Эта рукопись описывается утилита УЗИ на самок крыс в разработке экспериментальной модели для репродуктивного и гинекологических расследования. Приводится подробное объяснение о том, как выполнять ультрасонографическая оценки.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
УЗИ в экспериментальной репродуктивной исследования на крысах
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
С развитием вспомогательных репродуктивных технологий и этических ограничений исследований на людях крыса Животные модели широко используются в репродуктивной медицине. В прошлом изучение развития репродуктивной системы у грызунов была основана на одноразовый гистологическом подакцизным тканей. Недавно с развитием разрешением трансабдоминального ультразвука, сонография высокого качества теперь могут быть выполнены для оценки репродуктивных органов у крыс, позволяя новый метод для изучения репродуктивной системы. Изображения были получены с помощью систему с высоким разрешением эндокринологом. Гинекологическое УЗИ была проведена 28 8 недельных небеременных крыс и 5 беременных крысах Sprague-Dawley. Мы опишем, как признать органов репродуктивной системы и связанные с ними структуры в типичных представлениях на различных этапах эструса цикла. Цвет потока Doppler был использован для измерения потока крови маточной артерии и оценки матки шаблон изменения кровотока на различных стадиях беременности. Мы продемонстрировали, что ультразвуковое исследование является полезным методом для оценки изменений в внутренних половых органов. Его применение повышает возможность проведения дополнительных экспериментов, в том числе медицинские или хирургические процедуры и предоставляет возможность контролировать сонографические изменения внутренних органов без ущерба для животных.
Введение
Крыса Животные модели широко используются в репродуктивной медицине, в том числе эмбриона и яичников трансплантации1,2. Однако в прошлом, изучение развития репродуктивной системы у грызунов была основана на одноразовый гистологическом подакцизным тканей и продольное исследование изменения повседневной репродуктивный орган не удалось в крыс3. УЗИ широко использовался в вспомогательных репродуктивных технологий в организме человека на протяжении более 30 лет, но это ценные технологии только был применен к крысам недавно.
Наша цель заключалась в создании ультрасонографическая подхода для оценки репродуктивных органов крысах Sprague-Dawley для разработки экспериментальных моделей для репродукции и гинекологии расследования и чтобы продемонстрировать порядок, потому что наши знания, Существует нет текущий визуализированных публикаций относительно этой процедуры. Мы описываем процедуры ультрасонографическое обследование женского пола крыса репродуктивной системы и настоящем ультрасонографическая выводы по анатомии и маточные артерии кровотока с помощью ультразвука высокой четкости. Мы мониторинг характеристики эндометрия, яичников и маточных артерий кровотока в небеременных животных на разных этапах цикла эструса оценить значительные различия в толщине эндометрия, яичников морфология и матки кровотока в различные этапы цикла эструса, похож на женщин. Мы использовали высококачественные ультразвуковое оборудование с частотой 70 МГц и уровнем резолюции 30 мкм. Наша цель заключалась в оценке изменений в сопротивлении матки кровотока в беременных крыс. Эта техника позволяет для изучения ежедневных изменений в репродуктивных органов без ущерба для животных.
Существует несколько технических трудностей в использовании ультразвука на крыс. Эти трудности включают в себя: Крыса эндометрия намного тоньше, чем человеческий девушки4. Трудности в imaging яичников у крыс было обусловлено толще кожи и мышц брюшной стенки у крыс, которые привели к почти полной затухания ультразвука5, и маточных артерий является гораздо более сложным найти в небеременных крысы. Мы решили многие технические проблемы с процедурой, и для тех проблем, которые остаются, мы покажем, как их минимизации.
Успешное мониторинг сонографические изменений в репродуктивных органах крыс без необходимости приносить в жертву животных будет открыта возможность строительства будущего животных моделей репродуктивной медицины и других хирургических процедур.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Это исследование проводилось в строгом соответствии с рекомендациями руководства для ухода и использования лабораторных животных национальных институтов здоровья и в соответствии с прибытия (животное исследования: отчетности в Vivo эксперименты) руководящие принципы. Протокол получил лицензию для соблюдения директивы 2010/63/ЕС с номером авторизации A13170404 (Anexo 1) экспериментов на животных. Все эксперименты проводились в Европейский союз сертифицированные лаборатории после национальные руководящие принципы этического ухода за животными (RD 53/2013, директива ЕС 63/2010). Протокол был одобрен Комитетом по этике животных эксперименты Университета Мурсии.
1. животных подготовка
Примечание: Все эксперименты были поддержаны животных экспериментов раздел Университета Мурсии и акушерства и гинекологии департамента Мурсия университета.
- Используйте 8 недели старый Sprague-Dawley крысы (28 самок крыс) весом 200-250 г в всех экспериментов.
Примечание: Здесь, мы также использовали 5 беременных крыс. - Чтобы получить беременных крыс, клетки 8 недельных женщин и плодородные самцов крыс и мат с 17:00 -23:00 ч. Идентификация вагинальных свечей на следующее утро было истолковано как спаривания успех. Рассмотрим 1 день гестации, следующий день после того, как они были вязка.
- Проведение экспериментов на 9, 15 и 18 дней гестации.
- Дом крысы в группах по два с свободный доступ к продовольствию и воде и поддерживать на очередной 12 h свет/темно циклов.
- После акклиматизации к условиям объекта как минимум две недели, используйте ежедневно утром вагинальной цитологии для оценки частоты эструса и регулярности.
Примечание: Двадцать восемь крыс с обычный 4-5 день течки этапа были отобраны для включения в исследование.
2. Подготовка крыс для изображений
Примечание: Изображения были получены с помощью разрешением трансабдоминального ультразвукового исследования. Фазы эстрального цикла были определены мазок вагинальной цитологии.
- До исследования изображений анестезировать плотины в зале индукции с 2-3% изофлюрановая газом.
- Удаление животных и немедленно поместить морду в носовой конус, подключенный к системе анестезии и поддерживать животное на 1,5-2% изофлюрановая во время ультразвукового обследования.
- Удалите мех из реберную маржа в хвостовой части живота с Клипперс и депиляционный крем.
- Место наркотизированных крыс в лежачем положении на таблицу с подогревом для обеспечения крыса и обеспечения оптимального комфорта и поддержания физиологических параметров для продолжительности обработки изображений сессии. Все физиологические параметры должны быть интегрированы с изображениями и данные регистрируются в режиме реального времени через применение ультразвука.
- Аккуратно вставьте ректальный датчик (после смазывания) для мониторинга температуры тела (37,5 ° C ± 0,5 ° C).
- Датчика (30 Гц) в стационарных держателя и перемещать его вдоль вертикальной и горизонтальной оси (вперед назад и side-to-side) с помощью ручного джойстик или вручную.
- Применить на нефтяной основе офтальмологических бальзам для глаз крысу, чтобы избежать высыхания во время процедуры.
3. Экспертиза
Примечание: Анатомия rats´ репродуктивных органов: влагалище лежит спинной мочевого пузыря и делится на два рога матки, расширяющие сторону почки. Яичников связаны маточные рожки через яйцеводов (рис. 1). Матки расположен в регионе кзади почки.
-
Идентификация матки
- С помощью мочевого пузыря как ориентир для поиска шейки матки, следуйте шейки матки найти ветви левой и правой маточные рожки.
- Перейти к двумерной просмотра/видео, выбрав «B-режим». Измерьте Антеро задний диаметр каждого рога матки в регионе середине наружного на изображении сагиттальной срединной линии. Обнаружить измерений с помощью ультразвука системного программного обеспечения.
- Измерьте эндометрия толщиной от эхогенная границы до границы эхогенная через полости эндометрия на изображении сагиттальной срединной линии в режиме «B-».
- Изменить на Цветной Допплер режим, выбрав «Цветные Doppler». Используйте цвет Доплера для выявления кровоснабжение эндометрия и измерить кровоток эндометрия. В Цветной Допплер режим выберите следующие параметры: ВЧ-фильтр установлен на 4 Гц, набор частоты импульсного повторения между 4 и 48 кГц и Импульсный Допплер ворота от 0,2 до 0,5 мм.
-
Определение потока крови маточных артерий
- Получите доплеровских сигналов в маточные артерии вблизи боковой уступает маржа стыке маточно-шейки матки около подвздошных артерии с каждой стороны.
- Используйте следующие параметры в режиме Допплер: ВЧ-фильтр установлен на 6 Гц, набор частоты импульсного повторения между 4 и 48 кГц и Импульсный Допплер ворота от 0,2 до 0,5 мм.
- Позаботьтесь, чтобы выровнять поток крови и Doppler луч к минимуму Doppler угол. Запись угол между Doppler луча и судна. Значения, взятые за углом 60° являются неточными и следует избегать6.
- Измерьте пиковой систолической скорости (ПСВ) и конечного диастолического скорости (EDV) из трех последовательных циклов. Затем вычислите систолическое диастолическое (S/D) соотношение (ПСВ/EDV) и индекс сопротивления (РИ) ([ПСВ-EDV] / ПСВ) значения для каждого рога матки.
- Измерения потока крови маточной артерии 5 беременных крыс во время 9-й, 15-й, 18-й день беременности.
-
Идентификация завязи и кровотока яичников артерии
Примечание: Женского пола крыса яичников расположены боковые почки по обе стороны от животного и проживают в жировых отложений, нашли в конце рога матки (рис. 1).- Для изображений яичников, начните с зонд в поперечной плоскости и поместите его на боковой аспект животного чуть ниже ребер. Почки и жировой ткани имеют вид гиперэхогенные по сравнению с яичника.
- Измерьте внешней границы завязи и фолликулов. Цифры на шкале для каждого изображения находятся в миллиметрах, с шагом 0,1 мм.
Примечание: Цветной Допплер режим и Допплер режим визуализации помогает с идентификации яичников интенсивность и направление потока.
4. Дизайн исследования
- Проверка цикла эструса по цитологии вагинальный мазок.
- Разделите всех крыс в двух группах. Для группы 1 или предварительно плодородные (или periovulatory) включают крысы, которые были в proestrus и эструса фазы цикла. Для группы 2 или после плодородные включают крысы, которые были в начале диэструса и конце диэструса фазы цикла.
- Отслеживать и сравнивать Антеро задний диаметр каждого рога матки в регионе середине наружного групп 1 и 2.
- Мониторинг и Сравнение толщины эндометрия и характеристики эндометрия в группах 1 и 2.
- Отслеживать и сравнивать размер (максимальные диаметры) и характеристики яичников, локализовать любой periovulatory фолликулов в обоих яичников в группах 1 и 2.
- Отслеживать и сравнивать маточной артерии кровотока в группах 1 и 2.
- Отслеживать и сравнивать маточной артерии поток крови беременных крыс в различных стадиях беременности (дней 9, 15 и 18 гестации).
- Выполнить используя SPSS статистический анализ. Представить данные как среднее ± стандартное отклонение (SD) или медиана с межквартильный диапазон. Анализировать результаты, используя t тест Стьюдента между различными группами. P-значение менее чем 0,05 считался статистически значимой разницы.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Там было без значительных различий в рога матки кзади Антеро диаметров или толщины эндометрия между двумя сторонами рога матки (Таблица 1). По сравнению с группой 2, средняя толщина эндометрия в группе 1 был толще, но не значительные различия (P > 0,05) были найдены между двумя группами (рис. 3). Тем не менее мы нашли жидкости внутри матки (в 8 из 28 крыс) вблизи цикл эструса, связанные с изменениями в эндометрии морфологии (рис. 2).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Из-за процедурных изменений и устранения неполадок, что требуется в этом исследовании, несмотря на нашей целью выявления все стадии эструса цикла у крыс с помощью ультразвука мы не смогли найти каких-либо существенных различий. Мы предполагаем, что эти трудности могут быть потому что цикл эструса длится только несколько дней в крыс, в отличие от цикла у женщин. Мы уверены, что все измерения были сделаны в ровно в нужное время, чтобы определить какие-либо различия. Поэтому мы перегруппировались эструса фаз цикла только дв...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Это исследование было поддержано животных экспериментов раздел Университета Мурсии и акушерства и гинекологии департамента Мурсия университета. Мы благодарим всех техников, работающих в CEIB (экспериментальный центр Ан Investigaciones Biomédicas), в разделе экспериментов на животных Университета Мурсии, которые сотрудничали на этот проект.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Vevo3100 система микровизуализации высокого разрешения in vivo* | Visual Sonics, inc. | www.visualsonics.com/products | |
| Интегрированная железнодорожная система Vevo, включающая блок физиологического мониторинга. | Компания Visual Sonics, inc. | www.visualsonics.com/products | |
| Преобразователь MX400 | Visual Sonics, inc. | www.visualsonics.com/products | |
| Программное обеспечение Vevo Lab Visual | Sonics, inc. | www.visualsonics.com/products | |
| HSD: Sprague Dawley SD | Envigo, inc. | ||
| Смазывающий гель | общего назначения | ||
| CIBERTEC CA-EAC20 Система тележек для анестезии | Cibertec S.A | Аппарат для анестезии | |
| Экогель 100 УЗИ | гель Eco-Med Pharmaceuticals Inc. | ||
| Лосьон для удаления волос (Nair) | Общий запас | ||
| Isoflurane | Esteve Veterinaria | Ингаляционная анестезия | |
| * Требуется программное обеспечение Vevo, включая приложение B-режима, приложение для допплерографии пульсовой волны и набор инструментов для анализа сосудистой деформации. |
Ссылки
- Hunter, R. K. II, et al. Adipose-Derived Stromal Vascular Fraction Cell Effects on a Rodent Model of Thin Endometrium. PLoS ONE. 10 (12), e0144823(2015).
- Wang, H., Dey, S. K. Roadmap to embryo implantation: clues from mouse models. Nat Rev Genet. 7 (3), 185-199 (2006).
- Pistner, A., Belmonte, S., Coulthard, T., Blaxall, B. C. Murine Echocardiography and Ultrasound Imaging. J Vis Exp. (42), (2010).
- Lohmiller, J. J., Swing, S. P. Reproduction and Breeding. The Laboratory Rat. , 2nd, Elsevier Academic Press. 147-164 (2006).
- Jaiswal, R. S., Singh, J., Adams, G. P. High-resolution ultrasound biomicroscopy for monitoring ovarian structures in mice. Reprod Biol Endocrinol. 7 (69), (2009).
- Kim, G. H. Murine Fetal Echocardiography. J Vis Exp. (72), (2013).
- Jing, Z., Qiong, Z., Yonggang, W., Yanping, L. Rat bone marrow mesenchymal stem cells improve regeneration of thin endometrium in rat. Fertil Steril. 101 (2), 587-594 (2014).
- Mu, J., Adamson, S. L. Developmental changes in hemodynamics of uterine artery, utero- and umbilicoplacental, and vitelline circulations in mouse throughout gestation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 291 (3), H1421-H1428 (2006).
- Anderson, C. M., Lopez, F., Zhang, H. Y., Pavlish, K., Benoit, J. N. Reduced uteroplacental perfusion alters uterine arcuate artery function in the pregnant Sprague-Dawley rat. Biol Reprod. 72 (3), 762-766 (2005).
- Hongmei, L., et al. Ultrasound Molecular Imaging of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2 Expression for Endometrial Receptivity Evaluation. Theranostics. 5 (2), 206-217 (2015).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
