Методическая статья

Живой изображений клеток первичной коры головного мозга, с использованием системы 2D культуры

DOI:

10.3791/56063

⸱

9 августа 2017 г.

 ,  ,  ,  , 
1Brain Institute, Federal University of Rio Grande do Norte, 2Department of Biosystems Science and Engineering, ETH Zurich, 3The Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Живая визуализация является мощным инструментом для изучения клеточного поведения в режиме реального времени. Здесь мы описываем протокол для покадровой видео микроскопии клетки первичной коры головного мозга, позволяющий подробного изучения фаз, принятый в ходе линии переход от первичного нервных стволовых клеток в дифференцированных нейронов и глии.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В ходе развития головного мозга клетки-предшественники пройти несколько раундов симметричных и асимметричных клеточных делений для создания новых прародителями или Постмитотические нейронов. Позже некоторые прародителями переключиться на gliogenic судьбы, добавив экзоцитоз и Олигодендроциты населению. Использование отснятого видео микроскопия культур клеток первичной коры головного мозга, это возможно для изучения молекулярных и клеточных механизмов, контролирующих режим деления клеток и клеточного цикла параметров клеток-предшественников. Аналогично судьба постмитотических клеток может проверяться с помощью клеток конкретных флуоресцентные репортер белки или после визуализации иммуноцитохимии. Что еще более важно все эти особенности могут быть проанализированы на уровне одной ячейки, позволяя идентификации прародителями, совершенные в поколение типов конкретных клеток. Манипуляция экспрессии генов также может выполняться с использованием вирусных опосредованной трансфекции, позволяя изучение клеток автономной и клеток неавтономной явлений. Наконец использование флуоресцентных белков фьюжн позволяет исследование симметричного и асимметричного распределения отдельных белков во время разделения и корреляции с судьбой клетки дочи. Здесь мы описываем метод покадровой видео микроскопии изображений первичной коры головного мозга мышиных клетки для до нескольких дней и анализировать режим деления клеток, длина клеточного цикла и судьба вновь сгенерированный клеток. Мы также описать простой метод для transfect клеток-предшественников, которые могут быть применены для манипулирования генов интерес или просто ярлык клетки с репортером белков.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нервные стволовые клетки (НСК) генерировать нейронов и macroglial клетки во время разработки коры головного мозга. В начале corticogenesis NSCs пройти несколько раундов симметричный деления клеток и расширение пула прародителя. Затем NSCs делят несимметрично сформировать нейронов, прямо или косвенно через промежуточные1. Только в середине - до конца corticogenesis, прародители переключиться генерировать астроциты и Олигодендроциты2,3,4. Однако полная механизмы, которые управляют клеточной пролиферации и дифференциации, а также вклада ограничено судьбы прародителями для генерации уникальных типов нейронов или macroglial клетки остаются считанные интенсивных дебатов4,5,6. Потенциал отдельных корковых NSCs для создания нейронов, астроциты и Олигодендроциты был широко изучены в пробирке и в естественных условиях с помощью множество методов, таких как: жить изображений в сингл клеточных культур,78,9,10,11,12,13; живут изображений в высокой плотности культур культур3,,1415; живут изображений в ломтик культур16,17,18; Клональный анализ с использованием вирусный вектор опосредованной генетических маркировки в высокой плотности культур14,15,19,,2021; Клональный анализ в естественных условиях с помощью ретровируса22,23,24,25,26,27,28,29,30,,3132,33; и Клональный анализ в естественных условиях с использованием трансгенные животные34.

Каждый из этих методов представлены плюсы и минусы. К примеру в естественных условиях трассировки линии подвержен комков и расщепления ошибки3, ведущих к противоречивые выводы о потенциале отдельных корковых прародителей. Кроме того как в пробирке и в vivo исследования на основе маркировки прогениторных клеток в начале моменты времени и задняя анализ линий клеток может зависеть от незамеченными наступления смерти клетки во время lineage прогрессии35. Таким образом приемлемую систему для анализа потенциальных возможностей одного NSCs должны позволить идентификации всех созданных клеток, а также соответствующие характеристики клеток судьбы в lineage. Сочетание культуры главной ячейки и живой изображений обеспечивает этот параметр. С помощью одной клеточной культуры и покадровой видео микроскопии, Храм et al. показали переключатель линии отдельных коре прародителей от нейрогенез глиогенез11. Позже они использовали ту же систему чтобы показать, что различные типы нейронов создаются из одного кортикального прародитель12. Однако, эта система представляет важное предостережение: только 1% кортикальной прародителей, изолированных в начале corticogenesis создавать клоны 4 или больше потомства9. После добавления FGF2 частота генерации 4 или более ячеек клеток увеличивается до 8-10%9. Тем не менее это число является слишком мала, учитывая, что практически все корковых прародителями пролиферативной на этой стадии. Кроме того нельзя исключать потенциальные последствия FGF2 на судьбу спецификации36. Чтобы обойти эти ограничения, мы использовали высокой плотности клеточных культур, которые поддерживают распространения обоих желудочков (Pax6-выражая) и субвентрикулярной корковых прародителями (Tbr2-выражая)15. Кроме того в реальном времени наблюдения этих культур показал, что некоторые особенности НСК линии прогрессии воспроизводятся в этих условиях, таких как режим деление клеток, удлинение клеточного цикла, потенциал одиночных клеток генерировать нейронов и глии, среди прочих3,15. Совсем недавно мы использовали эту систему чтобы показать, что CREB-сигнализации влияет на выживание клетки незрелые коре нейронов в мышей37. Таким образом, мы считаем, что промежуток времени видео микроскопия первичной мышиных коре клеток, выращиваемых в высокой плотности является мощным и доступным инструментом для изучения молекулярных и клеточных механизмов клеточного цикла прогрессии, режим деления клеток, выживаемость клеток и клеток судьба спецификации. Последний может осуществляться с помощью трансгенных животных, позволяя определение судьбы конкретных клеток на реальном времени38,,3940 или использование после визуализации immunocytochemistry3,38,,41-42.

Здесь мы предоставляем пошаговые протокол подготовить культуры клеток первичной коры головного мозга, поддержки распространения NSCs и последующее поколение нейронов и macroglial клеток. Мы также обсудим использование антиретровирусной опосредованной трансфекции манипулировать экспрессии генов отдельных клеток, которые могут быть определены и отслеживаются на уровне одной ячейки, используя покадровой видео микроскопии. Этот протокол может использоваться для изучения клетки первичной коры головного мозга, изолированные от начала до конца corticogenesis грызунов, но несколько корректировок, которые могут потребоваться согласно этап14. NSCs, изолированный от других источников также могут быть изучены с помощью покадровой видео микроскопии 2D культур, но соответствующие культивирования система должна определяться путем сравнения клеток поведений in vitro и in vivo38,43.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты с участием живых животных, описанные в этом протоколе, проводятся в соответствии с национальными и международными законами и были одобрены местным университетским комитетом по уходу и использованию животных (CEUA/UFRN) под лицензией 009/2014. Следующий протокол выполняется в стерильных условиях. Ожидается знакомство с основными культурами клеток.

1. Микродиссекция дорсолатерального конечного мозга

  1. Приготовьте среду для вскрытия (100 мл): 98,5 мл сбалансированного раствора соли Хенка (HBSS), 0,5 мл 5 М HEPES pH 7,4, 1 мл пенициллина/стрептомицина (10 000 единиц/мл и 10 000 мкг/мл).
  2. Процедить-простерилизовать диссекционную среду.
  3. Извлеките эмбрионы 14-го дня (E14) от беременной мыши C57/Bl6 (Mus musculus) под наркозом изофлурана.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рассматривайте E0 как день обнаружения вагинальной пробки. Вскрытие должно быть завершено не позднее 1 ч после удаления от беременной мыши. Этот протокол также распространяется на эмбрионы E11-E17.
  4. Извлеките эмбрионы методом гистерэктомии в стерильных условиях.
  5. Перенесите эмбрионы в чашку Петри со средой для холодной дисперсии (4 °C).
  6. Удалите мозги из черепа, разрезав вдоль продольной щели. Количество эмбрионов обычно варьируется от пяти до десяти. Каждый мозг E14 дает примерно 2 x 106 клеток, включая предшественников и постмитотические нейроны (соотношение 1:1)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте стереомикроскоп для выполнения следующих действий.
  7. Удалите мозговые оболочки с помощью щипцов для рассечения. Разделите конечный мозг посередине, чтобы отделить полушария. Чтобы изолировать дорсолатеральный конечный мозг, разрежьте вдоль дорсомедиальной кривой и паллиально-субпаллиальной границы с помощью щипцов для рассечения. Перенесите дорсолатеральный конечный мозг в трубку объемом 2 мл со средой для холодной диссекции (4 °C) до тех пор, пока не будут рассечены все мозги.

2. Диссоциация и покрытие клеток

  1. Приготовьте пролиферирующую среду (50 мл DMEM + 10% FCS): 44 мл модифицированной орлиной среды Dulbecco (DMEM), 5 мл сыворотки для телят плода (FCS), 0,5 мл 40% глюкозы, 0,5 мл пенициллина/стрептомицина (10 000 единиц/мл и 10 000 μг/мл). Отфильтруйте и простерилизуйте пролиферативную среду.
  2. Готовят среду для дифференцировки (50 мл DMEM+2% B27): 48 мл DMEM, 1 мл B27, 0,5 мл 40% глюкозы, 0,5 мл пенициллина/стрептомицина (10 000 ЕД/мл и 10 000 мкг/мл). Фильтруем-стерилизуем дифференцировочную среду.
  3. После микродиссекции дорсолатерального конечного мозга у мышей Е14 пробирку центрифугируют с собранной тканью и средой для холодной диссекции (в течение 5 мин при 4 °С, 340 х г) для осаждения ткани.
  4. Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки и добавьте 1 мл предварительно подогретого (37 °C) Trypsin-EDTA (0,05%) для химического переваривания. Инкубировать в течение 15 мин при 37 °C. Добавьте 2 мл пролиферативной среды, чтобы остановить активность трипсина.
  5. Отполируйте кончик стеклянной пастеровской пипетки над газовой горелкой или горелкой Бунзена в течение нескольких секунд, чтобы немного сузить отверстие. Промойте пипетку, отасунув FCS, чтобы покрыть наконечник. Избегая образования пузырей, механически диссоциируйте клетки с помощью дозатора Пастера, отполированного огнем и покрытого FCS.
  6. Центрифугируйте ячейки (в течение 5 мин при 4 °C, 340 x g). Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки. Добавьте 1 мл пролиферативной среды и ресуспендируйте клетки с помощью пипетки. Повторите этот шаг один раз.
  7. Приготовьте разведение клеточной суспензии в соотношении 1:1 с использованием 0,4% раствора Трипана Синего. Нежизнеспособные клетки будут синего цвета. Подсчитайте количество жизнеспособных клеток (неокрашенных) с помощью камеры Нейбауэра.
  8. Разбавьте клетки в пролиферирующей среде до получения10-6 клеток/мл. Добавьте 500 мкл клеточной суспензии в каждую лунку 24-луночного тканевого культурального планшета (примерно 2,5 × 105 клеток/см2). Инкубируйте клетки при 37 °C и 5% CO2,
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте стеклянные покровные стекла, так как они могут перемещаться во время эксперимента и менять поле наблюдения. В качестве альтернативы используйте планшеты для культивирования тканей со стеклянным дном.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы не используете мультидилевую обработку клеточных культур, важно предварительно обработать планшеты поли-D-лизином (50 мкг/мл) в течение 2 ч при 37 °C. Обработанные PDL планшеты можно хранить при температуре 4 °C после промывки дистиллированной водой.

3. Ретровирусно-опосредованная трансфекция

ПРИМЕЧАНИЕ: Это простой метод для трансфекции только клеток-предшественников. Тем не менее, другие вирусные векторы или химическая/электрическая трансфекция могут быть использованы для вставки генов, представляющих интерес, в культивируемые клетки.

  1. Чтобы манипулировать экспрессией генов и помечать клетки флуоресцентными репортерными белками, добавьте ретровирусы, несущие плазмиды с генами, представляющими интерес, через 2 ч после посева клеток.
    Примечание: Ретровирусные векторы интегрируются в геном только делящихся клеток. Поэтому важно инфицировать клетки при высокой пролиферации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали плазмиду, содержащую последовательность слияния бета-актина/ЦМВ (CAG) и внутренний сайт входа рибосомы (IRES), за которой следует кодирующая последовательность зеленого флуоресцентного белка (GFP), обозначенная как pCAG-IRES-GFP44. Гены, представляющие интерес, могут быть клонированы между промотором CAG и последовательностью IRES37.
  2. Разведите ретровирус в среде для дифференцировки для получения желаемого количества частиц на мл. Добавьте в каждую лунку по 500 мкл дифференцировочной среды с ретровирусом.
    Примечание: Количество используемого ретровируса зависит от его титра и должно быть рассчитано на получение от 50 до 100 инфицированных клеток в лунке. Этот титр позволяет идентифицировать изолированные GFP-экспрессирующие клоны, родство которых может быть дополнительно подтверждено отслеживанием фазово-контрастных изображений (см. раздел 6). Титрование ретровируса должно быть выполнено с использованием той же популяции клеток45.

4. Покадровая видеомикроскопия

ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого шага требуется инвертированный флуоресцентный микроскоп с инкубационной камерой (см. Таблицу материалов).

  1. После ретровирусной инфекции поместите планшет для культивирования тканей в инкубатор, подключенный к контроллерам температуры и CO2<. ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительный нагрев камеры в течение 3 часов перед началом съемки может помочь свести к минимуму дрейф и расфокусировку во время съемки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Камера должна поддерживать ячейки в постоянных условиях 37 °C и 5%CO2.
  2. Выберите положение на оси XY, которое будет служить нулевой точкой (XY = 0). Это позволит в будущем, например, после иммуноцитохимии после визуализации (см. раздел 5).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Желательно нарисовать на табличке знак, который можно использовать в качестве ориентира для определения нулевой точки.
  3. Выберите позиции для отображения с 10-кратным увеличением.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите 10-15 позиций в лунке, чтобы повысить вероятность наблюдения ретровирусно-трансфицированных клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объективы с большим увеличением на большом расстоянии (20X или 40X) можно использовать для получения изображений с более высоким разрешением. В зависимости от рабочего расстояния объективов могут потребоваться пластины со стеклянным дном.
  4. Получайте фазово-контрастные изображения каждые 5 минут и флуоресцентные изображения каждые 3 часа для снижения фототоксичности. Проверьте и отрегулируйте фокус в первые 3 часа эксперимента, так как он может измениться, пока температура уравновешивается. Ежедневно проверяйте и корректируйте фокусировку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы видим, что фокус становится стабильным после первых 24 часов. Тем не менее, рекомендуется следить за фокусировкой. В качестве альтернативы используйте программную систему автофокусировки.
  5. Через 7 дней следует прекратить сбор данных и приступить к иммуноцитохимии после визуализации (см. раздел «Побочные
    6. эффекты»).
  6. После иммуноцитохимии установите пластину на место в микроскопе-инкубаторе, найдите нулевую точку, сбросьте XYZ = 0 и перезагрузите эксперимент с сохраненными позициями. Получите флуоресцентные изображения для каждого положения с помощью соответствующих флуоресцентных фильтров.

5. Иммуноцитохимия после визуализации

  1. После 7 дней в культуре зафиксируйте клеточную культуру 4% фиксатором параформальдегида (PFA) в течение 15 минут при комнатной температуре.
    ВНИМАНИЕ: PFA токсичен и должен обрабатываться в вытяжном шкафу для химикатов.
  2. Промыть 0,5 мл PBS 0,1 М в течение 5 мин. Повторить 3 раза.
  3. Инкубировать в первичных антителах в течение ночи при 4 °C в 0,5% тритоне и 10% нормальной сыворотке крови коз в PBS 0,1 M.
    Примечание: Используйте антитела против белка, ассоциированного с микротрубочками 2 (MAP2) для подтверждения фенотипа нейронов (мышиный IgG1, 1:1000) и анти-GFP для мечения трансдуцированных клеток (куриное антитело, 1:500). Другие антитела могут быть использованы для обнаружения прогениторных или глиальных клеток.
  4. Промыть 0,5 мл PBS 0,1 М в течение 5 мин. Повторить 3 раза.
  5. Вторичные антитела разводят в 0,5% тритоне и 10% нормальной сыворотки крови коз в PBS 0,1 М и инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре. Рекомендуемое разведение: 1:1,000.
  6. Промыть 0,5 мл PBS 0,1 М в течение 5 мин. Повторить 3 раза.
  7. Для окрашивания ядер клетки инкубируют в течение 5 мин с 0,1 мкг/мл 4'6'-диамино-2-фенилиндона (DAPI) в PBS 0,1 М.
  8. Промыть 0,5 мл PBS 0,1 М в течение 5 мин. Повторить 3 раза.
  9. Держите клетки в PBS 0,1 М и защищайте от света (например, оберните пластину фольгой).

6. Отслеживание клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы кратко опишем основные шаги по анализу данных покадровой видеомикроскопии с помощью программного обеспечения The Tracking Tool (tTt), которое доступно по ссылке, предоставленной в Таблице материалов.

ПРИМЕЧАНИЕ: Если получение изображения выполняется с помощью другого программного обеспечения, импортируйте данные изображения с помощью tTt Converter, доступного в установщике tTt (ссылка указана в Таблице материалов). Принимаются только форматы изображений png, tif или jpg. Следуйте шагам, показанным на странице Рисунок 1 A - B после запуска конвертера tTt.

  1. Запустите программу tTt и выберите имя пользователя. Нажмите на кнопку "добавить пользователя" и "продолжить" (Рисунок 2A). Найдите и выберите "TTTWorkFolder" (рисунок 2B). Деревья родословных, статистика и экспортированные изображения будут сохранены в этой папке. Затем выберите эксперимент для анализа и загрузите его (рисунок 2B).
  2. Если изображения были ранее преобразованы с помощью tTt Converter, нажмите на "LogFileConverter" (Рисунок 3A) и укажите количество секунд между двумя последовательными временными точками в окне LogFileConverter. Нажмите на "Конвертировать файлы журнала для всего эксперимента" (Рисунок 1C).
  3. В списке изображений, которые появятся в окне tTt, выберите нужные изображения, которые загрузив вручную или воспользовавшись опцией, отображаемой в программе. Загрузите изображения (Рисунок 3).
  4. Выберите «Файл» > «Открыть > новую колонию». Нажмите на «Отслеживание», а затем «Начать отслеживание», чтобы начать отслеживание в выбранной позиции.
  5. Появится окно фильма (Рисунок 4). Выделите ячейку с помощью круга слежения и нажмите клавишу 0. Софт перейдет к следующему кадру. Продолжайте располагать круг отслеживания вокруг отслеживаемой ячейки с помощью мыши и нажимайте 0 в каждом кадре, чтобы добавить метку трека на ячейку.
  6. С помощью клавиш 1 и 3 перейдите к предыдущему или следующему кадру соответственно. Чтобы удалить след, просто нажмите на правильное положение для метки и нажмите 0.
  7. Если ячейка разделилась, выберите кнопку "разделить" (красный прямоугольник на рисунок 4). Продолжайте отслеживание одной дочерней ячейки, нажав Shift+D. Чтобы отследить вторую дочернюю ячейку, выделите ее в редакторе ячеек и нажмите F2.
  8. Если клетка погибла во время видеомикроскопии, выберите "апоптоз" (синий прямоугольник по адресу Рисунок 4).
    Примечание: Несмотря на то, что программное обеспечение помечает это событие как «апоптоз», другие механизмы могут быть ответственны за гибель клеток.
  9. Если ячейка выходит из поля наблюдения или смешивается с соседними ячейками, препятствуя отслеживанию, выберите "lost" (зеленый прямоугольник на рисунок 4).
  10. Чтобы остановить отслеживание и продолжить позже, нажмите на "interrupt" (фиолетовый прямоугольник по адресу Рисунок 4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В окне Редактор ячеек во время отслеживания будет сгенерировано дерево. Чтобы сохранить дерево происхождения, выберите Файл > Сохранить > Текущее дерево (в окне Редактор ячеек).
  11. Чтобы начать отслеживание другой ячейки, нажмите на ячейку правой кнопкой мыши или выберите ячейку левой кнопкой мыши и нажмите на «Отслеживание» > «Начать отслеживание».
  12. Чтобы экспортировать фильм с данными слежения, программное обеспечение не должно находиться в «режиме слежения». Чтобы выключить режим слежения, выполните шаг 6.10. В окне «Фильм» выберите «Экспортировать > фильм». Настройте формат, диапазон кадров, количество кадров в секунду и битрейт. Нажмите на кнопку "Начать экспорт".

7. Количественные оценки

ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько измерений могут быть выполнены с использованием данных видеомикроскопии46. Здесь мы опишем три возможности, которые будут проиллюстрированы далее в разделе «Репрезентативные результаты».

  1. Количественно оцените выживаемость клеток для каждой клеточной линии, разделив количество клеток, живущих в разные моменты времени, на общее количество клеток, созданных до того, как эти временные точки были достигнуты в отдельных клонах37.
  2. Количественно определите долю симметричного предшественника (SP, обе дочерние клетки продолжают пролиферировать), асимметричного (A, одна дочерняя клетка продолжает пролиферировать, а другая становится постмитотической) или симметричного терминала (ST, обе дочерние клетки становятся постмитотическими)15,38.
  3. Измерьте длину клеточного цикла, вычислив промежуток времени пролиферации клеток между их генерацией и делением class15.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Первичные культуры клеток коры головного мозга, выделенные из эмбрионов E14, содержат как клетки-предшественники, так и нейрональные клетки. В период визуализации предшественники проходят несколько раундов деления клеток, увеличивая количество клеток (Рисунок 5 и Видео Рисунок 1).

Ретровирусно-опосредованная трансфекция нескольких клеток-предшественников облегчает идентификацию клет...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Реальном времени наблюдения клеток первичной коры головного мозга позволяет анализ пролиферации клеток, режим деления клеток, длина клеточного цикла, дифференцировки клеток и клеток выживания3,14,15,37. Что еще более важно это позволяет исследование одноклеточных линий, ведущих к идентификации промежуточных этапов, принятый во время перехода от NSCs нейронов3. Наконец со...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e парке), накидки (повышению де Coordenação де Pessoal де уровня Superior) и FAPERN (Фонд-де-ампаро Pesquisa ду Риу-Гранди-ду-Норти).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS)Invitrogen Life Technologies14175129
HEPESSigma-AldrichH3375-25G
Пенициллин/стрептомицинGibco15140122
Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM)Gibco12400-024
Фетальная сыворотка для телят (FCS)Gibco10437028
ГлюкозаGibcoA2494001
B27Gibco17504044
трипсин-ЭДТА (0.05%)Gibco25300054
параформальдегидSigma16005
Козья сывороткаSigma-Aldrich69023
Triton X-100VWR International Ltd.306324N
ИзофлуранSigma792632
анти-MAP2, мышьSigmaM4403
анти-GFP курицаAves0511FP12
DAPISigmaD9542
Козья анти-мышь alexa 594InvitrogenA11005
Козья анти-курица alexa 488InvitrogenA11039
ImageJNIH
tTtETH Zurich
Cell Наблюдательный микроскопZeiss
Pasteur пипетка
PBS
The Tracking Tool (tTt) программное обеспечениеhttps://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.htmlссылка для скачивания

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
  2. Miller, F. D., Gauthier, A. S. Timing is everything: making neurons versus glia in the developing cortex. Neuron. 54 (3), 357-369 (2007).
  3. Costa, M. R., Bucholz, O., Schroeder, T., Götz, M. Late Origin of Glia-Restricted Progenitors in the Developing Mouse Cerebral Cortex. Cereb Cortex. 19 (Suppl 1), i135-i143 (2009).
  4. Knoblich, J. A. Mechanisms of asymmetric stem cell division. Cell. 132 (4), 583-597 (2008).
  5. Costa, M. R., Müller, U. Specification of excitatory neurons in the developing cerebral cortex: progenitor diversity and environmental influences. Front Cell Neurosci. 8, 449(2015).
  6. Schitine, C., Nogaroli, L., Costa, M. R., Hedin-Pereira, C. Astrocyte heterogeneity in the brain: from development to disease. Front Cell Neurosci. 9, 76(2015).
  7. Temple, S. Division and differentiation of isolated CNS blast cells in microculture. Nature. 340 (6233), 471-473 (1989).
  8. Davis, A. A., Temple, S. A self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex. Nature. 372 (6503), 263-266 (1994).
  9. Qian, X., Davis, A. A., Goderie, S. K., Temple, S. FGF2 concentration regulates the generation of neurons and glia from multipotent cortical stem cells. Neuron. 18 (1), 81-93 (1997).
  10. Qian, X., Goderie, S. K., Shen, Q., Stern, J. H., Temple, S. Intrinsic programs of patterned cell lineages in isolated vertebrate CNS ventricular zone cells. Development. 125 (16), 3143-3152 (1998).
  11. Qian, X., et al. Timing of CNS cell generation: a programmed sequence of neuron and glial cell production from isolated murine cortical stem cells. Neuron. 28 (1), 69-80 (2000).
  12. Shen, Q., et al. The timing of cortical neurogenesis is encoded within lineages of individual progenitor cells. Nat Neurosci. 9 (6), 743-751 (2006).
  13. Ravin, R., et al. Potency and fate specification in CNS stem cell populations in vitro. Cell Stem Cell. 3 (6), 670-680 (2008).
  14. Costa, M. R., Kessaris, N., Richardson, W. D., Götz, M., Hedin-Pereira, C. The marginal zone/layer I as a novel niche for neurogenesis and gliogenesis in developing cerebral cortex. J Neurosci. 27 (42), 11376-11388 (2007).
  15. Costa, M. R., Wen, G., Lepier, A., Schroeder, T., Götz, M. Par-complex proteins promote proliferative progenitor divisions in the developing mouse cerebral cortex. Development. 135 (1), 11-22 (2008).
  16. Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7 (2), 136-144 (2004).
  17. Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Kriegstein, A. R. Distinct behaviors of neural stem and progenitor cells underlie cortical neurogenesis. J Comp Neurol. 508 (1), 28-44 (2008).
  18. Bultje, R. S., Castaneda-Castellanos, D. R., Jan, L. Y., Jan, Y. N., Kriegstein, A. R., Shi, S. H. Mammalian Par3 regulates progenitor cell asymmetric division via notch signaling in the developing neocortex. Neuron. 63 (2), 189-202 (2009).
  19. Williams, B. P., Read, J., Price, J. The generation of neurons and oligodendrocytes from a common precursor cell. Neuron. 7 (4), 685-693 (1991).
  20. Williams, B. P., Read, J., Price, J. Evidence for multiple precursor cell types in the embryonic rat cerebral cortex. Neuron. 14 (6), 1181-1188 (1995).
  21. Heins, N., et al. Glial cells generate neurons: the role of the transcription factor Pax6. Nat Neurosci. 5 (4), 308-315 (2002).
  22. Luskin, M. B., Pearlman, A. L., Sanes, J. R. Cell lineage in the cerebral cortex of the mouse studied in vivo and in vitro with a recombinant retrovirus. Neuron. 1 (8), 635-647 (1988).
  23. Luskin, M. B., Parnavelas, J. G., Barfield, J. A. Neurons, astrocytes, and oligodendrocytes of the rat cerebral cortex originate from separate progenitor cells: an ultrastructural analysis of clonally related cells. J Neurosci. 13 (4), 1730-1750 (1993).
  24. Price, J., Thurlow, L. Cell lineage in the rat cerebral cortex: a study using retroviral-mediated gene transfer. Development. 104 (3), 473-482 (1988).
  25. Walsh, C., Cepko, C. L. Clonally related cortical cells show several migration patterns. Science. 241 (4871), 1342-1345 (1988).
  26. Walsh, C., Cepko, C. L. Widespread dispersion of neuronal clones across functional regions of the cerebral cortex. Science. 255 (5043), 434-440 (1992).
  27. Parnavelas, J. G., Barfield, J. A., Franke, E., Luskin, M. B. Separate progenitor cells give rise to pyramidal and nonpyramidal neurons in the rat telencephalon. Cereb Cortex. 1 (6), 463-468 (1991).
  28. Grove, E. A., Williams, B. P., Li, D. Q., Hajihosseini, M., Friedrich, A., Price, J. Multiple restricted lineages in the embryonic rat cerebral cortex. Development. 117 (2), 553-561 (1993).
  29. Mione, M. C., Danevic, C., Boardman, P., Harris, B., Parnavelas, J. G. Lineage analysis reveals neurotransmitter (GABA or glutamate) but not calcium-binding protein homogeneity in clonally related cortical neurons. J Neurosci. 14 (1), 107-123 (1994).
  30. Mione, M. C., Cavanagh, J. F., Harris, B., Parnavelas, J. G. Cell fate specification and symmetrical/asymmetrical divisions in the developing cerebral cortex. J Neurosci. 17 (6), 2018-2029 (1997).
  31. Reid, C. B., Liang, I., Walsh, C. Systematic widespread clonal organization in cerebral cortex. Neuron. 15 (2), 299-310 (1995).
  32. McCarthy, M., Turnbull, D. H., Walsh, C. A., Fishell, G. Telencephalic neural progenitors appear to be restricted to regional and glial fates before the onset of neurogenesis. J Neurosci. 21 (17), 6772-6781 (2001).
  33. Reid, C. B., Walsh, C. A. Evidence of common progenitors and patterns of dispersion in rat striatum and cerebral cortex. J Neurosci. 22 (10), 4002-4014 (2002).
  34. Gao, P., et al. Deterministic progenitor behavior and unitary production of neurons in the neocortex. Cell. 159 (4), 775-788 (2014).
  35. Schroeder, T. Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals. Nature. 453 (7193), 345-351 (2008).
  36. Morrow, T., Song, M. R., Ghosh, A. Sequential specification of neurons and glia by developmentally regulated extracellular factors. Development. 128 (18), 3585-3594 (2001).
  37. Landeira, B. S., et al. Activity-Independent Effects of CREB on Neuronal Survival and Differentiation during Mouse Cerebral Cortex Development. Cereb Cortex. , 1-11 (2016).
  38. Costa, M. R., et al. Continuous live imaging of adult neural stem cell division and lineage progression in vitro. Development. 138 (6), 1057-1068 (2011).
  39. Pilaz, L. J., et al. Prolonged Mitosis of Neural Progenitors Alters Cell Fate in the Developing Brain. Neuron. 89 (1), 83-99 (2016).
  40. Hoppe, P. S., et al. Early myeloid lineage choice is not initiated by random PU.1 to GATA1 protein ratios. Nature. 535 (7611), 299-302 (2016).
  41. Gomes, F. L., et al. Reconstruction of rat retinal progenitor cell lineages in vitro reveals a surprising degree of stochasticity in cell fate decisions. Development. 138 (2), 227-235 (2011).
  42. Ortega, F., Berninger, B., Costa, M. R. Primary culture and live imaging of adult neural stem cells and their progeny. Methods Mol Biol. 1052, 1-11 (2013).
  43. Ponti, G., Obernier, K., Guinto, C., Jose, L., Bonfanti, L., Alvarez-Buylla, A. Cell cycle and lineage progression of neural progenitors in the ventricular-subventricular zones of adult mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (11), E1045-E1054 (2013).
  44. Jagasia, R., et al. GABA-cAMP response element-binding protein signaling regulates maturation and survival of newly generated neurons in the adult hippocampus. J Neurosci. 29 (25), 7966-7977 (2009).
  45. Costa, M. R., Jagasia, R., Berninger, B. Directed Neuronal Differentiation of Embryonic and Adult-Derived Neurosphere Cells. Protocols for Neural Cell Culture. Doering, L. C. , Humana Press. New York. 29-49 (2009).
  46. Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotechnol. 34 (7), 703-706 (2016).
  47. Ortega, F., et al. Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level. Nat Protoc. 6 (12), 1847-1859 (2011).
  48. Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. Jr The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15 (9), 6046-6057 (1995).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи