Методическая статья

Стереологических Оценка числа дофаминергических нейронов в Substantia мыши, с помощью оптических фракционатор и стандартных микроскопии оборудование

DOI:

10.3791/56103

⸱

1 сентября 2017 г.

 ,  , 
1Department of Neurology, University Hospital of Würzburg

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа представляет пошаговые протокол для объективной стереологических оценки числа дофаминергических нейронов клеток в Substantia мыши, с помощью микроскопии стандартного оборудования (т.е., световой микроскоп, моторизованные объекта таблицы (x, y, z плоскость) и общественное достояние программного обеспечения для анализа цифровых изображений.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В болезнь Паркинсона доклинические исследования анализ Нигростриарный тракта, включая количественную оценку дофаминергической нейрон потери в пределах substantia nigra, имеет важное значение. Для оценки числа общей дофаминергической нейрон, объективной stereology с помощью метода оптического фракционатор в настоящее время считается золотым стандартом. Поскольку теория оптических фракционатор метод является сложным и stereology трудно добиться без специализированного оборудования, несколько коммерчески доступных полный stereology систем, которые включают необходимое программное обеспечение существует, чисто для подсчета причин ячейки. Поскольку приобретение специализированного stereology установки не всегда возможно, по многим причинам, этот доклад описывает метод для стереологических оценки дофаминергической нейрональные клетки подсчитывает с использованием стандартных микроскопии оборудования, в том числе световой микроскоп, моторизованные таблицы объектов (x, y, z плоскости) с изображений программное обеспечение и компьютер для анализа. Дается подробное объяснение на как выполнить стереологических количественной оценки, с помощью метода оптического фракционатор, и предоставляются запрограммированные файлы для расчета сметных клеток. Чтобы оценить точность этого метода, было выполнено сравнение данных, полученных из коммерчески доступных stereology аппарат. Числа сопоставимых клеток были найдены с помощью этого протокола и stereology устройство, продемонстрировав тем самым точность этого протокола для объективной stereology.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Количественная оценка количества нейрональных клеток играет важнейшую роль в доклинических болезнь Паркинсона исследования для определения уровня нейродегенеративные в1,nigra substantia (SN)2. Объективной оценки стереологических клеток количество интерес в регионе считается золотым стандартом3,4,5.

До появления объективной stereology количество нейронов в разделах оценивалась путем манипулирования профили подсчет клеток исправить для переменной вероятностей, что нейроны вступают в прицел в секции. Одним из наиболее часто используемых методов была коррекция количественных клеток характеризуется Аберкромби6. Этот метод попытался принять во внимание, что клетки могут быть количественно более одного раза, если фрагменты же клетки находятся в прилегающих шлифов. Поэтому Аберкромби и другие авторы генерируется уравнений, которые требуют предположений о форме, размер и ориентацию в подсчет клеток7,8. Однако эти предположения были обычно не понял и поэтому привело к систематической ошибки и расхождения из числа фактических ячейки (то есть, смещения). Кроме того смещение не может сводиться на дополнительные выборки3.

Для стереологических оценки числа клеток с помощью оптических фракционатор математические принципы применяются непосредственно оценить число клеток непосредственно в определенных, 3-мерного объема. Преимуществом этого метода является, что она не предполагает предположения о форму, размер и ориентацию подсчитываемое клеток. Таким образом число оценкам клеток ближе к подлинным ценностям и ближе, как размер выборки увеличивается (т.е. объективное)3. Потому что многие правила должны соблюдаться при использовании stereology держать метод объективной, готовые к использованию коммерческих stereology системы были разработаны (для обзора, см Schmitz и Hof, 20054). Специализированных stereology систем реализации дизайн-методы на основе стереологических с априори определены зондов и схем отбора проб для стереологических оценок, которые приводят к независимости от формы, размера, пространственное распределение и ориентации клетки, чтобы быть проанализированы4,9. Однако коммерчески доступных stereology системы являются дорогостоящими; Это может ограничить осуществление в новых исследований.

Целью данного исследования было разработать полезная методика на основе дизайна стереологических оценки дофаминергической клеток мыши SN, используя стандартные микроскопии оборудования (то есть, свет и метод оптического фракционатор Микроскоп, стандартные Микроскоп программного обеспечения и моторизованных x, y, z этап). Для этого представлено пошаговое руководство по как обрабатывать ткани мозга мыши и как оценить SN числа клеток с помощью дизайн на основе объективной stereology. Кроме того предоставляются шаблоны для расчета числа оценкам клеток и коэффициентов ошибки (CE).

Метод, описанный здесь не ограничивается анализ SN, но могут быть адаптированы для использования в других анатомически определенных регионах мозга мыши или крысы. К примеру объективной stereology был использован для оценки числа нейрональных клеток в гиппокампе10 и Локус пятно11. Кроме того типы клеток помимо нейронов, например астроциты12 и микроглии13, можно оценить как хорошо. Таким образом этот метод может быть полезным для ученых, которые намерены реализовать объективной stereology в их исследований, но не готовы тратить много денег на покупку stereology системы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

были соблюдены все применимые международные, национальные и/или институциональных руководящих принципов для ухода и использования животных. Протокол был одобрен местными властями на Regierung фон Унтерфранкен, Вюрцбург, Германия.

1. обработка ткани и иммуногистохимии

  1. Euthanize мышей с CO 2, или любой другой утвердил метод.
  2. Perfuse шесть 12-недельных C56Bl/6Н мышей-самцов transcardially с 10 мл 0,1 М фосфат амортизированное saline (PBS) с помощью иглы 25-G и инфузионный насос, после чего 70 мл 4% параформальдегида (PFA) в PBS 0,1 М.
    ОСТОРОЖНОСТЬЮ: PFA аллергенные, токсичными и канцерогенными.
  3. Вскрыть мозга мыши в корональных плоскости с матрицей срез мозга в регионе +0.74 мм от Bregma (рис. 25, Paxinos и Франклин мыши мозга Атлас 14).
  4. Поместить в спинной части мозга, SN, в том числе в 4% ПФА в 0,1 М PBS для 1 d на 4 ° C для погружения фиксации.
  5. Обмен PFA для 30% сахарозы/0,1 моль PBS решения для крио защиты и инкубировать еще 2 d на 4 ° C.
  6. Поставить спинной частью мозга в cryomold заполнены с температурой оптимального раскроя (OCT) соединения и медленно замораживания тканей в жидкий охлажденный сухим льдом изопентана.
    ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Сухой лед очень холодно (-78 ° C); использование средств индивидуальной защиты (СИЗ), включая перчатки, работая с сухим льдом. Сухой лед испаряется в CO 2; Таким образом, работа под зонт.
  7. Серийно сократить 30 мкм крио секции в корональных плоскости и собирать разделы, начиная 2.46 мм от Bregma (рис. 51, Paxinos и Франклин мыши мозга Атлас 14) и заканчивая 4.04 мм от Bregma (рис. 64, Paxinos и Франклин мыши мозга Атлас 14).
  8. Хранить четыре серии в трубах, которые заполнены с криопротектора (30% глицерина, этоксиэтанол 30% и 40% PBS) при-20 ° C. В процессе резания, Марк правого полушария, проколов небольшое отверстие в верхней области мозга.
  9. Для иммуногистохимическое окрашивание, выберите один из ряда секций на мышь. Preincubate свободно плавающего разделы за 1 час в 10% нормальной козьего сыворотки (NGS)/2% BSA/0.5% моющее средство в 0,1 моль PBS на шейкер. Проинкубируйте разделы с кролик борьбе мыши тирозин гидроксилазы (TH; 1:1,000 разрежения) антитела разводят в 2% NGS/2% BSA/0.5% моющее средство в 0,1 моль PBS на ночь на 4 ° C.
  10. Применить средней антител против кролик Igs (разбавления 1: 100) за 2 ч при комнатной температуре, затем авидин/биотина реагента (разбавления 1: 100). Инкубировать и пятна с 3,3-Диаминобензидин tetrahydrochloride (DAB) и H 2 O 2. Смонтировать разделы после окрашивания их на слайдах с покрытием объект.
    Примечание: TH + дофаминергические нейроны SN показаны на рисунке 1a. Путем пятнать одной серии в среднем 13 разделов SN, простирающейся от ростральной к хвостовой части SN pars compacta (SNpc) и сетчатая, запятнаны на животное ( рис. 1b). Разделов, разделенных 120 мкм (1/4 серии) ( рис. 1 c).
    ОСТОРОЖНОСТЬЮ: DAB является подозреваемых канцерогенов. Он является токсичным и ингаляции. Использование средств индивидуальной защиты при работе с DAB.

2. Получение изображений

  1. immunohistochemically й захватить окрашенных SN секции цифровой подписью с использованием изображений программное обеспечение, которое сочетается с микроскопом. Отдельно анализировать каждый раздел одной серии.
  2. Параметр сканирования слайдов изображений программного обеспечения. Сохранить в формате TIFF для высокого качества изображения (Рисунок 2).
    Примечание: Разрешение изображения – 312 пикселей на см.
  3. Пресс " приобрести " для открытия окна приобретение (рис. 2a).
  4. Присвоено биннинга " 2 " для изображений в градациях серого.
    Примечание: Приобретение изображений в градациях серого вместо цветные картинки уменьшает размер файла изображения окончательного стека (Рисунок 2a).
  5. Нажмите на " шоу Live " в окне приобретения, чтобы открыть новое окно, показывающее live-образ секции (рис. 2 и b).
  6. Нажмите на " стадии " в окне приобретения. Выбрать " сканирования слайдов " в выпадающем меню и установите флажок (рис. 2 c).
    Примечание: Это позволяет приобретение и выравнивание сильно увеличенное SN изображений (630 X увеличение) в x, y самолет, а также приобретение стека изображений с расстоянием между последовательных изображений 1 мкм в плоскости z, охватывающих ряд всего 13 µ м.
  7. выберите 2,5 X цель для поиска SN.
  8. Изменить цель 63 х.
  9. Определяют верхний левый угол (TopLeft) (рис. 2 c) и правом нижнем углу (LowRight) (Рисунок 2d) раздел, нажав на " компл. "
  10. Нажмите на " Z-серии " и проверить " плоскости Z серии " поле (рис. 2е).
  11. Определение фактической навесные толщина секций на три произвольно выбранных подсчета сайтов каждой секции с помощью визуализации программного обеспечения. Для этого, нажмите на " вид сверху смещение " для определения верхней секции (рис. 2е) и затем нажмите на " остановить просмотр Top " (Рисунок 2f). После этого, нажмите на " вид снизу смещение " (Рисунок 2f) и затем нажмите на " остановить просмотр нижней " (рис. 2г). Запишите толщина секции.
  12. Вычесть 3 мкм (охранник зоны) от верхней смещение и введите результат в верхний слот смещения (рис. 2 h). Вычесть 13 мкм (высота оптической disector) из верхнего смещения числа и введите результат в нижний слот смещения (рис. 2i). Выберите следующие параметры: шаги, 14; размер, 1.00 (Рисунок 2i).
    Примечание: Это соответствует толщине в плоскости z 13 мкм, с расстоянием между последовательных изображений 1-мкм.
  13. Выберите папку для сохранения файла (Рисунок 2j).
  14. Нажмите на " последовательность " чтобы начать приобретение (Рисунок 2j).
  15. Нажмите на " обработки " и выберите следующие параметры: " все самолеты, " от " последовательностей; " " монтаж; " и " быстро " и " колющие " коробки, с напуском изображения на 10% (рис. 2 k). Начинают стежка изображения, нажав на " начать ".
    Примечание: Это будет генерировать стека изображений для анализа (рис. 2 l, Рисунок 3a -e).

3. Последовательность стереологических оценки

  1. выполнять анализ SN стека изображений с помощью NIH ImageJ программного обеспечения версии 4.7.
  2. Скачать два плагинов, которые необходимы на веб-сайте ImageJ.nih.gov: " наложение сетки " плагин 15 и " счетчик соматических клеток " плагин 16. Установите оба плагины, как описано.
  3. Для объективной оценки стереологических, определяют подсчета параметры следующим образом: размер сетки, 130 x 130 мкм; учет кадров, 50 x 50 мкм; и оптических disector высота, 13 & #181; м.
  4. Открыть изображение, нажав на " файл " → " открытые " (рис. 4a) Задать масштаб изображения с помощью " анализ " → " задайте шкала " команды (рис. 4В). Для этого шага, изменить определенный размер пикселей до мкм (рис. 4 c).
    Примечание: Для анализируемого изображений, 425 пикселей соответствует 100 µm.
  5. Выберите " плагины " → " сетка " → " тип сетки: линии " команды случайно включить сетку. Проверить " случайное смещение " поле. Определить размер одного квадрата в сетке (сетка квадрат) как 130 мкм x 130 мкм = 16,900 мкм 2 ( Рисунок 3b и Рисунок 4 d и e).
  6. Изменить тип от изображения 16-бит RGB цвет (нажмите на " изображение " → " типа " → " цвет RGB ") (Рисунок 4f). Найдите SNpc, как описано в Baquet и др. 17. окружить SNpc с " инструмент кисть " (кисть ширина: 11) ( рис. 3 c и Рисунок 4 g -я).
  7. Отменить " задайте шкала " команды, нажав " анализ " → " задайте шкала " → " нажмите, чтобы удалить масштабах " (Рисунок 4j -l) для обеспечения производительности вычислений в пикселях скорее чем мкм.
  8. Сделать скриншот (рис. 4 m), сохраните файл изображения и откройте новый файл с ImageJ (Рисунок 4n). Выберите " точки " (Рисунок 4o) и кисти шириной 25 (Рисунок 4 p). Марк каждого квадрата сетки, что контакты SN для размещения оптического disector (Рисунок 4q). Выполнить анализ количества клеток всех оптических disectors, которые локализуются полностью или частично в рамках намеченных SN.
  9. Выбрать одного квадрата сетки, которая включает в себя части SN. Мера в левом верхнем углу этой площади с курсором в ImageJ определить x и y координаты, чтобы начать с (Рисунок 4r).
    Примечание: Координаты будут вставлены для позиционирования с помощью оптических disector " оптических disector позиции " (Рисунок 4s), как описано в шаге 4.
  10. Расчета оптических disector позицию, используя шаблон электронной таблицы под названием, " оптических disector позиция, " как описано в шаге 4.
  11. Калибровки оптических disector (автор Кристофер Уорд S., Дополнительный файл макроса), нажав на " плагины " → " макросы " → " редактировать " (Рисунок 4Т), откройте " opt_dis_ Grid.txt " файл (Рисунок 4u) и определить размер " usergrid " в точках, которые соответствует x, y измерение оптической disector (рис. 4В). Выберите размер 50 мкм, мкм x 50, так что размер одной стороны usergrid определяется как 212,5 пикселей (50 x 4,25 пикселей).
  12. Определить положение оптического disector в изображении стека, вставив ImageX и ImageY координаты, определяющие центр оптической disector (рис. 4В). Запуск макроса (" макросы " → " выполнить макрос ") (Рисунок 4w).
    Примечание: Сетки исчезнет из стека изображений ( 3d рисунок и Рисунок 4 x). Оптические disector будут сохраняться при переходе в плоскости z ( Рисунок 3e и Рисунок 4 x).
  13. Выберите " плагины " → " счетчик соматических клеток " чтобы начать плагин счетчик соматических клеток (Рисунок 4y). Инициализировать счетчик клеток и выберите тип маркера (Рисунок 4z). Увеличить изображение (нажмите на " + ") и выполнять стереологических оценки числа клеток при увеличении в 200%.
  14. Идентификация дофаминергических нейронов perikarya их округлые или овальные формы и ячейки размером ( рис. 1a). Подсчитать количество клеток, используя правила стереологических.
    Примечание: Поскольку оптический disector является 3-мерный куб ( Рисунок 5a), определите исключения сторонами как спереди, слева и верхней стороны куб (красный). Таким образом, Дон ' t фото й + клеток которые приходят в контакт с красной линии (левый и фронт) или верхней стороны. Добавьте результаты клеток в подготовленные таблицы файл под названием " расчет клеток " (шаг 5).
  15. Согласно СН изображения, вычисления следующего квадрата сетки для размещения оптического disector для следующего количества клеток, используя x, y шаги размер покрывающей сетки ( Рисунок 5b) и " оптический disector позиция " шаблон электронной таблицы, как описано в шаге 4.
  16. Выполнить оценку ячейки номер с помощью " расчет клеток " таблицы (шаг 5).

4. Расчет оптических Disector позицию с помощью " оптических Disector позиция " шаблон электронной таблицы

  1. вычислить размер и положение каждого оптических disector должен быть помещен в сетке вышележащих внутри контура SN ( Рисунок 5b) с помощью " оптических disector position.xlsx " файл электронной таблицы (Дополнительный файл).
  2. Вставить конверсия пикселей на мкм, как определено " задайте шкала " команды, в желтых отмеченные позиции " оптических disector position.xlsx " файл ( Рисунок 6a и дополнительных файлов ).
  3. Вставки в оранжевый отмеченные позиции запланированный размер оптических disector и размер квадрата сетки вышележащих сетки, определяется длина одной стороны (в мкм),.
    Примечание: Результаты изображены в Красные флажки Оранжевые прямоугольники.
  4. Начало с площади сетки в набросках SN, который был определен в качестве отправной точки (одного квадрата сетки был выбран с самого начала, как шаг 3.9, выше).
  5. Вставки, координаты x и y, измеряемый в шаге 3.9, в зеленые поля файла (используя эти значения, x, y координаты вычисляются центр оптической disector в течение этого первого квадрата, и результаты изображены в синие). Макрос opt_dis_grid.txt (Дополнительный файл).
  6. Вычисления x, y координаты подряд оптические disectors, вставив квадрата сетки расстояние (измеряется в количество квадратов) относительно первого квадрата сетки (коричневый коробки).
    Примечание: + x: ГРИД Сквер расположен справа; -x: ГРИД Сквер расположен слева; + y: ГРИД Сквер расположен на дно; -y: ГРИД Сквер расположен в верхней. Результаты отображаются в полях серый.

5. Оценки с использованием номер ячейки " расчет число ячеек " таблицы

  1. Calculate, предполагаемое количество ячеек й + SN на животных (N) с помощью формулы опубликованных на западе и др., 1991 3, где ∑ Q – определяется как общее количество й + нейронов, учитываются в всех оптических disectors секции одного мозга.
    Примечание: Высота оптической disector (h) по отношению к измеренной толщины секции (t) входит в уравнение. Площадь выборочная доля (asf) определяется как доля области (A) размер кадра оптических disector (оптический disector) в пределах площади размер сетки (x, y шаг) (оптический disector/A x, y шаг) ( рис. 3b) и разделе выборочная доля (ФСО) определяется как доля участков всей серийно отрезока мозга:
    figure-protocol-1
    для обеспечения высокого качества количественных оценок, коэффициент Ошибка (CE) должны быть ниже 0,10. Определить CE, с помощью формулы, Keuker и др., 2001 10:
    figure-protocol-2
  2. для стереологических оценки количества клеток в пределах SN каждого мышь, вставить указанной информации относительно общее количество созданных серии на мышь, высота оптической disector, x, y области оптической disector (оптические disector, в 2 мкм), x, y площадь квадрата сетки (x, y шаг в мкм 2), и среднее значение измеряется толщина раздела (в мкм) в полях желтого с использованием " расчет count.xlsx клеток " файл электронной таблицы ( Рисунок 6b и дополнительный файл ).
  3. Анализа каждого раздела SN от же животное, как описано в шаге 5.
  4. Вставки ячейки подсчитывает для каждого оптических disector в серые коробки, каждая строка, ссылаясь на одной секции СН, используя " расчет count.xlsx клеток " файл электронной таблицы (Дополнительный файл).
    Примечание: Номер оценкам ячейки и рассчитанные CE изображены в синие ( Рисунок 6b).

6. Оценка количества клеток с помощью коммерчески доступные системы Stereology

  1. начала оценки дофаминергической SNpc мобильный номер, нажав на " зонды " → " оптических фракционатор рабочий процесс " чтобы открыть оптический фракционатор Окно процесса.
    Примечание: Новое окно будет всплывающее окно, чтобы определить, если новая серия СН будет быть подсчитанным.
  2. Начать новую серию й + SN разделов, нажав " начать новую тему " во всплывающем окне.
  3. Пройти через различные этапы процесса оптического фракционатор. Настройте тему на первом шаге. Для этого вставьте следователь ' s имя, тема ' s имя (SN группы) и другую полезную информацию. Вставка числа секций для подсчета для этого SN. Вставьте толщина среза ткани секций. Вставка раздела интервал, который в данном случае это четыре. Вставить номер случайным образом определяется в разделе начать с.
  4. На втором шаге, задайте микроскоп с низким увеличение (2 X цель) и выберите " 2 X Mag объектива " в меню.
  5. На шаге 3, след региона интерес с левой кнопкой мыши, которая является SNpc, как описано в Baquet и др., 2009 17.
  6. Набор микроскоп высокого увеличения в шаге 4. Для этого измените цель до 100 X и выберите " 100 X Mag объектив " из ниспадающего меню.
  7. Измерить толщину монтируется на шаге 5, сосредоточив внимание на верхней и нижней части секции.
  8. На шаге 6, определить размер кадра подсчет как 50 x 50 мкм; это размер оптических disector (x, y).
  9. На шаге 7, установите размер сетки систематического случайной выборки (SRS) как 130 x 130 мкм.
  10. Войти в зону гвардии 3 мкм в шаге 8.
  11. Сохранить параметры на шаге 9.
  12. Наконец, граф й + дофаминергических клетках в каждом из оптических disectors в сетке SRS в шаге 10 оптических фракционатор рабочего процесса. Для этого, начать, нажав на " подсчет " кнопку.
  13. После окончания одной секции, щелкните на " начать следующий раздел " кнопку, чтобы начать процесс оптического фракционатор в следующем разделе SN этой же серии СН.
  14. Когда последний раздел SN одной серии СН были количественно, нажмите на " я ' ve закончено подсчета. "
  15. Нажмите на " посмотреть результаты " кнопку, чтобы отобразить результаты выборки stereology.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

С помощью метода представленных, предполагаемое количество й + дофаминергических нейронов в правом SN варьировались между 7,363 и 7987 клетки и в левый SN, между 7,446 и 7,904 клетки. Таким образом среднее количество дофаминергических нейронов (± SEM) был 7,647 ± 83 клетки для право SN и 7675 ± 66 левый SN. Вычисляемые CE для каждого животного был ниже, чем 0.08 (диапазон: 0,073-0,079) (Рисунок 7). Для выяснения сопоставимости этого метода с коммерчески досту...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stereology начинается с обработки ткани. Серийный резки SN ткани должны быть выполнены тщательно во избежание потери разделов во время стереологических анализа. Кроме того одним важным шагом является Марк одного полушария для того, чтобы отличить право от левый SN при выполнении stereology. Размещение небольшое отверстие в верхней части ствола мозга сгенерирована представленных исследовании наилучшие результаты. Кроме того начиная с работы с оптической фракционатор метод требования, которые ткани вырезать в толстые разде...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. W. I. служил в научных советах Мерц Фармацевтика, ООО и Тева; получил финансирование для путешествия из Ipsen, Мерц Фармацевтика, LLC и Allergan, Inc; и получила спикер гонораров от Мерц, TEVA и Allergan, Inc вне представленной работы. J. V. работал в качестве консультанта в Бостоне, Medtronic, научно-AbbVie и получила вознаграждение от Medtronic, Бостонский научная, AbbVie, Лалбагх, Allergan и GlobalKinetics вне представленной работы.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарны Keali Röhm, Луиза Frieß и Хайке Menzel за их экспертной технической помощи; в Helga Брюннер для ухода за животными; и Chistopher S. палату для генерации и распространения оптических disector сетка плагинов для ImageJ программного обеспечения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Атлас мышиPaxinos Мышиный мозг Джордж Паксинос Кит Б.Дж.ФранклинCopyright @2001 by Academic Press CD Rom designet & created by Paul Halasz
brain matrix slicer мышьZivic InstrumentsBSMAS 001-1
параформальдегидMerck1040051000
сахарозы /D(+) SaccharoseRoth4621.1
изопентанRoth3927.1
глицеринMerck1040931000
этанолSigma Aldrich32205-1L
Название>CompanyНомер в каталогеКомментарии
>фосфат буферизованный солевой раствор ингредиенты:
хлоридSigma Aldrich31434-1KG-R
дигидрофосфат калияMerck1048731000
динатрия гидрофосфат дигидратMerck1065801000
хлорид калияMerck1049360500
нормальная козья сывороткаDakoX0907
бычья сыворотка альбуминSigmaA4503-100G
Triton X-100Sigma AldrichX100-100млмоющее средство
3,3-Диаминобензидин-тетрагидрохлорид/DAB таблетки 10мг pH 7,0Kem En Tec4170
H2O2/ Перекись водорода 30%Merck1072090250
авидин/биотин реактивThermo Scientific32050Стандартный сверхчувствительный набор для окрашивания ABC, 1:100
кролик против мышиного тирозингидроксилазы антителаabcamAb1121:1000
биотинилированный козий антикролик IgG H+Lвекторные лабораторииBA-10001:100
StereoInvestigator версия 11.07MBF
BX53 микроскопOlympus
VisiviewVisitron Systems GmbH3.3.0.2
Axiophot2Zeiss
ImageJ программное обеспечениеNIHВерсия 4.7
Tissue-TEK OCTSakura4583
сетки сухого льда
Wayne Rasbandhttps://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html
плагин счетчика ячеекKurt de Voshttps://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html). 
оптический дисектор макросКристофер Уорд
C57Bl/6N самцы мышейЧарльз Ривер, Германия
Предметные горки с покрытием SuperFrost PlusLangenbrinck, Германия
25G игла Microlance 3BD300400
REGLO Аналоговый инфузионный насосIsmatecISM 829
StereoInvestigator системаStereoInvestigator версия 11.07
BX53 микроскопBX53 микроскоп
самоассорти стереологияVisiview
Axiophot2Axiophot2
натрия плагин наложения

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ip, C. W., et al. AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson's disease. Acta Neuropathol Commun. 5 (1), 11(2017).
  2. Ip, C. W., Beck, S. K., Volkmann, J. Lymphocytes reduce nigrostriatal deficits in the 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson's disease. J Neural Transm (Vienna). 122 (12), 1633-1643 (2015).
  3. West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Anat Rec. 231 (4), 482-497 (1991).
  4. Schmitz, C., Hof, P. R. Design-based stereology in neuroscience. Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).
  5. Tieu, K. A guide to neurotoxic animal models of Parkinson's disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 1 (1), e009316(2011).
  6. Abercrombie, M. Estimation of nuclear population from microtome sections. Anat Rec. 94, 239-247 (1946).
  7. Rose, R. D., Rohrlich, D. Counting sectioned cells via mathematical reconstruction. J Comp Neurol. 263 (3), 365-386 (1987).
  8. Weibel, E. R., Gomez, D. M. A principle for counting tissue structures on random sections. J Appl Physiol. 17, 343-348 (1962).
  9. West, M. J. Design-based stereological methods for counting neurons. Prog Brain Res. 135, 43-51 (2002).
  10. Keuker, J. I., Vollmann-Honsdorf, G. K., Fuchs, E. How to use the optical fractionator: an example based on the estimation of neurons in the hippocampal CA1 and CA3 regions of tree shrews. Brain Res Brain Res Protoc. 7 (3), 211-221 (2001).
  11. Mouton, P. R., et al. The effects of age and lipopolysaccharide (LPS)-mediated peripheral inflammation on numbers of central catecholaminergic neurons. Neurobiol Aging. 33 (2), e427-e436 (2012).
  12. Barreto, G. E., Sun, X., Xu, L., Giffard, R. G. Astrocyte proliferation following stroke in the mouse depends on distance from the infarct. PLoS One. 6 (11), e27881(2011).
  13. Robinson, S., et al. Microstructural and microglial changes after repetitive mild traumatic brain injury in mice. J Neurosci Res. 95 (4), 1025-1035 (2017).
  14. Paxinos, G., Franklin, K. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. (2001).
  15. Rasband, W. Grid_Overlay.java. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html (2010).
  16. De Vos, K. cell_counter.jar. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html (2010).
  17. Baquet, Z. C., Williams, D., Brody, J., Smeyne, R. J. A comparison of model-based (2D) and design-based (3D) stereological methods for estimating cell number in the substantia nigra pars compacta (SNpc) of the C57BL/6J mouse. Neuroscience. 161 (4), 1082-1090 (2009).
  18. Fu, Y., et al. A cytoarchitectonic and chemoarchitectonic analysis of the dopamine cell groups in the substantia nigra, ventral tegmental area, and retrorubral field in the mouse. Brain Struct Funct. 217 (2), 591-612 (2012).
  19. German, D. C., Manaye, K. F. Midbrain dopaminergic neurons (nuclei A8, A9, and A10): three-dimensional reconstruction in the rat. J Comp Neurol. 331 (3), 297-309 (1993).
  20. Smeyne, R. J., et al. Assessment of the Effects of MPTP and Paraquat on Dopaminergic Neurons and Microglia in the Substantia Nigra Pars Compacta of C57BL/6 Mice. PLoS One. 11 (10), e0164094(2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи