Живой изображений клеток первичной коры головного мозга, с использованием системы 2D культуры

Нервные стволовые клетки (НСК) генерировать нейронов и macroglial клетки во время разработки коры головного мозга. В начале corticogenesis NSCs пройти несколько раундов симметричный деления клеток и расширение пула прародителя. Затем NSCs делят несимметрично сформировать нейронов, прямо или косвенно через промежуточные¹. Только в середине - до конца corticogenesis, прародители переключиться генерировать астроциты и Олигодендроциты^2,3,4. Однако полная механизмы, которые управляют клеточной пролиферации и дифференциации, а также вклада ограничено судьбы прародителями для генерации уникальных типов нейронов или macroglial клетки остаются считанные интенсивных дебатов^4,5,6. Потенциал отдельных корковых NSCs для создания нейронов, астроциты и Олигодендроциты был широко изучены в пробирке и в естественных условиях с помощью множество методов, таких как: жить изображений в сингл клеточных культур^{,78,9,10,11,12,13}; живут изображений в высокой плотности культур культур^3,,1415; живут изображений в ломтик культур^16,17,18; Клональный анализ с использованием вирусный вектор опосредованной генетических маркировки в высокой плотности культур^{14,15,19,,2021}; Клональный анализ в естественных условиях с помощью ретровируса^{22,23,24,25,26,27,28,29,30,,3132,33}; и Клональный анализ в естественных условиях с использованием трансгенные животные³⁴.

Каждый из этих методов представлены плюсы и минусы. К примеру в естественных условиях трассировки линии подвержен комков и расщепления ошибки³, ведущих к противоречивые выводы о потенциале отдельных корковых прародителей. Кроме того как в пробирке и в vivo исследования на основе маркировки прогениторных клеток в начале моменты времени и задняя анализ линий клеток может зависеть от незамеченными наступления смерти клетки во время lineage прогрессии³⁵. Таким образом приемлемую систему для анализа потенциальных возможностей одного NSCs должны позволить идентификации всех созданных клеток, а также соответствующие характеристики клеток судьбы в lineage. Сочетание культуры главной ячейки и живой изображений обеспечивает этот параметр. С помощью одной клеточной культуры и покадровой видео микроскопии, Храм et al. показали переключатель линии отдельных коре прародителей от нейрогенез глиогенез¹¹. Позже они использовали ту же систему чтобы показать, что различные типы нейронов создаются из одного кортикального прародитель¹². Однако, эта система представляет важное предостережение: только 1% кортикальной прародителей, изолированных в начале corticogenesis создавать клоны 4 или больше потомства⁹. После добавления FGF2 частота генерации 4 или более ячеек клеток увеличивается до 8-10%⁹. Тем не менее это число является слишком мала, учитывая, что практически все корковых прародителями пролиферативной на этой стадии. Кроме того нельзя исключать потенциальные последствия FGF2 на судьбу спецификации³⁶. Чтобы обойти эти ограничения, мы использовали высокой плотности клеточных культур, которые поддерживают распространения обоих желудочков (Pax6-выражая) и субвентрикулярной корковых прародителями (Tbr2-выражая)¹⁵. Кроме того в реальном времени наблюдения этих культур показал, что некоторые особенности НСК линии прогрессии воспроизводятся в этих условиях, таких как режим деление клеток, удлинение клеточного цикла, потенциал одиночных клеток генерировать нейронов и глии, среди прочих^3,15. Совсем недавно мы использовали эту систему чтобы показать, что CREB-сигнализации влияет на выживание клетки незрелые коре нейронов в мышей³⁷. Таким образом, мы считаем, что промежуток времени видео микроскопия первичной мышиных коре клеток, выращиваемых в высокой плотности является мощным и доступным инструментом для изучения молекулярных и клеточных механизмов клеточного цикла прогрессии, режим деления клеток, выживаемость клеток и клеток судьба спецификации. Последний может осуществляться с помощью трансгенных животных, позволяя определение судьбы конкретных клеток на реальном времени^38,,3940 или использование после визуализации immunocytochemistry^3,38,,41-⁴².

Здесь мы предоставляем пошаговые протокол подготовить культуры клеток первичной коры головного мозга, поддержки распространения NSCs и последующее поколение нейронов и macroglial клеток. Мы также обсудим использование антиретровирусной опосредованной трансфекции манипулировать экспрессии генов отдельных клеток, которые могут быть определены и отслеживаются на уровне одной ячейки, используя покадровой видео микроскопии. Этот протокол может использоваться для изучения клетки первичной коры головного мозга, изолированные от начала до конца corticogenesis грызунов, но несколько корректировок, которые могут потребоваться согласно этап¹⁴. NSCs, изолированный от других источников также могут быть изучены с помощью покадровой видео микроскопии 2D культур, но соответствующие культивирования система должна определяться путем сравнения клеток поведений in vitro и in vivo^38,43.

Все эксперименты с участием живых животных, описанные в этом протоколе, проводятся в соответствии с национальными и международными законами и были одобрены местным университетским комитетом по уходу и использованию животных (CEUA/UFRN) под лицензией 009/2014. Следующий протокол выполняется в стерильных условиях. Ожидается знакомство с основными культурами клеток.

1. Микродиссекция дорсолатерального конечного мозга

1. Приготовьте среду для вскрытия (100 мл): 98,5 мл сбалансированного раствора соли Хенка (HBSS), 0,5 мл 5 М HEPES pH 7,4, 1 мл пенициллина/стрептомицина (10 000 единиц/мл и 10 000 мкг/мл).
2. Процедить-простерилизовать диссекционную среду.
3. Извлеките эмбрионы 14-го дня (E14) от беременной мыши C57/Bl6 (Mus musculus) под наркозом изофлурана.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рассматривайте E0 как день обнаружения вагинальной пробки. Вскрытие должно быть завершено не позднее 1 ч после удаления от беременной мыши. Этот протокол также распространяется на эмбрионы E11-E17.
4. Извлеките эмбрионы методом гистерэктомии в стерильных условиях.
5. Перенесите эмбрионы в чашку Петри со средой для холодной дисперсии (4 °C).
6. Удалите мозги из черепа, разрезав вдоль продольной щели. Количество эмбрионов обычно варьируется от пяти до десяти. Каждый мозг E14 дает примерно 2 x 10⁶ клеток, включая предшественников и постмитотические нейроны (соотношение 1:1)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте стереомикроскоп для выполнения следующих действий.
7. Удалите мозговые оболочки с помощью щипцов для рассечения. Разделите конечный мозг посередине, чтобы отделить полушария. Чтобы изолировать дорсолатеральный конечный мозг, разрежьте вдоль дорсомедиальной кривой и паллиально-субпаллиальной границы с помощью щипцов для рассечения. Перенесите дорсолатеральный конечный мозг в трубку объемом 2 мл со средой для холодной диссекции (4 °C) до тех пор, пока не будут рассечены все мозги.

2. Диссоциация и покрытие клеток

1. Приготовьте пролиферирующую среду (50 мл DMEM + 10% FCS): 44 мл модифицированной орлиной среды Dulbecco (DMEM), 5 мл сыворотки для телят плода (FCS), 0,5 мл 40% глюкозы, 0,5 мл пенициллина/стрептомицина (10 000 единиц/мл и 10 000 μг/мл). Отфильтруйте и простерилизуйте пролиферативную среду.
2. Готовят среду для дифференцировки (50 мл DMEM+2% B27): 48 мл DMEM, 1 мл B27, 0,5 мл 40% глюкозы, 0,5 мл пенициллина/стрептомицина (10 000 ЕД/мл и 10 000 мкг/мл). Фильтруем-стерилизуем дифференцировочную среду.
3. После микродиссекции дорсолатерального конечного мозга у мышей Е14 пробирку центрифугируют с собранной тканью и средой для холодной диссекции (в течение 5 мин при 4 °С, 340 х г) для осаждения ткани.
4. Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки и добавьте 1 мл предварительно подогретого (37 °C) Trypsin-EDTA (0,05%) для химического переваривания. Инкубировать в течение 15 мин при 37 °C. Добавьте 2 мл пролиферативной среды, чтобы остановить активность трипсина.
5. Отполируйте кончик стеклянной пастеровской пипетки над газовой горелкой или горелкой Бунзена в течение нескольких секунд, чтобы немного сузить отверстие. Промойте пипетку, отасунув FCS, чтобы покрыть наконечник. Избегая образования пузырей, механически диссоциируйте клетки с помощью дозатора Пастера, отполированного огнем и покрытого FCS.
6. Центрифугируйте ячейки (в течение 5 мин при 4 °C, 340 x g). Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки. Добавьте 1 мл пролиферативной среды и ресуспендируйте клетки с помощью пипетки. Повторите этот шаг один раз.
7. Приготовьте разведение клеточной суспензии в соотношении 1:1 с использованием 0,4% раствора Трипана Синего. Нежизнеспособные клетки будут синего цвета. Подсчитайте количество жизнеспособных клеток (неокрашенных) с помощью камеры Нейбауэра.
8. Разбавьте клетки в пролиферирующей среде до получения^10-6 клеток/мл. Добавьте 500 мкл клеточной суспензии в каждую лунку 24-луночного тканевого культурального планшета (примерно 2,5 × 10⁵ клеток/^см2). Инкубируйте клетки при 37 °C и 5% CO₂,
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте стеклянные покровные стекла, так как они могут перемещаться во время эксперимента и менять поле наблюдения. В качестве альтернативы используйте планшеты для культивирования тканей со стеклянным дном.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы не используете мультидилевую обработку клеточных культур, важно предварительно обработать планшеты поли-D-лизином (50 мкг/мл) в течение 2 ч при 37 °C. Обработанные PDL планшеты можно хранить при температуре 4 °C после промывки дистиллированной водой.

3. Ретровирусно-опосредованная трансфекция

ПРИМЕЧАНИЕ: Это простой метод для трансфекции только клеток-предшественников. Тем не менее, другие вирусные векторы или химическая/электрическая трансфекция могут быть использованы для вставки генов, представляющих интерес, в культивируемые клетки.

1. Чтобы манипулировать экспрессией генов и помечать клетки флуоресцентными репортерными белками, добавьте ретровирусы, несущие плазмиды с генами, представляющими интерес, через 2 ч после посева клеток.
   Примечание: Ретровирусные векторы интегрируются в геном только делящихся клеток. Поэтому важно инфицировать клетки при высокой пролиферации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали плазмиду, содержащую последовательность слияния бета-актина/ЦМВ (CAG) и внутренний сайт входа рибосомы (IRES), за которой следует кодирующая последовательность зеленого флуоресцентного белка (GFP), обозначенная как pCAG-IRES-GFP⁴⁴. Гены, представляющие интерес, могут быть клонированы между промотором CAG и последовательностью IRES³⁷.
2. Разведите ретровирус в среде для дифференцировки для получения желаемого количества частиц на мл. Добавьте в каждую лунку по 500 мкл дифференцировочной среды с ретровирусом.
   Примечание: Количество используемого ретровируса зависит от его титра и должно быть рассчитано на получение от 50 до 100 инфицированных клеток в лунке. Этот титр позволяет идентифицировать изолированные GFP-экспрессирующие клоны, родство которых может быть дополнительно подтверждено отслеживанием фазово-контрастных изображений (см. раздел 6). Титрование ретровируса должно быть выполнено с использованием той же популяции клеток⁴⁵.

4. Покадровая видеомикроскопия

ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого шага требуется инвертированный флуоресцентный микроскоп с инкубационной камерой (см. Таблицу материалов).

1. После ретровирусной инфекции поместите планшет для культивирования тканей в инкубатор, подключенный к контроллерам температуры и CO₂<. ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительный нагрев камеры в течение 3 часов перед началом съемки может помочь свести к минимуму дрейф и расфокусировку во время съемки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Камера должна поддерживать ячейки в постоянных условиях 37 °C и 5%_CO2.
2. Выберите положение на оси XY, которое будет служить нулевой точкой (XY = 0). Это позволит в будущем, например, после иммуноцитохимии после визуализации (см. раздел 5).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Желательно нарисовать на табличке знак, который можно использовать в качестве ориентира для определения нулевой точки.
3. Выберите позиции для отображения с 10-кратным увеличением.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите 10-15 позиций в лунке, чтобы повысить вероятность наблюдения ретровирусно-трансфицированных клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Объективы с большим увеличением на большом расстоянии (20X или 40X) можно использовать для получения изображений с более высоким разрешением. В зависимости от рабочего расстояния объективов могут потребоваться пластины со стеклянным дном.
4. Получайте фазово-контрастные изображения каждые 5 минут и флуоресцентные изображения каждые 3 часа для снижения фототоксичности. Проверьте и отрегулируйте фокус в первые 3 часа эксперимента, так как он может измениться, пока температура уравновешивается. Ежедневно проверяйте и корректируйте фокусировку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы видим, что фокус становится стабильным после первых 24 часов. Тем не менее, рекомендуется следить за фокусировкой. В качестве альтернативы используйте программную систему автофокусировки.
5. Через 7 дней следует прекратить сбор данных и приступить к иммуноцитохимии после визуализации (см. раздел «Побочные
эффекты»).
6. После иммуноцитохимии установите пластину на место в микроскопе-инкубаторе, найдите нулевую точку, сбросьте XYZ = 0 и перезагрузите эксперимент с сохраненными позициями. Получите флуоресцентные изображения для каждого положения с помощью соответствующих флуоресцентных фильтров.

5. Иммуноцитохимия после визуализации

1. После 7 дней в культуре зафиксируйте клеточную культуру 4% фиксатором параформальдегида (PFA) в течение 15 минут при комнатной температуре.
   ВНИМАНИЕ: PFA токсичен и должен обрабатываться в вытяжном шкафу для химикатов.
2. Промыть 0,5 мл PBS 0,1 М в течение 5 мин. Повторить 3 раза.
3. Инкубировать в первичных антителах в течение ночи при 4 °C в 0,5% тритоне и 10% нормальной сыворотке крови коз в PBS 0,1 M.
   Примечание: Используйте антитела против белка, ассоциированного с микротрубочками 2 (MAP2) для подтверждения фенотипа нейронов (мышиный IgG1, 1:1000) и анти-GFP для мечения трансдуцированных клеток (куриное антитело, 1:500). Другие антитела могут быть использованы для обнаружения прогениторных или глиальных клеток.
4. Промыть 0,5 мл PBS 0,1 М в течение 5 мин. Повторить 3 раза.
5. Вторичные антитела разводят в 0,5% тритоне и 10% нормальной сыворотки крови коз в PBS 0,1 М и инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре. Рекомендуемое разведение: 1:1,000.
6. Промыть 0,5 мл PBS 0,1 М в течение 5 мин. Повторить 3 раза.
7. Для окрашивания ядер клетки инкубируют в течение 5 мин с 0,1 мкг/мл 4'6'-диамино-2-фенилиндона (DAPI) в PBS 0,1 М.
8. Промыть 0,5 мл PBS 0,1 М в течение 5 мин. Повторить 3 раза.
9. Держите клетки в PBS 0,1 М и защищайте от света (например, оберните пластину фольгой).

6. Отслеживание клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мы кратко опишем основные шаги по анализу данных покадровой видеомикроскопии с помощью программного обеспечения The Tracking Tool (tTt), которое доступно по ссылке, предоставленной в Таблице материалов.

ПРИМЕЧАНИЕ: Если получение изображения выполняется с помощью другого программного обеспечения, импортируйте данные изображения с помощью tTt Converter, доступного в установщике tTt (ссылка указана в Таблице материалов). Принимаются только форматы изображений png, tif или jpg. Следуйте шагам, показанным на странице Рисунок 1 A - B после запуска конвертера tTt.

1. Запустите программу tTt и выберите имя пользователя. Нажмите на кнопку "добавить пользователя" и "продолжить" (Рисунок 2A). Найдите и выберите "TTTWorkFolder" (рисунок 2B). Деревья родословных, статистика и экспортированные изображения будут сохранены в этой папке. Затем выберите эксперимент для анализа и загрузите его (рисунок 2B).
2. Если изображения были ранее преобразованы с помощью tTt Converter, нажмите на "LogFileConverter" (Рисунок 3A) и укажите количество секунд между двумя последовательными временными точками в окне LogFileConverter. Нажмите на "Конвертировать файлы журнала для всего эксперимента" (Рисунок 1C).
3. В списке изображений, которые появятся в окне tTt, выберите нужные изображения, которые загрузив вручную или воспользовавшись опцией, отображаемой в программе. Загрузите изображения (Рисунок 3).
4. Выберите «Файл» > «Открыть > новую колонию». Нажмите на «Отслеживание», а затем «Начать отслеживание», чтобы начать отслеживание в выбранной позиции.
5. Появится окно фильма (Рисунок 4). Выделите ячейку с помощью круга слежения и нажмите клавишу 0. Софт перейдет к следующему кадру. Продолжайте располагать круг отслеживания вокруг отслеживаемой ячейки с помощью мыши и нажимайте 0 в каждом кадре, чтобы добавить метку трека на ячейку.
6. С помощью клавиш 1 и 3 перейдите к предыдущему или следующему кадру соответственно. Чтобы удалить след, просто нажмите на правильное положение для метки и нажмите 0.
7. Если ячейка разделилась, выберите кнопку "разделить" (красный прямоугольник на рисунок 4). Продолжайте отслеживание одной дочерней ячейки, нажав Shift+D. Чтобы отследить вторую дочернюю ячейку, выделите ее в редакторе ячеек и нажмите F2.
8. Если клетка погибла во время видеомикроскопии, выберите "апоптоз" (синий прямоугольник по адресу Рисунок 4).
   Примечание: Несмотря на то, что программное обеспечение помечает это событие как «апоптоз», другие механизмы могут быть ответственны за гибель клеток.
9. Если ячейка выходит из поля наблюдения или смешивается с соседними ячейками, препятствуя отслеживанию, выберите "lost" (зеленый прямоугольник на рисунок 4).
10. Чтобы остановить отслеживание и продолжить позже, нажмите на "interrupt" (фиолетовый прямоугольник по адресу Рисунок 4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В окне Редактор ячеек во время отслеживания будет сгенерировано дерево. Чтобы сохранить дерево происхождения, выберите Файл > Сохранить > Текущее дерево (в окне Редактор ячеек).
11. Чтобы начать отслеживание другой ячейки, нажмите на ячейку правой кнопкой мыши или выберите ячейку левой кнопкой мыши и нажмите на «Отслеживание» > «Начать отслеживание».
12. Чтобы экспортировать фильм с данными слежения, программное обеспечение не должно находиться в «режиме слежения». Чтобы выключить режим слежения, выполните шаг 6.10. В окне «Фильм» выберите «Экспортировать > фильм». Настройте формат, диапазон кадров, количество кадров в секунду и битрейт. Нажмите на кнопку "Начать экспорт".

7. Количественные оценки

ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько измерений могут быть выполнены с использованием данных видеомикроскопии⁴⁶. Здесь мы опишем три возможности, которые будут проиллюстрированы далее в разделе «Репрезентативные результаты».

1. Количественно оцените выживаемость клеток для каждой клеточной линии, разделив количество клеток, живущих в разные моменты времени, на общее количество клеток, созданных до того, как эти временные точки были достигнуты в отдельных клонах³⁷.
2. Количественно определите долю симметричного предшественника (SP, обе дочерние клетки продолжают пролиферировать), асимметричного (A, одна дочерняя клетка продолжает пролиферировать, а другая становится постмитотической) или симметричного терминала (ST, обе дочерние клетки становятся постмитотическими)^15,38.
3. Измерьте длину клеточного цикла, вычислив промежуток времени пролиферации клеток между их генерацией и делением class¹⁵.

Первичные культуры клеток коры головного мозга, выделенные из эмбрионов E14, содержат как клетки-предшественники, так и нейрональные клетки. В период визуализации предшественники проходят несколько раундов деления клеток, увеличивая количество клеток (Рисунок 5 и Видео Рисунок 1).

Ретровирусно-опосредованная трансфекция нескольких клеток-предшественников облегчает идентификацию клеточных клонов (Рисунок 6). Обратите внимание, что экспрессия GFP обнаруживается через 24 часа. На данном этапе времени можно идентифицировать GFP-экспрессирующие клетки на фазово-контрастных изображениях и отследить их до завершения линии. Включенные здесь изображения GFP не имеют хорошего контраста, потому что: 1) эндогенная экспрессия GFP наблюдалась через несколько дней после ретровирусной трансдукции; 2) изображения были получены с помощью объектива с 10-кратным расстоянием через пластиковое дно 24-луночного планшета; и 3) время воздействия флуоресценции установлено на минимальное обнаружение сигнала GFP без повреждения клеток (фототоксичность).

Отслеживание отдельных клеток-предшественников генерирует деревья родословных, раскрывающие важную информацию об их родословных (Рисунок 7). Основываясь на этих деревьях линий, мы можем оценить клональную связь между дифференцированными клетками, измерить продолжительность клеточного цикла, оценить режим деления клеток на основе пролиферативного поведения дочерних клеток (симметричный пролиферативный - обе дочерние клетки подвергаются новому циклу клеточного деления; Асимметричная – одна дочерняя клетка претерпевает новый цикл клеточного деления, а другая становится постмитотической; Симметричный терминал - обе дочерние клетки становятся постмитотическими) и количественно измеряют выживаемость клеток, скорость клеток и скорость роста клеток3,15,37,47.

После визуализации иммуноцитохимия с использованием антител против нейронального маркера MAP2 и репортерного белка GFP показывает дифференцированные нейроны и ненейрональные клетки, сгенерированные из корковых предшественников, которые были отслежены (Рисунок 8).

Рисунок 1. Использование "tTt Converter" для анализа покадровой съемки, полученной из другого программного обеспечения. (A) Просмотрите данные изображения, чтобы добавить их непосредственно в папку ввода (красный прямоугольник). Активируйте функцию "Анализировать метаинформацию из имен файлов изображений" для различных позиций, каналов изображения или z-индексов (красная стрелка). tTt Converter автоматически преобразует 16-битные изображения в 8-битные, однако для указания точки черного и белого для каждого канала изображения необходимо включить опцию "Установить 16-битную на 8-битную черную/белую точку". Более подробная информация об этом шаге доступна в разделе "Как установить bp/wp для каждого канала" внизу (красная стрелка). После редактирования раздела «Метаинформация эксперимента» найдите папку назначения (синий прямоугольник) и нажмите «Конвертировать x изображений» (оранжевый прямоугольник). (B) Окно завершенного преобразования. (C) Определение секунд в виде фиксированного интервала в окне "tTt Log File Converter" (красная стрелка) перед загрузкой изображений для отслеживания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2. Отбор эксперимента на tTt. (A) В окне запроса пользователя нажмите «Добавить пользователя» и введите инициалы пользователя, а затем выберите опцию «Продолжить». (B) Найдите папку для анализа в разделе "TTTWorkFolder" (красный прямоугольник) и выберите эксперимент в разделе "Папка эксперимента" (синий прямоугольник). Далее загрузите эксперимент (красная стрелка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3. Подбор изображений. (A) Выберите положение для анализа (красный прямоугольник). Если изображения были преобразованы, нажмите на "LogFileConverter" и действуйте, как показано на рисунке Рисунок 1C. (B) Выберите нижнюю часть «все» (красный прямоугольник) и загрузите изображения (синий прямоугольник). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4. Окно слежения. (A) Отрегулируйте яркость и контрастность с помощью кнопки «настроить гамму» и выберите опцию «Деление» (красный прямоугольник), «Апоптоз» (синий прямоугольник), «Потеря» (зеленый прямоугольник) или «Прерывание» (фиолетовый прямоугольник) для деления клетки, гибели клетки, потери клетки или остановки отслеживания соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5. Фазово-контрастные изображения, полученные методом покадровой видеомикроскопии в разные моменты времени. (А-Н) Микрофотографии, показывающие фазово-контрастные изображения культуры клеток первичной коры головного мозга в (A) день 0, 04 ч 15 мин 20 с, (B) день 0, 12 ч 20 мин 29 с, (C) день 0, 20 ч 27 мин 09 с, (D) день 1, 04 ч 41 мин 26 с, (E) день 1, 12 ч 45 мин 57 с, (F) День 1, 20 ч 50 мин 33 с, (G) День 2, 04 ч 54 мин 52 с, и (H) День 2, 12 ч 59 мин 15 с. Обратите внимание на значительное увеличение плотности клеток с течением времени. Масштабная линейка: 50 μm Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6. Экспрессия GFP в ретровирусно-трансдуцированных клетках. Фазово-контрастные изображения (A-G) и флуоресцентные изображения GFP (A'-G') в одной и той же временной точке. Обратите внимание, что экспрессия GFP отсутствует в течение первых часов визуализации и со временем начинает увеличиваться. (А-А') День 0, 16 ч 01 мин 05 с, (B-B') День 0, 21 ч 49 мин 26 с, (C-C') День 1, 06 ч 29 мин 33 с, (D-D') День 1, 15 ч 35 мин 00 с, (E-E') День 2, 00 ч 40 мин 10 с, и (F-F') День 2, 09 ч 44 мин 28 с. (F'') Большое увеличение пунктирной коробки в F'. Желтые стрелки (B-F) указывают на фазово-контрастное изображение клетки, экспрессирующей GFP (B-F'). Масштабная линейка: 50 μm Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7. Клеточная линия одиночных клеток-предшественников. (А-С) Фазово-контрастные изображения, показывающие пример деления клеток. (А) Округление клеток-предшественников. (Б) Сужение клеточной мембраны. (В) Завершение митоза. (Г) Пример одноклеточного дерева родословной, сгенерированного в программном обеспечении tTt. Цветными стрелками обозначены различные режимы деления клеток: симметричный пролиферативный (желтая стрелка); Ассиметричный (синяя стрелка); Симметричный терминал (красная стрелка). «X» указывает на гибель клеток. Цифры обозначают продолжительность клеточного цикла клеток-предшественников. Масштабная линейка: 50 μm Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 8. Иммуноцитохимия после визуализации идентифицирует нейрональные клетки. Клетки коры головного мозга иммуноокрашены антителами против GFP (A) и нейронального маркера MAP2 (B). Объединенные изображения в (C) и большее увеличение объединенных изображений в (C'). Желтые стрелки указывают на клетки GFP+, экспрессирующие MAP2. Отслеживание этих клеток до начала эксперимента позволяет идентифицировать родственные нейроны в культуре. Масштабные линейки: 100 μм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Фильм 1. Покадровая видеомикроскопия культуры клеток первичной коры головного мозга. Фазово-контрастные изображения, получаемые каждые 20 минут, отображающие подробное поведение клеток in vitro. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть это видео. (Щелкните правой кнопкой мыши для загрузки.)

Авторы не имеют ничего сообщать.