Методическая статья

Первичных зародышевых клеток Трансплантация для ТРИФОСФАТЫ/Cas9-основе скачка в Xenopus

7.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56035

⸱

1 февраля 2018 г.

1Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine

В этой статье

Краткое содержание

Генов, необходимых для выживания создают технические препятствия для создания мутантных линий. Скачка обходит летальность, объединяя генома, редактирование с помощью первичных зародышевых клеток трансплантации для создания одичал тип животных, перевозящих герминальных мутаций. Прорыва также позволяет эффективно поколения гомозиготных null мутантов в поколении1 F. Здесь трансплантация шаг продемонстрировал.

Аннотация

Создание мутантных линий путем изменения генома ускорения генетического анализа у многих организмов. ТРИФОСФАТЫ/Cas9 методы были адаптированы для использования в африканских когтистые лягушка Xenopus, давно модельный организм для биомедицинских исследований. Традиционными для выведения схемы для создания гомозиготных мутантных линий с ТРИФОСФАТЫ/Cas9-пристрелнных мутагенеза имеют несколько шагов длительным и трудоемким. Чтобы облегчить создание эмбрионов мутантов, особенно в том, чтобы преодолеть препятствия, связанные с выбивания генов, которые необходимы для эмбриогенеза, был разработан новый метод под названием скачка. Этот метод использует надежность зародыши Xenopus «вырезать и вставить» эмбрионального методы. Скачка использует передачи первичных зародышевых клеток (PGCs) от эффективно mutagenized донорских эмбрионов в удаленной PGC wildtype братьев и сестер. Этот метод позволяет эффективно мутации важно генов путем создания химерных животных с wildtype соматические клетки, которые несут мутант микрофлорой. Когда два животных0 F ношение «чехарда трансплантации» (то есть, мутантные клетки семенозачатка) являются intercrossed, они производят гомозиготных, или составные гетерозиготных, null F1 эмбрионов, тем самым экономя время полной поколения для получения фенотипические данных. Прорыва также предоставляет новый подход для анализа гены материнского эффекта, которые являются тугоплавкие F фенотипического анализа0 после ТРИФОСФАТЫ/Cas9 мутагенеза. Эта рукопись подробно метод прорыва, с уделением особого внимания как успешно выполнять PGC трансплантации.

Введение

Как генотип кодирует фенотип был основной вопрос в биологии с момента повторного законов Менделя. Понимание роли генов, их регулирования и взаимодействия в рамках генных сетей и функции закодированные продуктов обещания предоставить инструменты для выявления новой биологии и совершенствуясь болезни государства. Для более чем половины столетия1африканских когтистые лягушка Xenopus, был ведущим модель для исследования на самые разнообразные темы в базовой биологии и биомедицины, включая генетического контроля развития. Исторически большинство исследований по Xenopus использовала интрогрессии лягушка, X. laevis, но совсем недавно, благодаря своей diploidy, X. tropicalis был разработан как амфибии генетической модели. Полный геном последовательности были собраны от обоих видов Xenopus 2,3. «Лягушка сообщества» является теперь в поворотный момент где основные генома модификации технологии позволяет исследование функции гена, практически на волю. Программируемый ТРИФОСФАТЫ/Cas9 эндонуклеазами сделали мутагенез генов высокоэффективных, с biallelic мутации возможно в большинстве клеток животных4,5,6,7, 8,9,10,11. Эти исследования, подчеркнул Бхаттачарья и др. 12 и Шигета и др. 13, показали, что функции многих генов может быть изучен мутагенеза в F0 мозаика животных. Этот подход имеет множество преимуществ; Однако Cas9-sgRNA-microinjected эмбрионы часто отображения переменной фенотипов из-за неполной потери функции (LOF). Более значительно, поколение мутантных линий является весьма выгодным для некоторых приложений — в частности, при изучении генов, которые имеют материнской вклад мРНК. Матери мРНК и белки и их влияния на epigenetics, сохраняются для длительного периода в эмбриогенезе14,15,16, предоставление раннего развития вклад многих генов Огнеупорные материалы для F0 анализы. Таким образом необходимы другие подходы LOF.

При поиске для создания мутантных линий, путь для получения гомозиготных LOF эмбрионы есть несколько препятствий. Во-первых, эффективное мутагенеза производить biallelic перегласовок может быть невыгодно, поскольку потеря функций важно генов приводит к сбою дожить до половой зрелости, мешая производства жизнеспособных линии. Общее решение является тщательное титрования количество доставлены Cas9-sgRNA. Здесь цель – добиться баланса между снижение летальности также максимизируя эффективность мутагенеза микрофлорой. Вторая проблема возникает от стандартного разведения схемы, где фенотипические анализы откладываются до F2 поколения. Используя стандартный подход, сексуально зрелых F0 животных, которые передают мутант аллели через микрофлорой outcrossed для производства F1 гетерозиготных «носители», которые затем выросла до половой зрелости. Два F1 heterozygotes затем intercrossed производить F2 черепашки эмбрионов на ожидаемый Менделевское частоте 25%. Таким образом два поколения размножения необходимых для анализа мутант фенотипов. Мутанта животных может быть рецессивной или составные heterozygotes (т.е., потомства содержащий два разных мутантные аллели, которая зависит от генотипы родителей животных, используемых в Интеркросс1 F).

Эти препятствия могут быть преодолены, ограничивая программируемые нуклеиназы опосредованной мутагенеза в зародышевых клеток, которая лежит в основе новый метод под названием скачок17. Скачка имеет два основных компонента: (1 микроинъекции мРНК Cas вместе с sgRNA, или нуклеиназы sgRNA комплексов (или, в принципе, Таленс или цинка палец nucleases) на стадии одноклеточных, эффективно mutagenize эмбриональных геномов, следуют (2) Трансплантация PGCs в wildtype сестру эмбрионов, где эндогенного PGCs были удалены. Когда оба шаги являются эффективным, полный микрофлорой замена мутант зародышевые клетки могут быть получены. Blackler в начале 1960-х годов показал, что Xenopus PGCs могут быть трансплантированы между эмбрионов в конце Нейрула и раннего tailbud этапов18,19. Для скачка, Blackler подход был изменен путем выполнения пересадки на стадии Бластула17, когда PGCs локализованы в растительный полюс эмбриона20,21. Трансплантация перед гаструляция имеет два основных преимущества. Во-первых приживления трансплантатов и последующего нормального развития было установлено быть более эффективным, когда Трансплантация проводится на этапе Бластула (неопубликованные наблюдения). Во-вторых выполняя Бластула этап трансплантаций вскоре после того, как началась zygotic транскрипции, можно избежать летальность, вытекающие из развития генных мутаций, которые нарушают гаструляция или что в противном случае привести к искаженной конце neurulae. PGC трансплантации подшипник («leapfrogged») эмбрионов выращиваются для половой зрелости, и intercrosses между этими животными0 F показали, что во многих случаях 100% F1 потомства отображения LOF фенотипу (большинство из них составные heterozygotes), указав полный микрофлорой замена с целевой мутации.

Ожидается, что скачок ускорит генетических подходов в Xenopus. Прорыва также предоставляет альтернативу «хозяин передачи» метод22 для анализа LOF гены материнского эффекта (неопубликованные наблюдения). В текущей публикации подробное описание метода, особенно упором на трансплантации PGC, представлен в X. tropicalis (с незначительными изменениями на X. laevis). Трансплантация PGCs продемонстрировали здесь для облегчения более быстрой передачи этой технологии других лабораторий, работающих с Xenopus. Принципы этого метода должен быть успешными в других амфибий (например, urodeles), и организм конкретных изменений в методологии следует предусматривать приложения для многих других животных, в которых может быть достигнуто эффективное мутагенеза и PGCs легко которые спасаютжизньпритрансплантации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использования Комитетом из университета Калифорнии в Ирвине.

1. Подготовка к трансплантации PGC

  1. Подготовьте заранее, рассечение инструменты как описано23.
    Примечание: Бровь волос ножи используются для делать надрезы с помощью цикла волос для стабилизации эмбриона при выполнении операции. Волоски бровей и волос петли склеиваются в боросиликатного стекла, пипетки Пастера, были впервые разработаны в пламени и разбит на части разбавлять (см. рис. 1A, стрелки) для создания более коротких, более узкий кончик (рис. 1B) для большей подвижности При выполнении операции.
  2. Создание sgRNAs, используя ранее описанные процедуры24 .
    Примечание: Кратко, короткие ДНК шаблоны кодирования для sgRNAs создаются с помощью перекрытия deoxyoligonucleotides, содержащие 5' бактериофага Т7 промоутеров, которые являются отожженных и «заполнить», ошибка бесплатно, термостабильной полимеразы дна. В пробирке sgRNA синтез реакции инкубируют на несколько часов на ночь (в зависимости от комплекта используется). Реакции, DNAse лечение для удаления шаблона. SgRNAs очищаются стандартными методами фенол/хлороформ добычи и аммония ацетат/изопропанол осадков, согласно инструкции производителя комплект24.
  3. Незадолго перед проведением микроинъекции, подготовить Cas9-sgRNA комплексов, Первый денатурируя ~ 250 нг sgRNA в 3 мкл суммарный объем свободных РНКазы (Диэтилпирокарбонат лечение) H2O на 60-65 ° C за 5 мин, затем быстрого охлаждения на льду на 5 мин. Центрифуга sgRNA на несколько секунд, 1 мкл 1 мкг/мкл Cas9 белка и инкубировать в течение 10 минут при 37 ° C для поощрения формирования комплекса.
    Примечание: После инкубации, трубка может храниться на льду при подготовке эмбрионы микроинъекции.
  4. Получите X. tropicalis эмбрионов в экстракорпорального оплодотворения с помощью стандартных методов, как описано выше25. Исключения из желе25,26 эмбрионов на 10 мин после оплодотворения.
    Примечание: Время оплодотворения считается время после подвеска сперма добавляется яйца и блюдо залита 1/9thX Марк изменения Ringers (MMR)26. X. tropicalis25, в отличие от X. laevis, выполняют де застывания в 1/9 x MMR содержащие 3% хвоща бесплатная база (не соль HCl), рН 7,8-8.0, с учетом следуют несколько стирок в 1/9 x MMR. Трансфер эмбрионов в агарозном (1%)-с покрытием блюдо, содержащие 1/9 x MMR при комнатной температуре.
  5. Немедленно переноса эмбрионов для инъекций для блюдо покрытием агарозы 1%, содержащие 1 x MMR с помощью пипетки Пастера.
  6. Залить на этапе 1-клетка. Смотрите ссылки26,27 для подробного описания методов микроинъекции Xenopus .
    1. Придать каждой эмбриона в одном месте в животное полюса, с 4 nL Cas9-sgRNA комплекса (окончательная сумма = 1 нг Cas9 и pg ~ 250 sgRNA; см. обсуждение)24. После 10-20 мин инъекции сайте исцеления, переноса эмбрионов агарозы покрытием блюдо, содержащие 1/9 x MMR и температуре в 25 ° C. Также создайте блюдо uninjected сестру эмбрионов, которые будут служить в качестве трансплантата получателей.
  7. Подготовить Петри пластины (60 мм), которые содержат ~ 5 мм-толстый слой агарозы 1%, в 0,3 x MMR, если делать пересадки в X. tropicalis, или 1 x MMR для X. laevis.
    1. Создание депрессий ~ 3-4 мм глубоко вставляя 3-x 4-ну плесень (созданные режущие пластины ПЦР 96-луночных) в расплавленном агарозы при заливке пластины (см. Рисунок 1 c и D). Держите плесень несколько миллиметров выше нижней части Петри с помощью зажима придается стенд кольцо, пока не затвердеет агарозы.
    2. Кроме того, сделать 24-ну пластины для дома отдельных эмбрионов, покрытие скважин с тонким слоем агарозы 1%, в 1/9 x MMR.
      Примечание: Культура среднего добавлен в этих скважин является x 1/9, которую MMR дополнена 50 мкг гентамицина сульфат/мл.

2. трансплантация PGCs

  1. Когда эмбрионы просто достичь Nieuwkoop и Фабер28 Бластула этап 9 (рисунок 2A), ~4.5 h после оплодотворения (hpf) для X. tropicalis, удалите их из инкубатора 25 ° C и позволяют им сбалансировать до комнатной температуры для дополнительной 0,5 ч.
  2. Чтобы начать трансплантации в 5 hpf (рис. 2B), использовать пипетку Pasteur для передачи одного эмбриона донора PGC (вводится с Cas9-sgRNA) на блюдо агарозы 60 мм, содержащие депрессий (создана на шаге 1.7) в 0,3 x MMR (или 1 x MMR при использовании X. laevis). Также передача одного uninjected сестру эмбриона, Трансплантат получателю, это блюдо.
    Примечание: Очень важно не путать личность каждого из этих эмбрионов.
  3. Вручную удалите vitelline конверты из каждого эмбриона, с помощью щипцов и вращаться как эмбрионы, так что их растительный полюса находятся в режиме и доступны для хирургии.
    Примечание: Описание ручной де vitellination эмбрионов ранее был описан26.
  4. Используя острый кончик ножа волос брови, сделайте четыре неглубокие надрезы в форме квадрата на растительный полюс получателя эмбриона, внутри зоны, где будет форма будущей бутылки клетки, которые отмечают бластопор. Сделайте разрезы, вставив кончик ножа волосы бровей в эмбрион, чуть ниже поверхности и сделать вверх нарезки движений во время стабилизации эмбриона с цикла волос.
    Примечание: На рисунке 2 показывает растительные виды эмбриона через каждые полчаса от 4.5-7.0 hpf Показать размер ячейки и служить ориентиром для оценки, где клетки бутылки будет форма (пунктирная белый круг). Цель состоит в том, чтобы сделать разрезы, где указано пунктирной черный ящик.
  5. После того, как четыре стороны квадрата проведенная путем разрезов, углубите каждый разрез с ножом волосы бровей, с использованием аналогичных движений резки для достигать глубины из примерно 1/3 до 1/2 расстояния на blastocoel пол.
  6. Бесплатные растительных тканях экспланта от получателя эмбриона (Рисунок 3А и B), сделав горизонтальные (параллельно поверхности растительного происхождения) cut(s) в регионе глубоко растительного происхождения.
    Примечание: Размер PGC-содержащих растительные экспланта составляет примерно 0,4 0,45 мм на стороне и 0,25-0,3 мм в глубину. Этот растительный экспланта от получателя эмбриона больше не нужен и поэтому должно быть отложите в сторону для отмены.
  7. Работать быстро, повторите эту процедуру (шаги 2.4-2.6) на эмбрион PGC доноров создать фрагмент аналогично размера растительных тканей для трансплантации.
    Примечание: Важно выполнять этот второй диссекции с небольшой задержкой, чтобы свести к минимуму время для получателя эмбриона исцелить свою открытую рану.
  8. Как только ткани, содержащие PGCs удаляется из эмбриона донора, используйте цикл нож и волос волосы бровей для перемещения этот экспланта в позицию в созданную в получателя эмбриона.
    Примечание: Внутренней поверхности трансплантата доноров необходимо перед внутренних получателей эмбриона. Это не нужно соответствовать ориентации осей спинной вентральной и влево вправо лоскута с получателя эмбриона.
  9. Используйте длинный край вала бровь волос нож, проведенных параллельно поверхности трансплантата, аккуратно нажмите трансплантата в отверстие в поверхности растительного происхождения получателей эмбриона.
  10. После того, как был сделан трансплантата, используйте hairloop или вал ножа бровь волос мягко скользить «каркаса» эмбриона донора по всей поверхности агарозы и в депрессию агарозы. Убедитесь, что открытая рана тушу сталкивается Основная жидкость. Если нет, то используйте нож волосы бровей для поворота эмбриона для достижения этой ориентации.
  11. Сдвиньте получателя эмбриона, с трансплантата, исцеление в месте, в прилегающих депрессии и также убедитесь, что привитые полюс растительных тканей сталкивается Основная жидкость.
  12. Повторите эту процедуру (шаги 2.1-2.11), используя другую пару доноров и получателей эмбрионов для создания другой пары трансплантации/каркаса; передача их в пустой депрессий.
    Примечание: Очень важно, что один делает нотации для отслеживания соответствия пар туши и трансплантации подшипник эмбрионов. Туши доноров будет использоваться как прокси-сервер для эффективности Cas9-sgRNA индуцированного мутагенеза в трансплантированы PGCs, которые не могут быть assayed легко до трансплантации подшипник животные достигают половой зрелости (см. шаг 3.3, ниже и обсуждение ).
  13. Продолжать делать пересадки эмбрионов до приблизительно ранней стадии братскую 10, который приблизительно 6.5 ФВЧ в X. tropicalis (см. Рисунок 2E).

3. после исцеления ухода эмбрионов

Примечание: Графтов исцелить на место в течение ~ 30 мин, и это нормально, чтобы наблюдать некоторые yolky мусора от lysis клетки, источая из эмбриона (рис. 3 c).

  1. После исцеления, используйте пипетки Пастера очень осторожно переноса эмбрионов от депрессии для отдельных скважин пластины с покрытием агарозы 24-хорошо. Экссудат будет снят жидкость смешивания во время передачи (рис. 3D).
    1. Вращаться эмбрионы, так что они помещены растительного происхождения полюс вверх, стоящих перед массовых решения. Опять же место доноров туши и взяточничество получателей в соседних скважин для оказания помощи в отслеживании эмбриона пар; Запишите эту информацию.
  2. Передача пластину 24-а, содержащий эмбрионов до 25 ° C-инкубатор для ночь культуры.
    Примечание: Следующий день, эмбрионы будут достигли стадии tailbud.
  3. Переместите трансплантата получателей для очистки агарозы покрытием 6-ну пластины, содержащий x 1/9, которую MMR дополнена 50 мкг гентамицина сульфат/мл, с 1 эмбриона на хорошо. Четкое ведение туш доноров, которые соответствуют эти графт получателей.
  4. Чтобы оценить эффективность мутагенеза последовательности ПЦР ампликонов5,17,24 или с помощью других методов, которые полагаются на ПЦР ампликонов (см. обсуждение), переместите отдельные туши 0.2 мл ПЦР газа трубы. Удалить большую часть среднего и гомогенизации в 100 мкл лизис буфера24 содержащие протеиназы K (PK), повторил прихваченного дозирование с помощью пипетки P200.
  5. Выполняйте эмбриона лизис24 56 ° C в течение 6 ч в одночасье разрешить PK пищеварение. Инактивирует PK путем нагревать его к 90-95 ° C в течение 10 минут, а затем быстрое охлаждение до 4 ° C. Используйте лизатов без дальнейших шагов очистки для семян ПЦР-реакции для получения коротких ампликонов для прямой последовательности ДНК Сэнгер24. Магазин лизатов при-20 ° C.
    Примечание: В течение нескольких дней, головастиков достигнет кормления стадий (около этап 45-46) и может быть использована подвеска планктонных порошка (sera микрон).
  6. После ~ 1 неделю, с ежедневных изменений питательной среды для поддержания чистоты и свести к минимуму микробных избыточный рост переместите головастиков небольших резервуаров в циркулирующих водной системы капельного потоком. Используйте данные последовательности отделить головастиков с весьма эффективно mutagenized PGCs от головастиков с более низкой эффективности мутагенеза. После метаморфоза, переместите froglets взрослых водной системы в лаборатории.
    Примечание: Схемы, разработанный Национальным Xenopus ресурсов (Лаборатория морской биологии, Вудс-Хол, MA) служить ориентиром для головастика, кормление взрослых лягушка обслуживания30и29 .

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

После трансплантации качественное определение эффективности ТРИФОСФАТЫ/Cas9 мутагенеза должны быть выполнены перед затратив усилия в животноводстве расти и поддерживать животных к половой зрелости. Потому что животные, перевозящих чехарда трансплантации соматически wildtype и микрофлорой труднодоступных для выполнения прямых измерений, экономя туши донорских эмбрионов становится важным. Анализ ДНК от туши выступает в качестве прокси для степени мутагенеза, что происходит в трансплантирова...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот отчет содержит подробный протокол для трансплантации растительной ткани, содержащие PGCs. трансплантация PGCs используется в сочетании с геном редактирования технологий (например, ТРИФОСФАТЫ/Cas9) для изменения микрофлорой животного во время поддержание почти все его соматического тканей как генетически дикого типа. Для скачка, чтобы быть успешным, существует ряд критических факторов, чтобы рассмотреть перед выполнением исполняющая трансплантаций.

Чтобы обеспечить полную замену м...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Автор не имеет ничего, чтобы раскрыть.

Благодарности

Эта работа была выполнена при поддержке гранта, 5R21HD080684-02, из Национального института здоровья ребенка и развития человеческого потенциала. Автор хотела бы поблагодарить Кена Чо за его неизменную энтузиазм и поддержку. Автор также хотели бы признать Брюс Blumberg, для использования его камеры, Ревекка Чарни, для критических чтении рукопись и Шон Макнамара и Marcin Wlizla в национальном Xenopus ресурсов (RRID:SCR_013731), для ценных разговоры о X. tropicalis кормления и ухода за животными схемы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Щипцы Dumont #5Инструменты для тонкой науки11252-20 или 11252-30
волос для бровейДомашняя
петляДомашние
пипетки Пастера, боросиликатное стеклоFisher Scientific13-678-20A
Клей Крейзи (на основе цианоакрилата)Elmer's Products, Inc.KG581Для вставки волос на бровях и петель для волос в пипетки Пастера можно использовать и другие подобные клеи.
Олигодезоксинуклеотиды, специально заказанныеIntegrated DNA TechnologiesCustom OrderedTemplate oligos для синтеза sgРНК, см. Nakayama et al., 2014 для получения подробной информации о дизайне.
Megascript T7 kitAmbion/ThermoFisherAM1334Или используйте Megashortscript T7 (AM1354) kit
Phenol, Tris bufferedВысококачественный дистиллированный фенол от любого коммерческого поставщика
Хлороформвысокого качества от любого коммерческого поставщика
Этанолвысокого качества от любого коммерческого поставщика
Диэтилпирокарбонат (DEPC)Sigma Chemical Co.D5758-50ML
белок Cas9, с сигналом ядерной локализации PNABio, Inc.CP01Восстановлен с использованием воды, обработанной DEPC, в соответствии с рекомендациями производителя
10X Marc's Modified Ringers растворHomemade. Рецепт (ссылка 26) для 1X MMR (без ЭДТА) - 100 мМ NaCl, 2 мМ KCl, 1 мМ MgSO4, 2 мМ CaCl2, 5 мМ HEPES. Уровень pH раствора регулируется до 7,4.
Агарозалюбого сорта молекулярной биологии достаточно
60 Х 15 мм пластин ПетриFalcon351007
24-луночных пластинFalcon3047
L-CysteineSigma Chemical Co.C7352-100GСвободная основа, не HCl соль
Протеиназа KRoche03 115 828 001Обычно ~20 мг/мл из корма головастика Roche
sera Micronsera. Ресуспендирование в питательную среду. Может быть приобретен в различных интернет-магазинах
Нож для для волос

Ссылки

  1. Gurdon, J. B., Hopwood, N. The introduction of Xenopus laevis into developmental biology: of empire, pregnancy testing and ribosomal genes. Int J Dev Biol. 44 (1), 43-50 (2000).
  2. Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328 (5978), 633-636 (2010).
  3. Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).
  4. Blitz, I. L., Biesinger, J., Xie, X., Cho, K. W. Biallelic genome modification in F(0) Xenopus tropicalis embryos using the CRISPR/Cas system. Genesis. 51 (12), 827-834 (2013).
  5. Nakayama, T., Fish, M. B., Fisher, M., Oomen-Hajagos, J., Thomsen, G. H., Grainger, R. M. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).
  6. Guo, X., et al. Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis. Development. 141 (3), 707-714 (2014).
  7. Wang, F., Shi, Z., Cui, Y., Guo, X., Shi, Y. B., Chen, Y. Targeted gene disruption in Xenopus laevis using CRISPR/Cas9. Cell Biosci. 5, 15(2015).
  8. Jaffe, K. M., et al. c21orf59/kurly Controls Both Cilia Motility and Polarization. Cell Rep. 14 (8), 1841-1849 (2016).
  9. Liu, Z., et al. Efficient genome editing of genes involved in neural crest development using the CRISPR/Cas9 system in Xenopus embryos. Cell Biosci. 6, 22(2016).
  10. Naert, T., et al. CRISPR/Cas9 mediated knockout of rb1 and rbl1 leads to rapid and penetrant retinoblastoma development in Xenopus tropicalis. Sci Rep. 6 (35264), (2016).
  11. Ratzan, W., Falco, R., Salanga, C., Salanga, M., Horb, M. E. Generation of a Xenopus laevis F1 albino J strain by genome editing and oocyte host-transfer. Dev Biol. 426 (2), (2016).
  12. Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus. Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).
  13. Shigeta, M., et al. Rapid and efficient analysis of gene function using CRISPR-Cas9 in Xenopus tropicalis founders. Genes Cells. 21 (7), 755-771 (2016).
  14. Hontelez, S., et al. Embryonic transcription is controlled by maternally defined chromatin state. Nat Commun. 6, 10148(2015).
  15. Peshkin, L., et al. On the Relationship of Protein and mRNA Dynamics in Vertebrate Embryonic Development. Dev Cell. 35 (3), 383-394 (2015).
  16. Owens, N. D., et al. Measuring Absolute RNA Copy Numbers at High Temporal Resolution Reveals Transcriptome Kinetics in Development. Cell Rep. 14 (3), 632-647 (2016).
  17. Blitz, I. L., Fish, M. B., Cho, K. W. Leapfrogging: primordial germ cell transplantation permits recovery of CRISPR/Cas9-induced mutations in essential genes. Development. 143 (15), 2868-2875 (2016).
  18. Blackler, A. W. Transfer of germ-cells in Xenopus laevis. Nature. 185, 859-860 (1960).
  19. Blackler, A. W., Fischberg, M. Transfer of primordial germ-cells in Xenopus laevis. J Embryol. Exp Morph. 9, 634-641 (1961).
  20. Bounoure, L. L'origine des cellules reproductrices et le problem de la lignee germinale. , Gauthier-Villars. Paris. (1939).
  21. Nieuwkoop, P. D., Sutasurya, L. A. Primordial Germ Cells in the Chordates: Embryogenesis and phylogenesis. , Cambridge University Press. Cambridge. (1979).
  22. Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C. Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules. Methods Cell Biol. 36, 213-230 (1991).
  23. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Embryo dissection and micromanipulation tools. CSH Protoc. , (2007).
  24. Nakayama, T., et al. Cas9-based genome editing in Xenopus tropicalis. Methods Enzymol. 546, 355-375 (2014).
  25. Ogino, H., McConnell, W. B., Grainger, R. M. High-throughput transgenesis in Xenopus using I-SceI meganuclease. Nat Protoc. 1 (4), 1703-1710 (2006).
  26. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis.: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
  27. Kay, B. K. Injection of oocytes and embryos. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology (Methods in Cell Biology Vol. 36). Kay, B. K., Peng, H. B. , Academic Press. San Diego. (1991).
  28. Normal Table of Xenopus laevis. (Daudin): A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metomorphosis. Nieuwkoop, P., Faber, J. , Garland Publishing Inc. New York. (1994).
  29. Xenopus Tadpole Feeding. , Available from: http://www.mbl.edu/xenopus/files/2016/06/Xenopus-Tadpole.pdf (2017).
  30. Xenopus tropicalis Animal Care. , Available from: http://www.mbl.edu/xenopus/files/2016/06/Xenopus-Tropicalis.pdf (2017).
  31. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Res. 42 (22), e168(2014).
  32. Sander, V., Reversade, B., De Robertis, E. M. The opposing homeobox genes Goosecoid and Vent1/2 self-regulate Xenopus patterning. EMBO J. 26 (12), 2955-2965 (2007).
  33. Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
  34. Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases. Nat Commun. 5, 3157(2014).
  35. Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. S. Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly. Genome Res. 19 (7), 1279-1288 (2009).
  36. Qiu, P., Shandilya, H., D'Alessio, J. M., O'Connor, K., Durocher, J., Gerard, G. F. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).
  37. Ota, S., et al. Efficient identification of TALEN-mediated genome modifications using heteroduplex mobility assays. Genes Cells. 18 (6), 450-458 (2013).
  38. Dahlem, T. J., et al. Simple Methods for Generating and Detecting Locus- Specific Mutations Induced with TALENs in the Zebrafish Genome. PLoS Genet. 8 (8), e1002861(2012).
  39. Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis. Sci Rep. 5, 15587(2015).
  40. Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus. Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).
  41. Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. A PCR Based Protocol for Detecting Indel Mutations Induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in Zebrafish. PLoS ONE. 9 (6), e98282(2014).
  42. Mock, U., Hauber, I., Fehse, B. Digital PCR to assess gene-editing frequencies (GEF-dPCR) mediated by designer nucleases. Nat Protoc. 11 (3), 598-615 (2016).
  43. Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
  44. Shi, J., Wang, E., Milazzo, J. P., Wang, Z., Kinney, J. B., Vakoc, C. R. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nat Biotechnol. 33 (6), 661-667 (2015).
  45. Koebernick, K., Loeber, J., Arthur, P. K., Tarbashevich, K., Pieler, T. Elr-type proteins protect Xenopus Dead end mRNA from miR-18-mediated clearance in the soma. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 16148-16153 (2010).
  46. Yang, J., Aguero, T., King, M. L. The Xenopus maternal-to-zygotic transition from the perspective of the germline. Curr Top Dev Biol. 113, 271-303 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CRISPR Cas9XenopusleapfroggingF1

Похожие статьи