекция кожи мыши и стерилизовать его, вытирая с 70% этанол пропитанной стерильным хлопка.

2. хирургическая процедура

  1. Частичной гепатектомии
    1. Сделать поперечный разрез около 1 см в кожу чуть ниже грудины, перпендикулярно мечевидного отростка и параллельно грудную клетку, с помощью прямой операционной ножницы.
    2. Аккуратно отделить кожу, придает с брюшной мышцы слой вблизи области резаная с щипцами или стерильным хлопка смоченной советы для различения кожи и мышц живота слоя. Замочите внутрикожные региона с PBS с помощью стерильных хлопок Советы избежать высыхания.
    3. Разоблачить области левой доли плавно, сделав поперечный разрез через перитонеальный слой непосредственно под Мечевидный. Используйте два хлопка смоченной советы разоблачить и поднимите левой доли печени.
    4. Разместите один из хлопка советы на брюшной стороне вырезать и место еще один подсказки хлопка на стороне диафрагмы. Аккуратно прижмите кончик помещены к диафрагмы и дать толчок раздвижные другие кончиком поднять левой доли печени.
    5. Скольжения капроновая нить с петлю через поднятой левой доли и слайд петли к основанию левой доли рядом рубчика с помощью микро пинцет или хлопка советов. Осторожно надавите нейлон поток цикла на базе левой доли.
    6. Две рулевые капроновая нить, над верхней части левой доли, с использованием микрохирургии иглодержатель и микро щипцами. Сделайте два дополнительных knots на другой стороне.
    7. Проанализируем, обусловленной доли с помощью ножниц. Не пытайтесь резать очень недалеко от потока. В случае, если процедура длится более 5 мин, держите брюшной полости и органов влажным с стерильных PBS, чтобы избежать высыхания из-за потери жидкости.
    8. Шить брюшины с помощью непрерывного сшивающие шовные кетгут 4-0. Впоследствии закройте кожи, разрывные ушивание как можно быстрее.
  2. Трансплантация клеток
    Примечание: Выражая гепатоцитов ГФП были изолированы от трансгенных мышей GFP (C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30 ща/J), согласно процедуре, описанной в ли и др. 22 и Шэнь и др. 23 гепатоцито подобных клеток (NeoHep) человеческого происхождения отличаются от моноциты24 были также использованы для трансплантации. Однако клетки, полученные из любых других источников, могут также использоваться в протоколе.
    1. Приостановить 0,2 миллиона жизнеспособных клеток в около 50 мкл Iscove на изменение Дульбекко среднего (IMDM) и удалить его в шприц 1 мл инсулина ограничен с иглой 30G. Держите шприц холодной, поместив его на льду.
    2. Поместите курсор мыши так, что левый боковой части лица в сторону лица, выполняющего операцию. Определить области селезенки и поперечно рассечения кожи возле ипохондрик региона, следуют короткий разрез через перитонеальный слой только подвергать селезенки.
    3. Аккуратно поднимите селезенки и держать его вне полости с помощью двух PBS увлажнены хлопок советы.
    4. Держите селезенки тщательно кончиками двух хлопка в одной руке и поместите иглу шприца точно вертикальные для селезенки. Слегка проколоть селезенки и нажмите иглы очень медленно внутри; игла не должен получить глубже, чем на 2 мм.
    5. Медленно вдавите поршень шприца для вставки ячеек в селезенке. После пересадки держать иглу шприца стабильной и удалите его медленно из селезенки, чтобы избежать кровотечения или потеря клеток.
    6. После размещения селезенки обратно в брюшной полости с советами хлопка, закройте перитонеальных слоев, непрерывной ушивание с швом кетгут 4-0. Шить кожи скачком с же швом. Избегайте использования рану клипы для закрытия кожи; Вместо этого закройте его, шовный материал 4-0. Клипы рану ограничить естественного движения мыши, и часто клипы становятся рыхлыми и быстро выйти.

3. послеоперационный уход

  1. После закрытия кожи, протрите окрестности участков шов раствором йода (Бетадин) с помощью наконечник стерильным хлопка.
  2. Придать дозы антибиотика Цефотаксим как 600 мг/кг внутрибрюшинно тела вес (обычно Цефотаксим 12 мг в 100 мкл физиологического раствора/мышь) с использованием 1 мл шприц.
  3. Дать ежедневных доз болеутоляющее Мелоксикам 1 мг/кг веса тела (обычно 12 мкг мелоксикам в 100 мкл физиологического раствора/мышь) к животным внутрибрюшинно, на срок до трех дней после операции.
  4. После завершения операции остановить поток газа изофлюрановая и поместите курсор мыши обратно в отдельности вентилируемые клетке.

4. euthanization и характеристики

  1. После экспериментальной конечными точками (1 день и 10 дней после операции) усыпить мышей согласно институциональных животных этических принципов.
  2. Сбор крови, неизлечимо кровотечение животных, проколов глазной терминала сплетения.
  3. Изолируйте сыворотки крови.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Гепатоцитов распространения после частичной гепатектомии 30%: С распространением гепатоцитов в оставшиеся печени после 30% гепатектомии был рассмотрен иммуногистохимический (IHC) пятная для клеток маркер распространения, Ki-67. Гепатектомии один день поста, мышей были умерщвлены, остальных долей печени был вырезан и парафиновых срезах были получены. Разделы были окрашенных антитело Ki-67, следуют маркировки с хреном пероксидазы (ПХ) конъюгированных вторичное антитело. Ди-аминокислоты бензидина (DAB) была...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Частичной гепатектомии является установленным техника для расследования регенерации печени, и сообщается, что чрезмерное гепатектомии имитировать модель осн. Среди животных моделей AHF грызунов, особенно мышей, являются наиболее исследуемой модели. Чтобы получить модель повреждения печени в мышах, до 70% гепатектомии поступили с хорошей выживаемости ставка25,26. Однако в обнаженном виде и других иммунодефицитных мышь, 70% гепатектомии было сообщено как роковой и ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа была поддержана основных грантов, полученных из Департамента биотехнологии, правительство Индии Национальный Институт иммунологии, Нью-Дели. Д-р Бхаттачарджи текущий адрес является Отдел гастроэнтерологии, гепатологии и питания, Детская больница Лос-Анджелеса.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Система газовой анестезииUgo Basile; Италия211000
Весовая машинаGoldtech ; Индийскиеместные закупки
Шкаф биологической безопасности ( Класс I)Kartos international;   ИндияМестные закупки
Триммер для волосPanasonic ;   Япония ER-GY10 
Прямые операционные ножницы с острыми / острыми лезвиямиMajor Surgicals; ИндияМестные закупочные
щипцы с зазубринамиОсновные хирургические средства; ИндияМестные закупки
Микро иглодержатели  прямые и изогнутые мерсийский;   Англия BS-13-8
инсулиновый шприц 1 мл с иглами 30G *5/16Диспо Ван; Индия
1 мл шприц с 26 Г * 1/2 иглойBD; США REF 303060
Нейлоновые нити   мощный; Индия(1-0) Местные закупки
MERSUTURES 4-0 Стерилизованный хирургический игольчатый шовный материалEthicon, Johnson & Johnson, IndiaNW 5047
TRUGUT 76 cm 4-0 рассасывающийся хирургический шовный материалSutures India Pvt. Ltd; ИндияSN 5048Стерилизованный хирургический игольчатый шовный материал Кетгут Хромические
ватные палочкиЧистые тампоны Pvt Ltd ;   ИндияМестные закупки
хирургической ленты3M Индия; Индия1530-1Хирургическая лента с микропорами
MicrotomeHisto-Line Laboratories, ИталияMRS3500
Shandon Cryotome e CryostatThermo Electron Corporation; США
Конфокальный лазерный сканирующий микроскопCarl Zeiss; Германия LSM 510 META
Bright Field MicroscopeOlympus, ЯпонияLX51
Автоматизированный анализаторTulip, Alto Santracruz,India Screen Maaster 3000Биохимический анализатор для функционального теста
печени Flow CytometerBD; США BD FACSverseОценка наличия клеток после трансплантации
Крем для эпиляции Veet Рекитт Бенкизер, Индия
ФОРАНЭбботт; Американскийизофлуран USP 99,9% 
TaximAlKem ; Индияцефотаксим натрия для инъекций
Повидон-Йод раствор Win-Medicare;   индийскийбетадин
параформальдегидHimedia; ИндияGRM 3660
Модифицированная среда Дульбекко (IMDM) Iscove's Lifetechnologies, Thermo Fisher научный; US12200-036
СахарозаСигма; USS0389
Тканеваясакура; US25608-930O.C.T соединение
DAPIHimedia; ИндияMB 097
антиальбумин козий поликлональныйThermo Scientific, Пирс, СШАPA126081
анти-коннексин 32/GJB1 поликлональныйabcam, Великобританияab64609-500
антиGFP кролик поликлональный Санта-Крус биотехнология; USSC 8334
Alexa Fluor 594 ослик анти-козы  Молекулярные зонды, Thermo Fisher Scientific;   USA11058
Alexa Fluor 488 ослик против овец  Молекулярные зонды, Thermo Fisher Scientific;   USA11015
Alexa Fluor 594 курица против кролика  Молекулярные зонды, Thermo Fisher Scientific;   USA21442
Козий антикроличий IgG HRPInvitrogen, Thermo Fisher Scientific; США 65-6120
анти-Ki67 антителоabcam, Великобританияab15580
антиген Unmasking Solution, основание лимонной кислотыVector laboratories, USH-3300
ProLong Diamond antifade mountantLife technologies, Thermo Fisher научный; USP36966
SGOT (ASAT) KITКоралловая клиническая система, Индия
SGPT (ALAT) KITКоралловая клиническая система, Индия
фосфатазы (DEA)Коралловая клиническая система,
раствор гематоксилина,Сигма Майера; СШАMHS16
Эозин Y раствор, спиртСигма; USHT110132
DPX Mountant сигма; US6522
Melonex (обезболивающее)Intas Pharmaceuticals Ltd; ИндияМелоксикам для инъекций 
DAB усиленная система жидкого субстрата тетрагидрохлоридSigma; ФормаD3939
Набор щелочной Индия для США

Ссылки

  1. Nussler, A., et al. Present status and perspectives of cell-based therapies for liver diseases. J. Hepatol. 45 (1), 144-159 (2006).
  2. Ponder, K. P., et al. Mouse hepatocytes migrate to liver parenchyma and function indefinitely after intrasplenic transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88 (4), 1217-1221 (1991).
  3. Kokudo, N., Horimoto, H., Ishida, K., Takahashi, S., Nozawa, M. Allogeneic hepatocyte and fetal liver transplantation and xenogeneic hepatocyte transplantation for Nagase's analbuminemic rats. Cell Transplant. 5 (5 Suppl 1), S21-S22 (1996).
  4. Christ, B., Bruckner, S., Stock, P. Hepatic transplantation of mesenchymal stem cells in rodent animal models. Methods Mol. Biol. 698, 315-330 (2011).
  5. Fox, I. J., Roy-Chowdhury, J. Hepatocyte transplantation. J. Hepatol. 40 (6), 878-886 (2004).
  6. Glanemann, M., et al. Transplantation of monocyte-derived hepatocyte-like cells (NeoHeps) improves survival in a model of acute liver failure. Ann. Surg. 249 (1), 149-154 (2009).
  7. Rahman, T. M., Hodgson, H. J. Animal models of acute hepatic failure. Int. J. Exp. Pathol. 81 (2), 145-157 (2000).
  8. Zhang, L., et al. Granulocyte colony-stimulating factor treatment ameliorates liver injury and improves survival in rats with D-galactosamine-induced acute liver failure. Toxicol. Lett. 204 (1), 92-99 (2011).
  9. Gardner, C. R., et al. Role of nitric oxide in acetaminophen-induced hepatotoxicity in the rat. Hepatology. 27 (3), 748-754 (1998).
  10. Nardo, B., et al. Successful treatment of CCL4-induced acute liver failure with portal vein arterialization in the rat. Transplant Proc. 38 (4), 1187-1189 (2006).
  11. Sathyasaikumar, K. V., et al. Fulminant hepatic failure in rats induces oxidative stress differentially in cerebral cortex, cerebellum and pons medulla. Neurochem. Res. 32 (3), 517-524 (2007).
  12. Wu, J., et al. Laennec protects murine from concanavalin A-induced liver injury through inhibition of inflammatory reactions and hepatocyte apoptosis. Biol. Pharm. Bull. 31 (11), 2040-2044 (2008).
  13. Kaur, G., Tirkey, N., Chopra, K. Beneficial effect of hesperidin on lipopolysaccharide-induced hepatotoxicity. Toxicology. 226 (2-3), 152-160 (2006).
  14. Rupertus, K., et al. Major but not minor hepatectomy accelerates engraftment of extrahepatic tumor cells. Clin. Exp. Metastasis. 24 (1), 39-48 (2007).
  15. Selden, C., Casbard, A., Themis, M., Hodgson, H. J. Characterization of long-term survival of syngeneic hepatocytes in rat peritoneum. Cell Transplant. 12 (6), 569-578 (2003).
  16. Tang, T. H., et al. The role of donor hepatocytes and/or splenocytes pre-injection in reducing islet xenotransplantation rejection. Hepatobiliary. Pancreat. Dis. Int. 2 (3), 344-350 (2003).
  17. Goto, Y., Ohashi, K., Utoh, R., Yamamoto, M., Okano, T. Hepatocyte transplantation through the hepatic vein: a new route of cell transplantation to the liver. Cell Transplant. 20 (8), 1259-1270 (2011).
  18. Gabelein, G., et al. Intrasplenic or subperitoneal hepatocyte transplantation to increase survival after surgically induced hepatic failure? Eur. Surg. Res. 41 (3), 253-259 (2008).
  19. Bhattacharjee, J., et al. Autologous NeoHep Derived From Chronic Hepatitis B Virus Patients' Blood Monocytes by Upregulation of cMET Signaling. Stem Cells Transl. Med. , (2016).
  20. Basic surgical skills. Emergency and Essential Surgical Care (EESC) programme. , http://www.who.int/surgery/publications/s16383e.pdf (2017).
  21. Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J. Vis. Exp. (47), (2011).
  22. Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure. J. Vis. Exp. (79), (2013).
  23. Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. J. Vis. Exp. (64), (2012).
  24. Bhattacharjee, J., et al. Autologous NeoHep Derived from Chronic Hepatitis B Virus Patients' Blood Monocytes by Upregulation of c-MET Signaling. Stem Cells Transl. Med. 6 (1), 174-186 (2017).
  25. Hori, T., et al. Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse. Ann. Gastroenterol. 24 (4), 307-318 (2011).
  26. Hori, T., et al. Simple and reproducible hepatectomy in the mouse using the clip technique. World J. Gastroenterol. 18 (22), 2767-2774 (2012).
  27. Vidal, I., Richert, L. The nude mouse as model for liver deficiency study and treatment xenotransplantation. Int. J. Hepatol. , 1400147(2012).
  28. Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat. Protoc. 3 (7), 1167-1170 (2008).
  29. Ahmed, S. U., et al. Generation of subcutaneous and intrahepatic human hepatocellular carcinoma xenografts in immunodeficient mice. J. Vis. Exp. (79), e50544(2013).
  30. Krikri, A., et al. Laparoscopic vs. open abdominal surgery in male pigs: marked differences in cortisol and catecholamine response depending on the size of surgical incision. Hormones (Athens). 12 (2), 283-291 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Трансплантация гепатоцитоврегенерация печениGFP-гепатоцитыклетки NeoHepокрашивание на Ki-67определение человеческого альбуминаанализ щелочной фосфатазы
Intrasplenic трансплантация гепатоцитов после частичной гепатектомии в Нод. ТКИД мышей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.