Мы описываем протокол для визуализации экзоцитоз инсулина в нетронутыми островами с помощью pHluorin, рН чувствительных Зеленый флуоресцирующий белок. Изолированные островки заражены аденовирус кодирования pHluorin, в сочетании с везикул грузов нейропептида Y. Это позволяет для обнаружения инсулина гранул фьюжн событий confocal микроскопии.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Конфокальный изображений нейропептида Y-pHluorin: техника для визуализации экзоцитоз гранул инсулина в нетронутыми мышиных и человеческих островках
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Секреции инсулина играет центральную роль в гомеостаз глюкозы при нормальных физиологических условиях, а также болезни. Нынешние подходы для изучения инсулина гранул экзоцитоз, либо использовать электрофизиологии или микроскопия, в сочетании с выражением флуоресцентные репортеры. Однако большинство из этих методов были оптимизированы для клоновых клеточных линий или требовать отделения панкреатических островков. В отличие от этого метод, представленные здесь позволяет для визуализации реального времени экзоцитоз гранул инсулина в нетронутыми панкреатических островков. В этом протоколе мы сначала описать вирусной инфекции изолированы панкреатических островков с аденовирус, который кодирует рН чувствительных Зеленый флуоресцентный белок (КГВ), pHluorin, в сочетании с нейропептида Y (NPY). Во-вторых мы описываем, конфокальная изображений из островков пять дней после вирусной инфекции и как контролировать гранул секреция инсулина. Кратко зараженных островков размещаются на coverslip на тепловизионные камеры и образы под вертикальное сканирование лазерного конфокального микроскопа при будучи постоянно увлажненную с внеклеточного раствор, содержащий различные стимулы. Конфокальный изображения, охватывающих 50 мкм островок приобретаются как покадровой записи с помощью быстро резонансный сканер. Синтез инсулина гранул с плазматической мембраны может следовать со временем. Эта процедура также позволяет для тестирования аккумулятора раздражителей в одном эксперименте, совместим с мыши и человеческих островках и могут быть объединены с различные красители для функциональных изображений (например, мембранный потенциал или цитозольной кальция красители).
Введение
Инсулин вырабатывается бета-клетки поджелудочной островок и это ключевым регулятором метаболизма глюкозы1. Смерть или дисфункции бета-клеток нарушает гомеостаз глюкозы и приводит к диабета2. Инсулин, Упакованные в плотной ядра гранул, которые выпускаются в Ca2 +-3зависимым образом. Разъяснение, как регулируется экзоцитоз гранул инсулина необходимо полностью понять, что определяет секреции инсулина и открывает новые возможности для определения новых терапевтических целей для лечения диабета.
Инсулин экзоцитоз широко изучен, с помощью электрофизиологических под....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Комитет по этике животных из университета Майами одобрил все эксперименты.
1. вирусные инфекции нетронутыми изолированных человека или мыши панкреатических островков
- островок культуры: подготовить островок культуры СМИ: Connaught медицинских исследовательских лабораторий (CMRL) 1066, 10% (v/v) FBS и 2 мм L-глютамина.
- Человека панкреатических островков получаются из комплексной программы распределения островок (NIDDK, низ). По прибытии, Трансфер островков (~ 500 островок эквиваленты) для 35-мм не культуры ткани лечение Петри с 2 мл CMRL Культура СМИ при 37 ° C, 5/95% CO 2/o 2 за 24 ч до вирусной ин....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Весь процесс техника показано на рисунке 1. Кратко мыши или человека островков можно инфицированных аденовирус кодирования NPY-pHluorin и образы, после нескольких дней в культуре, под конфокального микроскопа. Как гранулы сливаются с плазматической мембраны и открытым, увеличение флуоресценции наблюдается и может быть квантифицировано (рис. 1). Чтобы определить, если NPY pHluorin действительно является подходящим инструментом для.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Эта рукопись описывает технику, которая может использоваться для визуализации экзоцитоз инсулина гранул в бета-клеток в пределах нетронутыми панкреатических островков confocal микроскопии. Он использует NPY-pHluorin как флуоресцентные репортер, клонированные в аденовирус обеспечить эффективность трансфекции высокий.
Хотя метод был очень эффективным в наших руках, это может потребовать некоторых изменений, которые главным образом зависит от двух параметров: 1) качество подготовки островок и 2 т.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Авторы благодарят Марсия Boulina от DRI изображений ядра фонда за помощь с микроскопов. Эта работа была поддержана NIH грантов 1K01DK111757-01 (JA), F31668418 (мм), R01 DK111538, R33 ES025673 и R56 DK084321 (AC).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Вертикальный лазерно-сканирующий конфокальный микроскоп | Leica Microsystems, Вецлар, Германия | TCS-SP5 | включает в себя LAS AF, программное обеспечение для получения изображений |
| Камера визуализации | Warner instruments | RC-26 | |
| Камера визуализации Warner | Instruments PH-1 | ||
| 22 x 40 стеклянные покровные стекла | Daiggerbrand | G15972H | |
| Vacuum силиконовая смазка | Sigma | Z273554-1EA | |
| Многоканальная система перфузии | Warner | instruments VC-8 | |
| Нагреватель одинарного встроенного раствора | Warner | instruments SH-27B | |
| Регулятор температуры | Warner instruments | TC-324C | |
| Перистальтический всасывающий насос | Аптека | P-1 | |
| 35 мм чашка Петри, обработанный без культуры | тканей VWR | 10861-586 | |
| CMRL Medium, без глутамина | ThermoFisher | 11530037 | |
| FBS, термоинактивированный | ThermoFisher | 16140071 | |
| L-глютамин 200 мМ | ThermoFisher | 25030081 | |
| 5 М раствор NaCl | Sigma | S5150 | |
| 3 М раствор KCl | Sigma | 60135 | |
| 1 М CaCl<суб>2 раствор | Sigma | 21115 | |
| 1 М MgCl<суб>2 раствор | Sigma | M1028 | |
| Бычья сыворотка Альбумин | Sigma | A2153 | |
| 1 М раствор HEPES | Sigma | H0887 | |
| Вакуумный фильтр | VWR | 431098 | |
| D-глюкоза | Sigma | G8270 | |
| Поли-D-лизина гидробромид | Sigma-aldrich | P6407 | |
| Di-8-ANNEP | ThermoFisher | D3167 | |
| 3-изобутил-1-метилксантин (IBMX) | Sigma | I5879 | |
| Forskolin | Sigma | F3917 |
Ссылки
- Roder, P. V., Wong, X., Hong, W., Han, W. Molecular regulation of insulin granule biogenesis and exocytosis. Biochem J. 473 (18), 2737-2756 (2016).
- Rutter, G. A., Pullen, T. J., Hodson, D. J., Martinez-Sanchez, A. Pancreatic beta-cell identity, glucose sensing and the cont....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
