Конфокальный изображений нейропептида Y-pHluorin: техника для визуализации экзоцитоз гранул инсулина в нетронутыми мышиных и человеческих островках

Инсулин вырабатывается бета-клетки поджелудочной островок и это ключевым регулятором метаболизма глюкозы¹. Смерть или дисфункции бета-клеток нарушает гомеостаз глюкозы и приводит к диабета². Инсулин, Упакованные в плотной ядра гранул, которые выпускаются в Ca^{2 +}-³зависимым образом. Разъяснение, как регулируется экзоцитоз гранул инсулина необходимо полностью понять, что определяет секреции инсулина и открывает новые возможности для определения новых терапевтических целей для лечения диабета.

Инсулин экзоцитоз широко изучен, с помощью электрофизиологических подходы, такие как измерения емкости мембраны и микроскопических подходов в сочетании с флуоресцентных молекул. Измерения емкости мембраны имеют хорошие временное разрешение и позволяют одну ячейку записи. Однако изменения в емкость отражают чистое изменение поверхности клетки и не захватывать события отдельных фьюжн или отличить инсулина гранул фьюжн от других инсулиннезависимым секреторные пузырьки³. Микроскопический подходы, такие как два фотона или полного внутреннего отражения микроскопии флуоресцирования (TIRF) в сочетании с флуоресцентных зондов и везикул грузов белков, предоставляют дополнительные подробности. Эти методы захвата одного-exocytotic событий, а также этапов до и после exocytotic и может быть использован для изучения exocytotic моделей в популяциях клеток³.

Флуоресцентный Репортеры могут быть трех типов: 1) внеклеточная, 2) цитоплазмы или 3) пузырчатка. 1) внеклеточной журналисты являются полярные Трейсеры (например, декстраны, sulforhodamine B (SRB), Люцифер жёлтый, pyranine), которые могут быть введены через внеклеточных среды⁴. Использование полярного Трейсеры позволяет для расследования фьюжн поры в популяции клеток и захватывает различные межклеточных структур, таких как кровеносные сосуды. Однако они не сообщают о везикул грузов поведение. 2) цитоплазматической журналисты являются флуоресцентных зондов, в сочетании с связанный мембранами перст-белки, которые сталкиваются с цитоплазмой и участвуют в док и экзоцитоз. Примеры включают членов растворимых N- ethylmaleimide-чувствительных фактор вложений белка рецептора (SNARE) семьи, которые были успешно использованы в неврологии для изучения нейромедиатора релиз⁵. Такие белки имеют несколько партнеров привязки и не инсулин блок конкретных. 3) пузырчатка журналисты являются флуоресцентных зондов, сливается с везикулярного грузов белки, которые позволяют для расследования конкретных грузов везикул поведения. Белки инсулин блок конкретных грузов включают в себя инсулин и с пептида, полипептид амилоида островка, NPY среди прочих^6,7. NPY присутствует только в инсулине, содержащие гранул и совместно выпустили с инсулина, что делает его отличным партнером для флуоресцентных репортер⁸.

Слияние различных флуоресцентных белков NPY ранее использовалась для изучения различных аспектов экзоцитоз в нейроэндокринные клетки, например требование о конкретных Синаптотагмин изоформы^9,10 и как время курс релиза зависит на Цитоскелет актина и миозина II^11,12. В этом исследовании, мы выбрали pHluorin как флуоресцентные репортер, который является изменение GFP, это не флуоресцентные в кислой рН внутри плотные ядра гранул но становится ярко люминесцентные под воздействием нейтральный внеклеточного pH¹³. Зрелые инсулина гранулы имеют кислый рН ниже 5.5. Как только Блок предохранителей с плазматической мембраны и открывается, его груз подвергается нейтральных внеклеточного pH 7,4, позволяя использовать pHluorin рН чувствительных белки как репортер^7,14.

Учитывая деликатный характер pHluorin рН и селективного выражение NPY в гранулы инсулина конструкция фьюжн NPY-pHluorin может использоваться для изучить различные свойства инсулина гранул экзоцитоз. Вирусных доставки фьюжн конструкция обеспечивает высокий трансфекции эффективность и работает на основной бета-клеток и клеточных линий, а также на изолированных островков. Этот метод также может использоваться в качестве ориентира для изучения экзоцитоз в любой другой тип клеток с NPY-содержащих везикулы. Он может также сочетаться с любой трансгенные мыши модель для изучения последствий определенных условий (нокдаунов, гиперэкспрессия и т.д.) на экзоцитоз. Эта техника ранее не использовался для описания пространственных и временных моделей гранул секреции инсулина в бета клеточных популяций в человеческих островках¹⁵.

Комитет по этике животных из университета Майами одобрил все эксперименты.

1. вирусные инфекции нетронутыми изолированных человека или мыши панкреатических островков

1. островок культуры: подготовить островок культуры СМИ: Connaught медицинских исследовательских лабораторий (CMRL) 1066, 10% (v/v) FBS и 2 мм L-глютамина.
   1. Человека панкреатических островков получаются из комплексной программы распределения островок (NIDDK, низ). По прибытии, Трансфер островков (~ 500 островок эквиваленты) для 35-мм не культуры ткани лечение Петри с 2 мл CMRL Культура СМИ при 37 ° C, 5/95% CO 2/o ₂ за 24 ч до вирусной инфекции.
   Панкреатических островков
   2. мыши могут быть изолированы после ранее установленными протоколами ¹⁶. После изоляции, культура ~ 200 островок эквиваленты в культуре ткани 35-мм лечение Петри с 2 мл CMRL Культура СМИ при 37 ° C, 5/95% CO 2/o ₂ за 24 ч до вирусной инфекции.
      Примечание: Избегайте использования трансгенных мышей с GFP или рекламы ЯФП журналистами выразил на островках во избежание дублирования флуоресценции с NPY-pHluorin.
2. Вирус подготовки
   Примечание: NPY pHluorin fusion был клонирован в pcDNA3 вектор ¹⁰ и subcloned в аденовирусных вектор для аденовирусных производства [аденовирус серотип 5 (ДЭ1/E3)] по рекомбинантным аденовирус производственная компания. Вирус был aliquoted и хранятся при температуре-80 ° C. Вирусные акции предоставляется компанией на титры 10 ¹²-10 ¹³ вирусных частиц (~ 3 x 10 ¹⁰ - 3 х 10 ¹¹ ОРП).
   1. В vitro островок инфекции, использование 10 ⁶ ОРП/мл, возникающих в приблизительные количества инфекции (МВД) около 2 (см. обсуждение за подробности)
3. Вирусная инфекция панкреатических островков
   Предупреждение: Работа с аденовирусов требует процедуры 2-го уровня биобезопасности (BSL2) и сертификации. Проверьте с институциональных биобезопасности сотрудника для руководства и обучения на BSL2 процедур.
   1. Подготовить человека и мыши островков, как описано выше.
   2. Добавить 5-10 мкл запасов вируса к каждому блюду Петри 35-мм, содержащих островки человека и мыши в 2 мл CMRL культуры средств массовой информации (с 10% FBS и 2 мм L-глютамин).
      Примечание: Громкость этого вируса, используется согласно вирусной титр, как это предусмотрено в описании компании.
   3. Культура островков в вирус содержащих СМИ на 37 °C/5% CO ₂ за 24 ч.
   4. После 24 ч, аспирационная вирус содержащих СМИ и заменить с 2 мл CMRL Культура СМИ (с 10% FBS и 2 мм L-глютамин).
   5. Культура островки для 4-6 дней на 37 °C/5% CO ₂, заменив СМИ каждые 3 дня.
   6. После 4 - 6 дней культивирования, ожидать около 30% островковых клеток, чтобы быть заражены. Островки может затем использоваться для живых изображений экспериментов.

2. Конфокальный изображений из инфицированных островки

Примечание: обратитесь к Таблице материалов для материалов и оборудования, необходимых для конфокальная томография.

1. реагента и экспериментальной установки
   1. подготовить внеклеточного решение: добавить 125 мм NaCl, 5,9 мм KCl, 2.56 мм CaCl ₂, 1 мм MgCl ₂, 25 мм HEPES, 0.1% BSA, рН 7,4, стерильной фильтрации.
      Примечание: Этот буфер обычно готовится без глюкозы и может храниться при температуре 4 ° C до 1 месяца. Глюкоза добавляется в день эксперимента, чтобы достичь желаемой конечной концентрации.
      1. Подготовить базальной глюкозы (3 мм) средний: 75 мкл запасов глюкозы 2 М до 50 мл раствора внеклеточные.
      2. Среднего Hyperglycemic (16 мм): 400 мкл запасов глюкозы 2 М до 50 мл раствора внеклеточные
   2. Ослабить любые дополнительные стимулы (например, хлористого калия или аденозинтрифосфатом (АТФ)) в внеклеточной раствор, содержащий 3 мм глюкозы.
   3. Перед началом эксперимента, предварительной обработки coverslips с поли D-лизин, добавив 30 мкл раствора (1 мг/мл) поли D-лизин coverslip за 1 час и тщательно полоскать с H ₂ O.
      Примечание: Поли лизин с покрытием coverslips может храниться при комнатной температуре до 6 месяцев.
   4. По крайней мере за 1 ч до эксперимент, используя 1 мл пипетки, передачи островки для 35-мм Петри, содержащие внеклеточного решение с 3 мм глюкозы. Держите островков при 37 ° C и 5% CO ₂.
      Примечание: При необходимости плазматической мембраны могут быть помечены в этом шаге. Чтобы пометить плазматической мембраны, добавьте 2 мкм ди-8-ANEPP краситель внеклеточного решение с 3 мм глюкозы. Инкубируйте островков в раствор красителя для 1 ч при 37 °C/5% CO ₂. Краситель плазматической мембраны могут быть возбуждены в 488 нм и обнаружен в 620 Нм.
   5. мин перед началом эксперимента, придают coverslip тепловизионные камеры путем герметизации с вакуумной силиконовой смазкой. Исправьте тепловизионные камеры для изображений платформы. С помощью пипетки, место 20-30 островков на поли D-лизин лечение области coverslip и пусть островки присоединиться к поверхности на 20 мин
      Примечание: Важно, чтобы не позволить высохнуть, чтобы избежать повреждения островок coverslip.
   6. В то время как островки придерживаясь coverslip, подготовить перфузии системы тщательно ополоснуть водой. Добавьте каждое решение на другой канал: 3 мм глюкозы (канал 1), глюкозы (канал 2), 16 мм 16 мм глюкозы с 100 мкм 3-изобутил-1-метилксантина (IBMX) и 25 мм KCl в 3 мм глюкозы (channel 4), 10 мкм АТФ в 3 мм глюкозы (10 мкм форсколин (канал 3), 5 канал). Удалить все пузырьки из системы, открыв для каждого канала отдельно и давая решение поток на несколько минут и убедитесь, что поток является последовательным (0,5 мл/мин) и трубку не протекает.
   7. Подключите один встроенный нагреватель решение к отводной трубки перфузии и отрегулировать температуру выходящего буфера до 37 ° C.
   8. Подготовить всасывающий насос. Удалить все пузырьки из системы и убедитесь, что поток является последовательной и трубки не протекает.
   9. После того, как островки придерживаться coverslip поверхности, аккуратно заполнить тепловизионные камеры с внеклеточного раствор, содержащий 3 мм глюкозы. Избегать мытья островков от поверхности coverslip.
   10. Место изображений платформы с островками на сцену микроскоп и подключить его к системе перфузии и всасывания насоса.
   11. Поворот на поток и постоянно perfuse островков с внеклеточного решения 3G. Теперь система готова для конфокальная томография.
2. Конфокальная томография
   1. обнаружения островков в поле микроскоп с увеличением ниже. После сосредоточены на островки, переключитесь в цели более высокого масштаба (например, цель погружения воды 63 X (63 X / 0.9 NA)).
   2. Открыть приобретение с помощью программного обеспечения (Таблица материалов) и активировать режим резонансный сканер.
   3. Выберите режим визуализации XYZT и настройте параметры приобретения следующим:
      1. повернуть на аргон лазера и 488 нм лазер линии и отрегулировать мощность лазера до 50% для возбуждения pHluorin.
      2. Собирать выбросов 505-555 Нм.
      3. Выбрать разрешение 512 x 512 пикселей. Пресс " Live " кнопку, чтобы начать изображений и отрегулировать уровни усиления (типичный прирост составляет около 600 V).
      4. Установить начало и конец z стека: фокус на вершине островка и выбрать " начать " и перейти к последнему плоскость, которая может быть направлена и выбрать " конец ". Используйте размер z шаг 5 мкм. Программное обеспечение автоматически рассчитает количество конфокальный плоскостей.
      5. Задать временной интервал для приобретения каждого z-стека недалеко от 1,5-2 сек и выбрать опцию " приобрести до остановки " для непрерывной обработки изображений.
      6. Пресс " начало " кнопку чтобы initialize.
   4. Используют различные протоколы стимуляции побудить гранул экзоцитоз, perfusing островков с желаемой раздражителей. Протоколы стимуляции могут быть настроены с учетом желаемой научной целью (см. ниже).
3. Протоколы стимуляции
   Примечание: В протоколе каждый стимуляции, начните с записи по крайней мере 2 мин островок фоновой активности во время постоянной перфузии с внеклеточного раствор, содержащий 3 мм глюкозы. Perfuse с стимулятором за желаемый период времени. Порядок стимуляторов, длительность стимуляции, а также продолжительность записи могут настраиваться с учетом желаемого научных целей. Убедитесь в том вымыть островков с внеклеточного раствор, содержащий 3 мм глюкозы перед началом нового стимуляции. Ниже найдете протоколы стимуляции выборки, которые использовались для демонстрации возможностей метода.
   1. Стимулировать с аммония хлорид (NH ₄ Cl) как позитивный элемент управления для pHluorin рН чувствительность и вирусной инфекции эффективность ( рис. 3): 3 мм глюкозы (2 мин) → 50 мм NH ₄ Cl (2 мин) в 3 мм глюкозы → глюкозы (2 мин) 3 мм
      Примечание: В NH ₄ Cl решение, заменить NaCl на основе эквимолярных.
   2. Экзоцитоз гранул инсулина стимулировать путем увеличения концентрации глюкозы ( Рисунок 5 и Рисунок 6): 3 мм глюкозы (2 мин) → 16 мм глюкозы (15-30 мин) → 3 мм глюкозы (2 мин
      Примечание: Чтобы увидеть несколько всплесков активности, perfuse островков непрерывно с 16 G решение для по крайней мере 15 мин
      Примечание: В целях повышения согласованности секреторной ответы ¹⁷, пользователи могут добавлять лагерь просветительских агентов (100 мкм IBMX и 10 мкм форсколин) для 3 G и 16 G решений. Это не изменяет временной структуры гранул секреция. Подробную информацию см. ¹⁵ и обсуждения.

Весь процесс техника показано на рисунке 1. Кратко мыши или человека островков можно инфицированных аденовирус кодирования NPY-pHluorin и образы, после нескольких дней в культуре, под конфокального микроскопа. Как гранулы сливаются с плазматической мембраны и открытым, увеличение флуоресценции наблюдается и может быть квантифицировано (рис. 1). Чтобы определить, если NPY pHluorin действительно является подходящим инструментом для мониторинга инсулина гранул динамика, зараженных островков были immunostained с антителами против GFP и различных островок гормоны инсулин, соматостатина или глюкагон. Большинство клеток, выражая NPY-pHluorin (GFP положительным) были бета-клетки, как они выразили также инсулина (~ 90%; Рисунок 2A, 2B). Только несколько глюкагона позитивных альфа-клетки или Дельта соматостатина положительных клеток были помечены GFP (рис. 2B). Важно отметить, что в инфицированных клетках, сплавливание NPY colocalized с инсулином (коэффициент корреляции Пирсона 0,61 ± 0.04 GFP и инсулина против 0,21 ± 0,05 GFP и глюкагон и 0.07 ± 0,01 GFP и соматостатина).

Мы показали, что pHluorin является эффективным рН датчик, как увеличение внутриклеточный pH с 50 мм NH4Cl привело к > 500% увеличение внутриклеточных флюоресценция (Рисунок 3А, 3Б, 1 видео). С увеличением рН внутри зерна после сплавливания с плазматической мембраны и открытия пор фьюжн, гранулы, содержащие NPY pHluorin становятся видимыми на условиях, которые стимулируют инсулина экзоцитоз например деполяризации мембраны с KCl (Рисунок 4, видео 2).

Одиночные секреторной события в бета-клеток в пределах нетронутыми островков могут быть визуализированы с конфокальный покадровой изображений NPY-pHluorin инфицированных островков. Эти события происходят в ответ на деполяризации мембраны прямого с KCl или несколько других физиологических раздражителей (рис. 4 и рис. 7, см. ниже). В базальной внеклеточного глюкозы (3 мм) наблюдается мало секреторную активность. Однако гранулированных синтеза с плазматической мембраны запускается в ответ на стимуляцию с высоким глюкозы (16 мм) (Рисунок 5A, 3 видео). Размещая ROIs с разных размеров и в различных областях кинетики реакции секреторных гранул можно сравнить с в отдельные ячейки или группы ячеек в непосредственной близости (кластеров) (Рисунок 5B). Этот тип анализа позволили определить, что: 1) отдельных секреторной события являются очень синхронизированы и выделяется в течение нескольких секунд от средний клеток ответ, и 2) бета-клеток в непосредственной близости от формируют функциональные кластеры синхронизированной активности.

Секреции инсулина в организме происходит в пульсирующего манере. Стимулирование NPY-pHluorin инфицированных островков с повышенными глюкозы для длительных периодов (15-20 мин) породило несколько импульсов (или очередей) секреции (рис. 6, видео 4). Во время каждого импульса отдельные гранулы предохранитель с плазматической мембраны в синхронизированном моды, как показано выше (Рисунок 5). Всплесков секреторной активности может быть видно каждые 3-4 мин.

Преходящее увеличение флуоресценции в NPY-pHluorin, содержащие гранул наблюдалась также в ответ на purinergic агонист АТФ (10 мкм) или мускариновых агонист ацетилхолина (ACh, 10 мкм) (рис. 7), оба из которых известны стимуляторы секреции инсулина в человеческих островках. Как и ожидалось, деполяризации мембраны с KCl (30 мм) также вызвало инсулина гранул экзоцитоз (рис. 5). Несколько раздражителей может применяться же островок подготовку как островки моются хорошо между раздражителей. Убедитесь в том изменить порядок применения, когда повторение эксперимента.

Рисунок 1. Разработана схема, иллюстрирующая Assay. Аденовирусы, который кодирует рН чувствительных GFP (pHluorin), в сочетании с NPY выпускались и используется для заражения мыши или человека панкреатических островков. Четыре-шесть дней после инфицирования, островки были размещены на coverslip и образы под вертикальное сканирование лазерного конфокального микроскопа. Конструкция NPY pHluorin выражается в гранулы инсулина в бета-клеток. Его флуоресценции закаленных в кислой рН зрелых инсулина гранул, но становится яркой на слияние гранул с плазматической мембраны и подверженности нейтральных внеклеточного pH 7,4.

Рисунок 2. NPY сплавливания построить выражается в гранулы инсулина. (A) конфокальный изображения нетронутыми человеческих островках инфицированных NPY-pHluorin, immunostained для GFP (зеленый) и инсулина (левая панель, красный), соматостатин (средний, красный) или глюкагон (справа, красный). Клеточных ядер отображаются синим цветом (DAPI помечены). Масштаб баров = 10 мкм. (B) количественной оценки доли GFP-положительных клеток, которые также содержат инсулин (СИН), соматостатин (Soma) или глюкагон (Glu). Показаны являются среднее ± SEMs, n = 5 островков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3. NPY-pHluorin является эффективной рН датчика. (A) максимальная проекции конфокальный изображений островок мыши, инфицированных NPY-pHluorin в внеклеточной раствор, содержащий 3 мм глюкозы до (Верхняя панель, 3 G) и в присутствии 50 мм NH4Cl (Нижняя панель). Шкалы бар = 100 µm. (B) трассировки, показывающая изменения в интенсивности (условные единицы) означает флуоресценции в целом островок, вызванных NH4Cl. пунктирная линия указывает NH4Cl приложения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4. Гранулы, содержащие NPY pHluorin становятся видимыми после того, как они сливаются с плазматической мембраны и открытым. Человеческого isletsinfected с аденовирус NPY pHluorin были incubatЭд с плазматической мембраны красителя ди-8-ANEPP (красный). Островок стимуляции с KCl (30 мм) вызвало внезапное и переходных внешний вид флуоресцентные гранул на поверхности клеток (показано зеленым). Конфокальный изображения клеток внутри человека островок отображаются перед exocytotic ответ (t = 0), во время (t = 3-9 s) и после (t = 12 s). Контраст был скорректирован для удаления фона зеленый флуоресценции. Шкалы бар = 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5. Высокая глюкозы вызывает NPY pHluorin Fusion с плазматической мембраны. (A) максимальная проекция конфокальный изображений островок нетронутой человека, инфицированных NPY-pHluorin в базальной глюкозы (глюкозы в 3 G - 3 мм, левая панель) или высокой глюкозы (глюкозы 16 G - 16 мм, правая панель). Внеклеточные решения содержал лагерь, форсколин агентов и IBMX (подробную информацию см. в протокол). Шкалы бар = 10 мкм. (B) показаны изменения в интенсивности (условные единицы) означает флуоресценции в зелёном канале в ROIs следы размещены вокруг одного секреторной события (красный, гранула), клетки (зеленый) или кластеры клеток (синий). Высокая глюкозы был применен для 5 мин после ~ 2,5 мин в 3G. Флуоресценции значения были нормализованы к значению первоначального флуоресцирования (базовый уровень). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 6. Секреторный события создают дискретные импульсы секреции на высокие глюкоза. Следы показаны изменения в означают интенсивности флуоресценции (условные единицы) в ROI, расположенных вокруг различных ячейках островок нетронутой человеческой во время постоянной стимуляции с 16 мм глюкозы. Каждый цвет представляет отдельную ячейку. Всплеск секреторной активности может быть видно каждые 3-4 мин пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 7. NPY pHluorin Fusion с плазматической мембраны инициируется известных стимуляторов секреции инсулина. Следы показаны изменения интенсивности (условные единицы) означает флуоресценции в ROIs размещены вокруг отдельных секреторной события в ячейках нетронутым человеческие островков, индуцированных KCl (30 мм), АТФ (10 мкм), высокие глюкоза (16G, 16 мм) и ацетилхолин (Ach, 10 мкм). KCl и СПС были применены в базальной глюкозы (3 мм). Черные линии показывают среднее зерно и серые линии отражают SEM ценности. Зеленые следы показывают соответствующий ответ клетки. Горизонтальные время шкала (2 мин) применяется для всех графиков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Видео 1. NPY pHluorin аденовирус эффективно заразить островковых клеток и смысл рН изменения.
Островки мыши были инфицированы за 4 дня аденовирус кодирования NPY-pHluorin. Зараженных островков были размещены на coverslip и монтируется на тепловизионные камеры. Чтобы увеличить внутриклеточного рН, островки были увлажненную с 50 мм NH4Cl добавляется внеклеточного раствор, содержащий 3 мм глюкозы. Быстрое и сильное увеличение флуоресцирования можно увидеть на NH4Cl приложения. Шкалы бар = 100 µm. фильм скорость = 5 fps. Общая продолжительность фильма составляет 90 s. пожалуйста нажмите здесь для просмотра этого видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)

Видео 2. Гранулы, содержащие NPY pHluorin становятся видимыми после того, как они сливаются с плазматической мембраны и открытым.
Человека островков, инфицированных NPY pHluorin аденовирус инкубировали с плазматической мембраны краситель ди-8-ANEPP. Островок стимуляции с KCl (30 мм) вызвало внезапное и переходных внешний вид флуоресцентные гранул на поверхности клеток. Показана максимальная проекции конфокальный самолетов. Контраст был скорректирован для удаления фона зеленый флуоресценции. Шкалы бар = 20 мкм. фильм скорость = 5 fps. Общая продолжительность фильма составляет 60 s. пожалуйста нажмите здесь для просмотра этого видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)

Видео 3. Высокая глюкозы триггеры экзоцитоз гранулы, содержащие NPY-pHluorin.
Фьюжн содержащие гранул NPY pHluorin запускается в ответ на стимуляцию с высоким глюкозы (16 мм). В базальной внеклеточного глюкозы (3 мм) наблюдается мало секреторную активность. Однако после высоких глюкозы, инсулина гранулы временно появляются на плазматической мембране различных клеток в островок в синхронизированном моды. Высокая глюкозы была применена после ~ 2,5 мин в 3G (16G метка появляется). Показана максимальная проекции конфокальный самолетов. Шкалы бар = 20 мкм. фильм скорость = 10 fps. Общая продолжительность фильма составляет 7 минут пожалуйста, нажмите здесь для просмотра этого видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)

Видео 4. Пролонгированной стимуляции с высоким глюкозы вызывает несколько очередей экзоцитоз.
Несколько импульсов секрецию островков, во время которых временно появляются гранулы рождает пролонгированной стимуляции с высоким глюкозы. Импульсы секреторную деятельность может рассматриваться каждые ~ 3-4 мин конфокальный плоскости человеческой островок показано. Псевдоцветном схема применялась для интенсивности флуоресценции. Шкалы бар = 20 мкм. фильм скорость = 30 fps. Общая продолжительность фильма составляет 20 мин пожалуйста, нажмите здесь для просмотра этого видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.