Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Культивирование в естественных условиях-как мышиных астроциты, используя протокол быстрый, простой и недорогой AWESAM

7.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56092

⸱

10 января 2018 г.

 , 
1Chemical Biology, Chemistry Research Laboratory, University of Oxford, 2Department of Physiology, Anatomy, and Genetics, University of Oxford, 3Trans-synaptic signaling, European Neuroscience Institute

В этой статье

Краткое содержание

Протокол AWESAM, описанный здесь является оптимальным для культивирования мышиных астроциты в отрыве от других клеток головного мозга в быстрый, простой и недорогой способ. Астроциты AWESAM выставку спонтанное Ca2 + сигнализации, морфология и ген выражение профили аналогичны астроциты в естественных условиях.

Аннотация

AWESAM ( Лоw-стоимость электроннойasy stellate strocyte мethod) протокол влечет за собой быстрый, простой и недорогой способ для генерации большого количества в естественных условиях-как мыши и крысы экзоцитоз монокультур : Клетки головного мозга могут быть изолированы от различных мозга, и после недели культуры клеток, не Астроцитарная клетки стряхнуть, поместив культуры блюда на шейкер для 6 h в инкубаторе. Оставшиеся астроциты затем пассированной на новые пластины с носителем экзоцитоз специфичные (называемых NB + H). NB + H содержит низкой концентрации гепарина привязки EGF-подобный фактор роста (HBEGF), который используется вместо сыворотки в среде. После роста в NB + H, AWESAM астроциты имеют севрюга морфологии и функция тонкой процессов. Кроме того, эти астроциты, имеют больше в естественных условиях-как выражение гена чем астроциты, созданные ранее опубликованные методы. CA2 + изображений, везикул динамики и другие события недалеко от мембраны может таким образом изучены в тонкой Астроцитарная процессов в пробирке, например, с использованием живой клетки конфокальный или TIRF микроскопии. В частности AWESAM Астроциты также экспонат спонтанное Ca2 + сигнализации аналогичны астроциты в естественных условиях.

Введение

Астроциты влияние функции мозга через трофические поддержки, поток крови, синаптических сигнализации и пластичности и межклеточные связи - все из которых являются механизмы, которые сосредоточены вокруг тонких Астроцитарная процессов. Протокол AWESAM, описанный здесь позволяет исследования этих процессов без помех от нейронов и другие глии, который является полезным например, потому что выражение многих белков и даже Ca2 + сигнализации пересекаются через различные мозг клеток типы. Кроме того этот метод преодолевает ограничения ранее имеющихся методов. В частности, наш протокол обеспечивает в естественных условиях-как морфология (севрюга астроциты с тонкими процессов) и экспрессии генов в быстро, легко и дешевые манере.

Морфология клеток, экспрессии генов и многие другие нормативные процессы непосредственно зависят от окружающей среды. В культуре блюдо это относится к факторов, выпущенное окружающие клетки, но и среда, в которой выращиваются клетки. Для астроциты HBEGF сообщалось ранее побудить севрюга морфология1 , но был также найден де дифференцировать астроциты2. Однако, более низкие концентрации HBEGF впоследствии использовались для генерации более в естественных условиях-как астроциты, как определены через РНК последовательности в двух разных протоколов3,4. Кроме того, экзоцитоз морфология изменяется с средний состав, независимо от протокола4: Neurobasal среды с низкой концентрацией HBEGF является оптимальным для выращивания севрюга астроциты, в то время как другие средние композиции (например, Сыворотка содержащих DMEM) производят полигональных клетки (даже в астроциты свежезаваренным изолированные immunopanning).

Протокол AWESAM преодолевает недостатки предыдущих методов для выращивания монокультур экзоцитоз4. Предыдущие методы для выращивания монокультур экзоцитоз имеют следующие недостатки: многоугольной морфологии, который несвойственной севрюга астроциты в vivo (MD метод)5; продолжительность и стоимость протокола (подготовка астроциты из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток занимает три месяца и требует много реагентов, включая дорогих факторы роста)6; низкое количество материала (метод immunopanning)3; и де дифференциация астроциты и требование 3D матрицы (Puschmann и др.) 1 , 2. напротив, обеспечивает протокол AWESAM: в естественных условиях-как морфология (севрюга астроциты с тонкими процессов); быстрый, легкий и дешевый метод; большие количества материала; и в естественных условиях-как по сравнению с immunopanned и MD астроциты экспрессии генов. Кроме того, 2D культура позволяет для изучения Ca2 + сигнализации и везикул, рециркуляции в тонкие процессы и в мероприятиях рядом мембраны (например, TIRF микроскопии возможен не в 3D культур).

MD метод широко использовался с момента его опубликования в 1980 году5, предлагая простой и быстрый метод для полигональных экзоцитоз монокультур. Короче говоря, метод MD влечет за собой рост клетки смешанных мозга в сыворотке крови плода теленка (FCS)-содержащих DMEM, следуют покачивая шаги, которые обогащают для астроциты (как все другие типы отсоединить от блюдо клеток головного мозга) и далее культуры в той же среде. DMEM дополнена FCS используется для многих других типов клеток, фибробластов и адипоцитов до рака различных клеточных линий, все из которых доля полигональных морфологии, проявляемой MD астроциты в культуре. До начала 2000-х7, мало мысли было уделено СМИ с учетом астроциты, конкретно в пользу их типичные севрюга морфологии найдено в естественных условиях. Один протокол, опубликованные в 2011 году достичь таких севрюга Морфология: вызывается метод immunopanning, он использует сыворотки свободный среднего, оптимизированный для культивирования астроциты3. С помощью этого метода, клетки мозга свежевыделенных подвергаются ряд блюд, покрытых антителами, которые целевой ячейки определенного типа клеток поверхности белки, чтобы обогатить астроциты. Несмотря на более в естественных условиях-как морфология и выражение профиль immunopanned астроциты, большинство в vitro исследования по-прежнему полагаются на методе экзоцитоз MD. MD метод является простым и быстрым, в то время как метод immunopanning включает в себя более сложным и длительным шаги в первый день культуры (например дольше Пищеварение энзима, тщательно наслаивать растворов различной плотности, immunopanning себя, и несколько центрифугирования шаги - все перед покрытием). Однако, используя более специализированных средних, метод AWESAM предлагает скорость метода MD и в естественных условиях-как морфология immunopanning протокола.

В целом, протокол AWESAM полезно для изучения более в естественных условиях-как астроциты в 2D монокультур, изолированных от нейронов и глии других (как ранее характеризуется4 , immunostainings, иммуноблотов и РНК последовательности). Это позволяет для изучения тонких Астроцитарная процессов и обеспечивает большую доступность для визуализации спонтанное Ca2 + сигнализации и события близко к мембране (например, образы, TIRF микроскопия).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

В соответствии с руководящими принципами для немецких животных были проведены все животных эксперименты, описанные здесь.

Примечание: График и основные этапы протокола приведены на рисунке 1.

1. Подготовка

  1. Подготовьте следующие решения.
    1. Подготовить DMEM + для культивирования полигональных астроциты MD: DMEM с 10% FCS, 100 U пенициллина и стрептомицина 100 мкг/мл.
    2. Подготовить NB + H для культивирования севрюга астроциты: neurobasal средний с 5 нг/мл HBEGF, 1 x B-27 дополнение, 1 x глютамин добавки, 100 U пенициллин и 100 мкг/мл стрептомицина.
      Примечание: Аликвоты повышенных концентраций HBEGF могут быть подготовлены и хранятся при-20 ° C для добавления в среду, когда это необходимо.
    3. Подготовьте рассечение среднего (10 мм HEPES в HBSS).
    4. Подготовьте аликвоты 6-7 мл 0,05% трипсина ЭДТА и 6-7 мл 0,25% трипсина ЭДТА в 15 мл пробирок. Эти можно хранить при температуре-20 ° C и разморозить в ванну воды 37 ° C.
  2. В день перед началом протокол, покройте 10 см культуры ткани лечение блюда с 5 мл 0,04% polyethylenimine (PEI) каждый.
  3. На следующий день, удалите пей и дважды мыть посуду с дистиллированной деионизированной водой. Добавьте 12 мл DMEM + на каждой пластине и заранее сбалансировать в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO2 для по крайней мере 30 минут до гальванических клеток.
  4. Подготовка области рассечение: Ламинарный шкаф рассечение, место две чашки Петри 10 см наполнен среднего рассечение на льду. Для каждой области мозга, чтобы быть изолированные (например, коры, гиппокамп), подготовить 15-трубки заполнены с 14 мл рассечение среднего и держать на льду. Spray рассечение инструменты (ножницы штраф, Дюмон #3 и #5 щипцы) с 70% этанола и место рядом с Микроскоп рассечение в капюшоне.

2. крыса или рассечение мозг мыши

Примечание: Оба мышей и крыс может использоваться. Животных старше P8 также могут быть использованы (мы тестировали до P12), но удаление мозговых оболочек будет становиться все более сложным. Кроме того клетки урожайность и здравоохранения будет уменьшаться, так как клетки мозга от старых животных будет создали сложные процессы и соединений, которые могут сломаться при диссоциации ткани, приводит к увеличению клеточной смерти. Корковых препараты описаны здесь, но могут также использоваться другие регионы мозга.

  1. Место 0,05% трипсина ЭДТА в ванну воды 37 ° C.
  2. Усыпить животных (беременным крысам E19 щенков, или животных P0-P8) медленно поднимая концентрации CO2 и изолировать мозги. Следующие шаги требуют стерилизации.
  3. При работе с эмбриональной ткани, сначала удалите из матки эмбрионы и откройте зародышевые мешки, а затем немедленно отрезали головы с ножницами. Когда все головы отрезали, перенести их в предварительно охлажденным рассечение среднего.
    1. После того, как руководители погружен в среде, откройте кожи и черепа (оба они очень мягкие в молодых животных) с щипцами и щепотку от мозжечка. Тщательно рычаг остальной части мозга и из черепа.
      Примечание: Две-четыре E19 эмбрионов дают достаточно ткани для по крайней мере восемь 10 см блюда корковых астроциты, покрытие на 500 000 ячеек на блюдо в день рассечение.
  4. Для новорожденного или старше щенков отрезали головы с ножницами и изолировать мозги, медиально резки кожи в прямой линии от задней части головы до кончика носа. Потяните кожу сторону и тщательно вырезать череп влево и вправо, а затем Лифт, кости черепа. Cut off мозжечка, и нажимные остальная часть мозга вверх и из черепа.
    Примечание: Два-три P0-P8 щенков дают достаточно ткани для по крайней мере восемь 10 см блюда корковых астроциты, покрытие на 500 000 ячеек на блюдо в день рассечение.
  5. Отделите коры от базовой структуры мозга. Поместите щипцами в продольные щели между полушариями, затем переместите щипцы между структур коры головного мозга и среднего мозга одного полушария (перпендикулярно продольной щели) щепотку каждого полушария бесплатно.
  6. С помощью щипцов, удалите все мозговые оболочки из каждого полушария (и ее гиппокампа), а затем отделить гиппокампах. Если требуются гиппокампа астроциты, переместите каждый гиппокампа в 15 мл трубки заполнены с 14 мл рассечение среднего на льду.
  7. Удалите дальнейшие области из каждого полушария коры если конкретных регионах не требуется (например, лобной коры). Вырежьте любой кортикального слоя ткани, чтобы использоваться для генерации астроциты на куски размером не более 1 мм3. Соберите все части кортикального слоя ткани в отдельном 15 мл трубки заполнены среднего рассечение на льду.

3. ткань пищеварение и диссоциации

  1. После того, как собраны все ткани, ждать их поселиться в нижней части трубки, а затем аспирационная столько среднего как можно скорее.
  2. Добавить 2-3 мл 0,05% трипсина-ЭДТА с помощью Серологические Пипетки и инкубировать труб в ванну воды 37 ° C 20 мин.
    Примечание: Выпуск всех трипсина ЭДТА из пипетки быстро чтобы смешивать куски ткани и дают отстояться снова.
  3. Аспирационная тщательно трипсином ЭДТА, оставляя куски ткани в качестве мало жидкости, насколько это возможно, в нижней части трубки.
  4. Добавьте 5 мл среды предварительно охлажденным рассечение смыть оставшийся трипсина ЭДТА. Пипетка на стороне в верхней части трубки для достижения смешивания кусков ткани.
  5. Аспирационная рассечение среднего и оставить куски ткани в как мало жидкости как можно скорее. Повторите этот шаг Стиральная с предварительно охлажденным рассечение среднего вдвое больше.
  6. После окончательной стирки шаг добавьте 1 мл DMEM + (разогрет до комнатной температуры) с помощью кончика пипетки 1000 мкл и нарезанных ткани, закупорить вверх и вниз без введения пузыри.
    Примечание: Важно избежать пузырей, как это может изменить рН раствора, к которому астроциты весьма чувствительны.
  7. Стрейнер ячейки 100 мкм в открытии 50 мл и заранее мокрый фильтр с 4,5 мл, предварительно охлажденный DMEM +.
  8. Пипетка 1 мл суспензии диссоциированных ткани на клетки сито и добавить еще 4,5 мл предварительно охлаждается DMEM + мыть клетки через стрейнер ячейки.

4. клетки покрытие для обогащения экзоцитоз пассированый

  1. Подсчет количества ячеек, например, путем разбавления 10 мкл суспензии клеток с 10 мкл Трипановый синий и дозирование смеси на Горяева.
  2. Пластина 500000 клеток в 12 мл DMEM + 10 см блюдо.
    Примечание: DMEM + полезно для Астроцитарная роста, тем более, чем для нейронов или микроглии. Во время тряски, физической силы, действующие на стекло coverslips в пределах скважин гораздо сильнее, чем тех, кто действует на блюда 10 см (без coverslips). Если клетки сотрясаны на 24-ну пластины, они неработоспособными или умереть. Только пластина астроциты на 24-ну пластины после встряхивания.
  3. Держите клеточных культур в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO2 на семь дней.
  4. На 6 день за день до тряски и пассированый клетки, подготовьте Пей покрытием культуры пластин, как описано в шаге 5.

5. пассированый клетки

  1. За день до пассированый, слой клеток культуры пластин с Пей 0,04%.
    1. Для immunocytochemistry, вирусный трансдукция или плазмиды трансфекции используйте 24-ну или 6-ну пластины (каждый из которых содержит стерилизованные 12 мм или 25 мм стекла coverslip, соответственно).
    2. Стерилизовать coverslips стекла по инкубации в 70% этанола для по крайней мере 1 час, затем промыть три раза в дейонизированной, дистиллированной воде перед укладкой coverslips в скважинах.
    3. По крайней мере 70 мкл PEI 0,04% за 12-мм coverslip в 24-ну пластин и 600 мкл 0,04% пей за 25 мм coverslip в 6-ну пластины.
    4. Для западной помарки или РНК-Seq анализа блюда 10 см, уже содержащие клетки после вскрытия могут продолжать использоваться. Блюда нужно только быть поколеблен, то клетки промывают с ПБС и относились с NB + H (не передавать новые блюда).
  2. На день в пробирке (DIV) 7 после вскрытия место 10см блюда с ячейками в среде DMEM + на лабораторных шейкер в инкубаторе и встряхнуть блюда на 110 об/мин, 6 ч.
  3. Дважды смыть Пей с покрытием coverslips дистиллированной деионизированной водой. Добавьте NB + H среднего пластин (500 мкл на хорошо для 24-ну пластин и 2 мл в колодец для 6-ну пластины). Предварительно сбалансировать пластины в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO2 в то время как сотрясение блюда 10 см, или по крайней мере 30 минут.
  4. 20-30 мин до конца 6 h встряхивания, предварительно теплой 1 x PBS, DMEM +, NB + H и 0,25% трипсина ЭДТА до 37 ° C в водяной бане.
  5. После того, как 6 h тряски, снять коктейльной культуры блюда и немедленно замените среднего (который содержит Шакена офф нейронов, олигодендроциты и микроглии) 10 мл предварительно разогретую ПБС за блюдо.
    Примечание: Важно, чтобы немедленно удалить старый носитель, содержащий отдельные клетки, чтобы избежать повторного присоединения не Астроцитарная клетки.
  6. Удаление PBS и добавить 3 мл подогретым трипсина ЭДТА за блюдо. Инкубируйте каждое блюдо на 4 мин в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO2.
    Примечание: Если подготовка образцов для западной помарки или РНК-Seq, не добавляйте трипсина ЭДТА. Вместо этого заменить PBS с 12 мл предварительно разогретую NB + H, после чего культур может быть помещен обратно в инкубаторе.
  7. Добавьте 5 мл подогретым DMEM + 3 мл трипсина ЭДТА в каждом блюдо, Пипетка клетки от блюдо с помощью Пипетки серологические 5 мл и собирать суспензию клеток в 50 мл трубки.
    Примечание: Дозатор непосредственно из нижней части блюдо - Пол блюдо должно стать яснее, как отделить клетки. Сыворотка содержащих среднего (вместо DMEM +), следует используйте только как сыворотки инактивирует трипсина.
  8. Центрифуга суспензию клеток на 3220 x g при 20 ° C на 4 мин.
  9. Удалить супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл предварительно разогретую NB + H.

6. ячейки покрытия для окончательного экзоцитоз культур

  1. Подсчитать количество ячеек.
  2. Тарелка 20 000 ячеек на скважину в 6-ну пластин (в 2 мл NB + H средний за хорошо) или 5 000 ячеек на скважину в 24-ну пластин (в 500 мкл NB + H средний за хорошо).
  3. Держите клеточных культур в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO2 до дальнейшего лечения или анализа.
  4. Обменять половину среднего один раз в неделю.
    Примечание: В низкой питательных средах, астроциты остановить пролиферирующих, но любые оставшиеся микроглии будет размножаться (хотя в нашем опыте, не микроглии появилась в AWESAM культур). Обмен половину среднего раз неделю предотвращает обогащение любой потенциально оставшиеся микроглии8, и монокультуры остаются здоровыми в течение трех недель.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Астроциты, которые совместно культивируемых с нейронами и выращенные в NB + средний появляются севрюга после 2 недель культуры (рис. 2). В дополнение к NB + средний, совместно культивируемых Астроциты также подвергаются неизвестных нейрон производные факторы влияющие вероятно их выживания и морфологии. В противоположность этому MD астроциты, вырос в среде DMEM + как монокультуры (после стряхнуть с себя другие типы клеток до прохода) появляются полигональных п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Четыре шага в рамках Протокола критические: 1) подготовка HBEGF концентрации точно 5 нг/мл, поскольку небольшое увеличение концентрации может привести к незрелых культур, например, 10 нг/мл HBEGF де будет дифференцировать астроциты4; 2) избежать пузырей в растворах, содержащих ткани или клетки, которые могут изменить рН и препятствуют экзоцитоз здоровья; 3) предварительно является СМИ для достижения оптимального рН и температуры для выращивания здоровых астроциты; 4) они обмена только пол...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы признаем, финансирование от Европейского совета научных исследований (FP7/260916), Александр фон Гумбольдт-Stiftung (Александр Kovalevskaja) и Deutsche Forschungsgemeinschaft (DE1951 и SFB889).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,05% трипсин-ЭДТАGibco25300054теплого в 37 °; С водяной баней перед применением
0,25% трипсин-ЭДТАGibco25200-056подогреть в 37 °Ордм; C водяная баня перед применением
B-27 добавкаGibco17504-04450X стоковый
ГлутамаксGibco35050-061100X сток
Пенициллин/стрептомицинGibco15070-06350 стоковый; пенициллин: 5000 ед/мл; стрептомицин: 5000 &микро; г/мл
Нейробазальная средаGibco21103049без L-глутамина
DMEMGibco41966029
HBEGFSigma4643
HEPESGibco15630080
HBSSGibco14170112
FCSGibco10437028
PBSGibco100100491X
100 μ m нейлоновый сетчатый фильтрBD352360
Trypan BlueSigmaT8154 
Инкубатор для клеточных культурThermo Fisher ScientificHera Cell 240i инкубатор для клеточных культур
Лабораторный шейкерHeidolphRotamax 120 Использование в инкубаторе для клеточных культур
ЦентрифугаEppendorf5810 R 

Ссылки

  1. Puschmann, T. B., et al. Bioactive 3D cell culture system minimizes cellular stress and maintains the in vivo-like morphological complexity of astroglial cells. Glia. 61 (3), 432-440 (2013).
  2. Puschmann, T. B., et al. HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins. J Neurochem. 128 (6), 878-889 (2014).
  3. Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
  4. Wolfes, A. C., et al. A novel method for culturing stellate astrocytes reveals spatially distinct Ca2+ signaling and vesicle recycling in astrocytic processes. J Gen Physiol. 149 (4), (2016).
  5. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
  6. Krencik, R., Zhang, S. -C. Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 6 (11), 1710-1717 (2011).
  7. Morita, M., et al. Dual regulation of calcium oscillation in astrocytes by growth factors and pro-inflammatory cytokines via the mitogen-activated protein kinase cascade. J Neurosci. 23 (34), 10944-10952 (2003).
  8. Saura, J. Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note. J Neuroinflammation. 4, 26(2007).
  9. Raponi, E., et al. S100B expression defines a state in which GFAP-expressing cells lose their neural stem cell potential and acquire a more mature developmental stage. Glia. 55 (2), 165-177 (2007).
  10. Royo, N. C., et al. Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity. Brain Res. 1190, 15-22 (2008).
  11. Malarkey, E. B., Parpura, V. Temporal characteristics of vesicular fusion in astrocytes: examination of synaptobrevin 2-laden vesicles at single vesicle resolution. J Physiol. 589, Pt 17 4271-4300 (2011).
  12. Zamanian, J. L., et al. Genomic analysis of reactive astrogliosis. J Neurosci. 2 (18), 6391-6410 (2012).
  13. Srinivasan, R., et al. Ca(2+) signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo. Nat Neurosci. 18 (5), 708-717 (2015).
  14. Shigetomi, E., et al. Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses. J Gen Physiol. 141 (5), 633-647 (2013).
  15. Srinivasan, R., et al. New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
  16. Otsu, Y., et al. Calcium dynamics in astrocyte processes during neurovascular coupling. Nat Neurosci. 18 (2), 210-218 (2015).
  17. Agarwal, A., et al. Transient Opening of the Mitochondrial Permeability Transition Pore Induces Microdomain Calcium Transients in Astrocyte Processes. Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

NB H
Культивирование в естественных условиях-как мышиных астроциты, используя протокол быстрый, простой и недорогой AWESAM
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.