В естественных условиях Обнаружение и анализ SUMOylation белка Rb в клетках человека

Точный контроль клеточного цикла прогрессии в эукариотических клетках основан на жесткой регулирования сети, которая гарантирует, что конкретного события происходят в упорядоченной форме^1,2. Одним из ключевых игроков в этой сети является белка ретинобластомы (Rb), первый клонированный опухоли подавитель^1,3. Считается, что белка Rb негативный регулятор клеточного цикла прогрессии, особенно для G0/G1 S фазового перехода, и опухоль роста^4,5. Неспособность РБ функции либо непосредственно приводит к наиболее распространенных злокачественных внутриглазных в детей, ретинобластома, или способствует развитию многих других видов рака⁵. Кроме того Rb участвует в многих клеточных пути, включая дифференцировки клеток, chromatin remodeling и апоптоз, митохондрии опосредованной^3,6,7.

Столб-поступательные изменения играют ключевую роль в регуляции RB функция^8,9. Фосфорилирование является одной такой модификации, и это обычно приводит к инактивации РБ. В неработающем G0 клеток Rb активен с уровнем низких фосфорилирования. Как клетки прогресс через G0/G1 фазе, Rb, последовательно гипер фосфорилированных ряд белков циклин зависимых киназ (CDKs) и циклинов, например циклин E/CDK2 и циклин D/CDK4/6, который инактивирует РБ и устранить ее способность подавлять клеточный цикл связанные с генной выражение^4,10. RB также может быть изменен маленький убиквитин связанных модификатор (сумо)^11,12,13.

Сумо это убиквитин как белок, который ковалентно придается ряд белков-мишеней. Это важно для различных клеточных процессах, включая регуляции клеточного цикла, транскрипция, белка клеточной локализации и деградации, транспорта и ДНК ремонт^{14,,1516, 17 , 18}. спряжение путь сумо состоит из димерной сумо E1 активации фермента SAE1/UBA2, единого E2 спрягать фермента Ubc9, несколько ligases E3 и сумо конкретных протеаз. Как правило должны обрабатываться зарождающейся сумо белки proteolytically для создания Зрелые формы. Зрелые сумо активированную гетеродимера E1 и затем передана фермента E2 Ubc9. Наконец C-терминал глицин сумо ковалентно конъюгированных для целевого лизин субстрата, и этот процесс обычно способствует E3 ligases. СУМО белка могут быть удалены из модифицированных субстрата конкретных протеаз. Предыдущего исследования, авторы этого документа показали, что SUMOylation РБ увеличивает его привязки к CDK2, ведущих к гипер фосфорилирования в ранней фазе G1, процесс, который необходим для клеточного цикла прогрессии¹³. Мы также показали, что потеря РБ SUMOylation вызывает снижение пролиферации. Кроме того было недавно продемонстрировано, что SUMOylation РБ защищает белка Rb от протеосомной оборот, тем самым увеличивая уровень белка Rb в клетках¹⁹. Таким образом SUMOylation играет важную роль в РБ функции в различных клеточных процессах. Для дальнейшего изучения, функциональным последствием и физиологической значимости РБ SUMOylation, важно разработать эффективный метод для анализа состояния сумо РБ в человеческих клеток или тканей пациента.

SUMOylation является обратимой, высоко динамичный процесс. Таким образом обычно трудно обнаружить сумо модифицированные белки полностью эндогенного условиях. Этот документ представлен метод обнаружения эндогенного РБ SUMOylation. Кроме того он показывает, как обнаруживать экзогенных SUMOylation РБ одичал типа Rb и его сумо недостаточным мутации¹¹. В частности Jacobs et al. описал метод для увеличения сумо модификации данного субстрата конкретно на Ubc9 направленного синтеза SUMOylation (Рассматриваемое)²⁰. На основе этого метода, этот протокол описывает как анализировать принудительного SUMOylation РБ и ее функциональных последствий. Учитывая, что сотни субстратов сумо были описаны ранее, и было выявлено более предполагаемый сумо субстратов из многих на основе протеомных анализов, этот протокол может применяться для анализа сумо модификация этих белков в клетках человека.

1. Обнаружение эндогенного SUMOylation РБ на ранней фазе G1

1. клетки культуры и клеточного цикла синхронизации.
   1. Поддерживать HEK293 клетки в среднего роста, содержащие Дульбекко ' s Modified Eagle среднего (DMEM) дополнены 1% перо-стрептококк и 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) при 37 ° C и 5% CO ₂ в инкубаторе.
   2. Синхронизация HEK293 клетки в G0 этап.
      1. Фото HEK293 клетки, с помощью Горяева и семян ~1.5 x 10 ⁷ клеток в 15 см блюдо с 25 мл средний рост за 24 часа до начала лечения. После достижения впадения аспирата 70% - 80%, средних и вымыть клетки дважды с 5 мл подогретую фосфат амортизированное saline (PBS).
      2. Добавить 25 мл DMEM, содержащей 1% пенициллина и стрептомицина и инкубации клеток при 37 ° C за 72 ч. вымыть клетки от пластину с помощью 3 мл ледяной PBS. Перевести клетки в новой трубки 5 мл.
      3. Анализ клеточного цикла подвергать небольшая часть клеток подачей cytometry (шаг 1.2); сбор оставшихся большинство клетки центрифугированием на 200 x g 5 мин при комнатной температуре и затем сохранять их в ультра нижней температуры морозильной камеры до анализа из РБ SUMOylation.
   3. Получить G1-фаза клетки, в конце процесса синхронизации G0, удалите DMEM и добавить обратно свежие рост средний, таким образом позволяя HEK293 клетки, чтобы повторно войти клеточного цикла. Затем, собирать клетки на различных этапах G1 (раннего G1: 30 min; G1: 2 h) для клеточного цикла пробирного анализа и дальнейшего сумо.
   4. Синхронизация HEK293 клеток в S фазе с помощью метода двойной тимидина блока.
      1. Клетки растут HEK293 confluency 50% и вымыть клетки с подогретую PBS. Затем добавьте среднего роста, дополнена тимидина 2,5 мм для 18 h (первый блок).
      2. Удаление среднего, тимидина содержащих, а затем вымыть клетки дважды с подогретую PBS. Добавить свежие роста среднего для 14 h освободить клетки.
      3. Отменить в среду с пипеткой и добавить среднего роста, дополнена тимидина 2,5 мм для другой 18 h (второй блок) до проведения анализа клеточного цикла и РБ SUMOylation.
   5. Для G2/М синхронизации, плита ~1.5 × 10 ⁷ HEK293 клетки в 15 см блюдо с 25 мл средний рост за 24 ч. Затем добавьте Нокодазол к средству до конечной концентрации 400 нг/мл. Наконец, инкубации клеток для 16 h до проведения анализа клеточного цикла и РБ SUMOylation.
2. Анализ клеточного цикла подачей cytometry.
   1. Вновь приостановить синхронизированные HEK293 в PBS и затем исправить суспензию клеток с помощью ледяной 70% этиловом спирте 2 h на 4 ° C. Обратите внимание, что к минимуму клеток кластеризации, добавьте суспензию клеток каплям ледяной 100% этанола для получения конечной концентрации 70% этиловом спирте во время нежно vortexing.
   2. Центрифуга клетки для 5 мин на 500 x g, затем тщательно удалить супернатант и вымыть клетки дважды с PBS. Повторите шаг центрифуги.
   3. Добавить 500 мкл PBS содержащие 50 мкг/мл нуклеиновых кислот пятна пропидий йодидом, 0.1% тритон X-100 и 1 мкг/мл РНКазы A к клеткам и хорошо перемешать. Инкубировать клетки для 15 мин при 37 ° с.
   4. Хранить образцы на 4 ° C до анализа подачей cytometry.
3. Иммунопреципитации эндогенного белка Rb.
   1. Подготовить HEK293 lysates клетки.
      1. Lyse синхронизированных клеток HEK293, нежно вновь приостановить их в 1 мл ледяной радио иммунопреципитация пробирного буфера lysis (RIPA) (Таблица 1), содержащий свежие добавил 20 мм N-Ethylmaleimide, ингибитор isopeptidase, которые могли бы блокировать сумо протеаз и стабилизировать сумо конъюгатов.
      2. Далее гомогенизировать клетки на льду Dounce гомогенизации, sonication или просто проходящей через 10 раз через 21 G иглу на шприц 2 мл. Затем, инкубации клеток на льду на 5 мин
         Примечание: Анионные стиральный порошок натрия лаурилсульфат (СДП) в буфер RIPA имеет решающее значение для последующего определения Rb-сумо, как он может устранить неспецифических сигнал сумо, который является производным от non ковалентные взаимодействия между белка Rb и другими -Rb сумо видов.
   2. Центрифуга lysates клетки на 18,000 x г за 30 мин при 4 ° C. передать новый 1,5 мл микро-пробирок supernatants.
      Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. Белки могут храниться при температуре-80 ° C для по крайней мере 6 месяцев.
   3. Подготовить элемент управления вводом каждого образца для более поздних западной помарки, сохранить небольшую часть описанных выше супернатант новой трубки и магазина на -80 ° C.
   4. Для выше supernatants, добавить 1 мкг мыши неспецифических иммуноглобулинов G (IgG) того же вида и изотипа моноклональные антитела РБ, а также 20 мкл 50% протеина A/G-sepharose шлама. Затем, инкубировать 1 час при 4 ° C с нежным вращение.
   5. Центрифугуйте образцы на 3000 x g 3 мин при 4 ° C. тщательно собирать supernatants не нарушая бисер и передавать их на новый 1,5 мл микро-пробирок. Для каждого из образцов добавьте 5 мкл РБ основное антитело и 40 мкл 50% белка A/G-sepharose навозной жижи. Затем, инкубировать на ночь при 4 ° C с нежным вращение.
   6. Собирать бусы центрифугированием в 3000 x g 3 мин при температуре 4 ° C и тщательно удалить супернатант, закупорить. Обратите внимание, что для того, чтобы избежать потери шарик, не аспирационная сухой бусины.
   7. Мыть бусины четыре раза с 1 мл раствора в буфер RIPA. Каждый раз, mix трубы хорошо ротации их на 4 ° C на 15 мин собирать бусы центрифугированием низкой скорости на 3000 x g 3 мин при температуре 4 ° C и затем удалить supernatants.
   8. После удаления supernatants из окончательной стирки, вновь приостановить бусины в 30 мкл 1 x натрия Додециловый сульфат полиакриламидных гель электрофореза (SDS-PAGE) загрузки буфера (Таблица 1) и хорошо перемешать.
      1. Инкубировать трубы при 100 ° C в жару блока за 10 мин Центрифугуйте образцы на 12000 g x 1 мин для пеллет бисер. Тщательно собирать supernatants не нарушая бисер и передавать их на 1,5 мл микро-пробирок.
   9. Анализ образцов градиента SDS-PAGE 4-20% гель и западной помарки или хранить их при-20 ° C для последующего использования.

2. Анализ 6XHis-тегами экзогенных SUMOylation Rb в клетках человека

1. клетки культуры и transfection.
   1. Семя ~ 6 × 10 ⁶ HEK293 клетки в 10 см блюдо и проинкубируйте 24 ч в среднего роста в условиях нормальной клеточной культуры приобрести 75% - 85% вырожденная клетки. Перед трансфекции, удалите среднего роста и добавить 6 мл подогретую сокращение сыворотке среды (см. Таблицу материалы) и затем поместите блюда обратно в инкубатор.
   2. Для РБ учредительного SUMOylation assay, добавьте 15 мкг 6XHis-тегами Rb-Ubc9-WT, Rb-Ubc9-C93S, Ubc9-WT и Ubc9-C93S плазмид в 500 мкл сокращение сыворотке среде в 1,5 мл микро-пробирок, соответственно.
      1. Для анализа сумо спряжение дикого типа Rb и его SUMOylation дефектные мутант, смешать 10 мкг либо 6XHis-тегами плазмида Rb-WT или Rb-K720R вместе с GFP-SUMO1 (10 мкг) в 500 мкл сокращение сыворотке среднего в 1,5 мл микро центрифуга трубы ¹³.
   3. Между тем, в отдельном трубку, смешайте 50 мкл Реагента трансфекции (см. Таблицу материалы) в 500 мкл сокращение сыворотке среднего и инкубации при комнатной температуре на 5 мин
   4. Полностью объединить два отдельных труб, описанных выше и инкубации при комнатной температуре 15 мин добавить трансфекции реагент/плазмида комплексов в клетки и продолжают культуры для 8 h на 5% CO ₂ и 37 ° C.
   5. Заменить сокращение сыворотке среднего роста среднего и инкубировать после transfection клетки в условиях нормальной культуры для 48 ч.
2. Никель сродство тянуть вниз белка Rb 6XHis-тегами.
   1. Лизируют transfected клеток HEK293 и экстракт всего белки как описано в разделе 1.3.1.
   2. Центрифуг lysates клетки на 18,000 x g за 30 мин при 4 ° C. тщательно собирать supernatants и передавать их на чистой трубы.
      Примечание: Белка могут быть заморожены в этот момент для более чем 6 месяцев -80 ° C.
   3. Подготовить элемент управления вводом каждого образца для более поздних западной помарки, сохранить небольшую часть supernatants, описанных выше на новой трубки и магазина на -80 ° C.
   4. Мыть 25 мкл 50% никель Нитрилотриуксусная кислота (Ni-НТА) агарозы бусины с Буфер RIPA дважды в микро пластиковых пробирок 1.5 мл для каждого образца. Собирать бусы центрифугированием в 3000 x g 3 мин при 4 ° C.
   5. Добавить 1 M имидазола для каждого образца для получения конечной концентрации 10 мм. Затем добавьте каждый образец в пробирку, содержащую подготовленный бусины агарозы Ni-НТА.
   6. Инкубировать бусины и лизатов втечение 2 ч при 4 ° C с нежным вращения. Спиновые бусы на 3000 x g 3 мин при температуре 4 ° C и тщательно удалить supernatants, закупорить. Чтобы избежать потери шарик, не аспирационная сухой бусины.
   7. Мыть бусины с 1 мл раствора мыть буфер, содержащий 20 мм имидазола (Таблица 1). Каждый раз, mix трубы хорошо вращением на 4 ° C на 15 мин собирать бусы спиннинг на 3000 x g 3 мин при температуре 4 ° C и отбросить supernatants.
   8. После окончательной стирки, добавить 30 мкл Элюирующий буфер содержащий 250 мм имидазола (Таблица 1) для каждой выборки и Флик смешивать. Затем, Проинкубируйте 20 мин при 4 ° C до элюировать белки.
   9. Смесь каждого образца с 6 × SDS-PAGE загрузки буфера (Таблица 1). Затем, инкубировать трубы при 100 ° C в блоке тепла на 10 мин
   10. Центрифуг на 12000 x g за 1 мин до Пелле бисер. Тщательно собирать supernatants не нарушая бисер и передавать образцы 1,5 мл микро-пробирок. Образцы могут быть проанализированы на западной помарке или температуре-20 ° C для последующего использования.

3. Западной помарке

1. загрузить иммунопреципитации или тянуть вниз образцы, полученные из предыдущих шагов на градиент гелях SDS-PAGE 4-20%. Проводить электрофорез на 120 V 90 мин отделить белки.
2. Передачи белки от геля винилидена фторид (PVDF) мембраны, electroblotting на 300 мА для 90 мин при 4 ° C, с использованием метода transfer танк. Блокировать PVDF мембрану в блоке буфер, содержащий 5% обезжиренное молоко (Таблица 1) за 1 ч при комнатной температуре.
3. Инкубировать мембраны с основное антитело в буфер разбавления антитела, содержащий 3% бычьим сывороточным альбумином (БСА) (Таблица 1) на ночь при 4 ° C. Для первичных антител, использовать рабочую концентрацию 0,5 мкг/мл (антитела анти SUMO1), или разбавления 1: 2000 (анти Rb и анти тубулин антитела), или 1:5,000 (анти GFP и против его антитела).
4. Мыть мембраны 3 x 10 минут каждый раз, когда с помощью 1 x трис амортизированное saline с буфером анимации (TBST) (Таблица 1). Проинкубируйте мембрану с видов HRP пероксидазы хрена конъюгированных вторичные антитела разбавленных 1:5,000 в блоке буфер, содержащий 5% обезжиренное молоко (Таблица 1). Промойте мембрану 3 x 10 минут каждый раз, используя буфер 1 x TBST.
5. Проинкубируйте мембрану с увеличенная хемолюминесценция (ЭСЛ) рабочим раствором. Покрытие мембраны с полиэтиленовой пленкой и подвергать рентгеновской пленки, в зависимости от силы сигнала.

Обнаружить эндогенного РБ SUMOylation во время цикла клетки прогрессии, это исследование первой синхронизации HEK293 клеток на пяти различных стадиях клеточного цикла (G0, раннего G1, G1, S и G2/М), как описано в разделе протокол этой бумаги. Качество синхронизации было подтверждено с помощью пятен нуклеиновой кислоты с пропидий йодидом следуют cytometry анализ потока (рис. 1). Далее клетки были собраны и анализироваться, денатурации Буфер RIPA. СУМО ингибитора протеаз, N-Ethylmaleimide, был добавлен в конечной концентрации 20 мм для сохранения родной сигнал сумо в ходе экспериментов. После иммунопреципитации эндогенного видов РБ под денатурации условий блокировать non ковалентные неспецифических взаимодействия и следующие Вестерн-блот с использованием антител анти SUMO1, наличие сигнала сумо специально был обнаружен на ранние фазы G1 (рис. 2). Хотя глобальные SUMOylation был расширен на этапе S/G2/М, на время точки РБ SUMOylation, оно не изменилось (рис. 2, панель ввода). Этот вывод свидетельствует о том, что SUMOylation РБ не является просто следствием изменения глобальной деятельности спряжение сумо. Таким образом эти результаты показывают, что белок иммунопреципитации и западной помарки анализа, описанных в данном документе позволяют для обнаружения SUMOylation эндогенного белка Rb.

Чтобы обнаружить принудительного SUMOylation белка Rb, это исследование генерируется учредительного SUMOylated РБ построить путем сплавления Ubc9, единственным лигаза сумо E2, чтобы его C-терминала, позволяя для эффективной и селективного SUMOylation РБ (рисA). Потеря функции мутации Ubc9, C93S, также сливается с C-терминал РБ в качестве элемента управления (рис. 3А). Для дальнейшего укрепления специфика сигнала сумо-Rb, только не сливается Ubc9 был построен также. Все четыре его меткой плазмид были transfected в HEK293 клетки за 48 ч до того, как они были лизированы в буфер RIPA, дополнены 20 мм N-Ethylmaleimide. Все белки затем были подвергнуты тянуть вниз пробирного, как описано в разделе Протокол этого документа. Eluted РБ белки были проанализированы западную помарку. Ubc9 фьюжн поручил SUMOylation РБ был обнаружен с помощью антител анти SUMO1 (рис. 3B, Группа SUMO1), тогда как дефектные мутации Ubc9, C93S, не производят этот сигнал. Обратите внимание, что высокоэффективных сумо изменения, вызванные Ubc9-фьюжн приводит к более высокой молекулярной массой группа, которая может даже непосредственно обнаружить с помощью РБ антитела, и он соответствует сумо сигнал (рис. 3B, Группа РБ). Кроме того Ubc9 только не вызывает каких-либо сумо спряжение, далее подтверждение Rb конкретных SUMOylation (рис. 3B).

Потому что SUMO1 спрягаются в лизине 720 белка Rb11, для дальнейшего анализа РБ SUMOylation, это исследование создан сумо недостаточным мутации, заменив это остаток лизина аргинин (K720R). Для облегчения обнаружения сумо сопряжения двух белков временно выраженной РБ, конструкцию GFP-SUMO1 был добавлен для повышения внутриклеточного сигнала сумо. Его меткой дикого типа или мутант РБ был совместно transfected в HEK293 клетки вместе с GFP-SUMO1, а затем вытяните вниз пробы и анализ возможностей сопряжения РБ-SUMO1. Как отмечалось, K720R мутант полностью отменена сумо модификация РБ, дальнейшее укрепление предложенного метода способность обнаруживать РБ SUMOylation (рис. 4).

Рисунок 1 : Проверка клеточного цикла синхронизации пробирного подачей cytometry. HEK293 клетки были культивировали и синхронизированы в G0, G1 раннего, S G1 и G2/M фазы клеточного цикла, как описано в настоящем Протоколе. Клеточный цикл распределения были определены активирован флуоресценции клеток, сортируя (FACS). Представленных данных показывает пример количественного анализа пробирного СУИМ (n = 1). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 : Rb-SUMOylated в ранней фазе G1. HEK293 клетки были синхронизированы на различных стадиях клеточного цикла, как описано в настоящем Протоколе. Клетки были собраны и анализироваться в буфер RIPA, дополнены 20 мм N-Ethylmaleimide. Элементы управления вводом были загружены на градиент геля SDS-PAGE 4-20%, переведены и смыл с анти SUMO1 и анти тубулин, как указано. Затем оставшиеся lysates клетки подвергаются иммунопреципитация, используя антитела анти Rb в разведении 1: 200. Полученный eluents были отделены от градиента геля SDS-PAGE 4-20% и immunoblotted с использованием антител анти SUMO1 и антитела анти Rb. Этот эксперимент был повторен дважды с одинаковым результатом. Эта цифра была изменена с разрешения13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3 . Обнаружение сумо-модификации синтез белка Rb-Ubc9. (A) схема Ubc9 направленного синтеза SUMOylation (Рассматриваемое) конструкций РБ. (B) учредительного SUMOylation РБ вызванных Рассматриваемое. HEK293 клетки временно transfected с его меткой Рассматриваемое конструкции были лизированы в буфер RIPA с 20 мм N-Ethylmaleimide. Общая lysate каждого образца был инкубировали с бисером агарозы Ni-НТА снести его меткой Rb-Ubc9 синтез белков или Ubc9 (используется как отрицательный контроль), соответственно. Очищенные белки были отделены от градиента геля SDS-PAGE 4-20% и immunoblotted с анти SUMO1 и антител против его. Его-Rb: 6XHis меткой Rb-Ubc9 синтез белков; Его-Ubc9: 6XHis меткой Ubc9 только. RB-Ubc9: неизмененные Rb-Ubc9; RB-Ubc9-S: SUMOylated РБ Ubc9; Hyper ПРБ Ubc9: гипер Rb-Ubc9 фосфорилированных. Результаты, показанные на рисунке представляют три независимых испытаний. Эта цифра была изменена с разрешения13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4 . СУМО недостаточным K720R мутации уменьшает SUMOylation РБ. HEK293 клетки были временно совместно transfected с дикого типа или мутант Rb-его конструкции вместе с GFP-SUMO1. Клетки были собраны и анализироваться в буфер RIPA, дополнены 20 мм N-Ethylmaleimide. Небольшая часть лизатов непосредственно был проанализирован западной помарки как элемент управления вводом. Остальная часть лизатов инкубировали с бисером агарозы Ni-НТА снести его меткой РБ белки, как описано в настоящем Протоколе, и они были immunoblotted с анти SUMO1 и антител против его. Обратите внимание, что мутации лизина и аргинина в 720 РБ малышсоюзник отменяет сумо модификации этого белка. Эксперимент проводился один раз с аналогичный результат, сообщалось ранее11. Эта цифра была изменена с разрешения13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Таблица 1: Решения и буферов.

Авторы не имеют ничего сообщать.