Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Подсчет белков в одиночных клетках с адресно капелька Microarrays

8.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56110

⸱

6 июля 2018 г.

 ,  ,  , 
1Institute of Chemical Biology, Department of Chemistry, Imperial College London

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем адресно капелька microarrays (ЗРК), капелька массива на основе метода определить абсолютное белка изобилия в одиночных клетках. Мы демонстрируем ADMs возможность характеризовать гетерогенность в выражении опухолевые супрессоры белок р53 в человеческих раковых клеток линии.

Аннотация

На уровне населения, где ответы многих клеток объединяются вместе, как средний результат, маскирование поведение богатых одну ячейку в пределах комплекса населения анализируются поведению часто клеток и клеточных реакций. Технологии обнаружения и количественного определения белка одноклеточных сделали замечательное влияние в последние годы. Здесь мы описываем практический и гибкий одноклеточного анализа платформу, основанную на microarrays адресно капелька. Это исследование описывает, как абсолютная копия количество целевых белков могут быть измерены с резолюцией одной ячейки. Наиболее часто мутировавший ген p53 усмирителя тумора в человека рак, с более чем 50% случаев всего рака экспонируется шаблон выражения не здоровый p53. Протокол описывает шаги для создания 10 nL капель, в рамках которых одного человека раковые клетки изолированы и копировать количество белка р53 измеряется с одной молекулы резолюции точно определить вариабельность в выражении. Этот метод может применяться в любой тип клеток, включая первичный материал для определения абсолютной копией количество любого целевого протеинов интереса.

Введение

Цель этого метода необходимо определить различия в изобилии целевого белка в популяции клеток с резолюцией одну ячейку. Одноячеистый анализ обеспечивает ряд преимуществ, которые не доступны с традиционными ансамбль биохимические методы. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 во-первых, работа на уровне одной ячейке может захватить богатые гетерогенность популяции клеток, которые в противном случае будут потеряны путем усреднения что происходит с традиционными ансамбль биохимических методов. Большинство биохимических методов работы лошади работают с навалом, требующие, как они часто делают, миллионы клеток для получения результата. Конечно последствия оценки всей клеточных популяций зависит от целого ряда факторов, например, неоднородности в выражении протеина, где могут быть пропущены некоторые важные функции распределения плотности залегания белка. С практической точки зрения чувствительность, требуемых от одноклеточного методов сделать их способен работать с объемами биологического материала, который является недостаточным для даже более чувствительных методов массовых функционировать. Ключевым примером этого является исследование типов редких клеток как циркулирующих клеток опухоли (CTCs), где даже для пациентов с плохой прогностические outlook менее чем 10 CTCs могут присутствовать в одном 7,5 мл крови обратить. 6 . здесь мы представляем методологии, необходимые для выполнения одноклеточного белка измерений с помощью уменьшения объема на основе антител пробирного найма на капельки нефти максимум напечатаны на антитело microarray.

Microfluidic капелька платформы являются высокая пропускная способность, способны генерировать тысячи капель в секунду и способных изолировать и даже культивирования, единичных клеток в отдельные капельки для выполнения широкого спектра биохимических анализов. Методы, основанные на капельки хорошо подходят для анализа одной ячейки,7,8,9 с примечательных недавних примеров, включая DropSeq10 и inDrop11, которые значительно способствовало власть усиление методов. Ограниченное количество материала и не методы усиления белки сделать одну ячейку протеомики особенно сложным.

Капельки могут быть проанализированы ряд методов и широко используется микроскопии флуоресцирования. Одной молекулы методы, такие как полное внутреннее отражение микроскопии флуоресцирования (TIRF) позволяет флуоресцентных молекул, чтобы быть визуализированы с непревзойденной соотношение сигнал шум. 12 вследствие экспоненциального распада затухающих поля, только флуорофоров в высокой близости к поверхности (порядок 100нм) рады сделать TIRF хорошая стратегия для обнаружения небольших количеств молекулой цели в сложной смеси. Присущие оптических секущей сила TIRF также помогает избегать шагов, мыть и ограничения анализа времени и сложности. Однако TIRF требует плоских поверхностей и примеры TIRF микроскопии, применяется к капельки в потоке включают формирование плоской поверхности которого изображение. 13 с этой целью одну ячейку proteomic методы часто дизайн microfluidic фишки вокруг поверхности прикол захвата агентов в формате microarray. 4 , 14

Капельки, сами, могут быть сформированы в массивах на плоских поверхностях, так называемые капельки microarrays. 15 , 16 , 17 пространственно организовать капельки в массивы позволяет им удобно индексируются, легко контролироваться с течением времени, индивидуально рассмотрены и, если требуется извлечь. Капелька microarrays можно добиться высокой плотности микро-реакторов с тысячами элементов на чип, которые свободно стоящих или поддержанный микрорезервуар структур. 18 , 19 , 20 , они могут быть сформированы осаждением последовательных жидкой обработке роботов, струйный корректировщиков, свяжитесь с microarrayers21,,2223,24,25, 26 , или они могут самостоятельно собрать на таких поверхностях как superhydrophillic пятна узором на superhydrophobic поверхности. 27 , 28 , 29

С учетом этих соображений адресуемых капелька Microarrays (ЗРК) были призваны объединить универсальность, пространственные возможности адресации и сокращение объемов капелька microarrays с чувствительность микроскопии TIRF одной молекулы в количественном мера белка изобилия. 5 ADMs включить анализ одной ячейки, образуя microarray капли, содержащие отдельные ячейки над microarray антитела, которые затем покрытые маслом для предотвращения испарения. Объем капли дискретные для предотвращения потери образца, которая в противном случае может быть достигнуто путем на чипе запорной арматуры в непрерывный поток микрофлюидика. 30 абсолютное количество целевого белка из одной клетки крайне мала; Однако сокращение объема капель позволяет относительно высокой концентрацией местных с тем, чтобы они обнаруживаются с помощью анализа антител сэндвич - антитела иммобилизованных в собственный регион, или пятно, на поверхности, которая захватывает белка, который в свою очередь связывается для дневно помечены обнаружения антител в объем капли. Как лейбл свободный подход (то есть белок, цели не обязательно должны наноситься непосредственно), ЗРК обычно применяется для анализа клеток из первичных источников, таких, как обработанные крови, отлично нужно пунктаты и биопсий диссоциированных опухоли, а также клетки от культуры и их лизатов.

Измерение различий в изобилии белка по всей популяции клеток имеет важное значение при определении гетерогенность в ответ, например, наркотиков и поможет в предоставлении проницательность в клеточных функций и тропинки, оценки субпопуляций и их поведение, а также выявления редких событий, которые бы в противном случае быть замаскированы методы массового. Этот протокол описывает, как производить и использовать адресный капелька microarrays количественно определить обилие p53 фактор транскрипции в человеческих раковых клеток и могут быть использованы для изучения роли p53 в ответ химиотерапевтических препаратов. Целевого белка определяется выбором захвата и обнаружения антител и может быть изменен для включения более или различные цели. Инструкции для создания простой аппарат, включающий концентрических сопло из общего Лаборатории расходные материалы для вручную массив 10 капель nL, покрытые маслом. Полный экспериментальный процесс описан в соответствии с которым каждая капелька затем загружается с одну ячейку, которая затем лизированы и выражения протеина, определяется с одной молекулы резолюции, с помощью микроскопии TIRF.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка

  1. Фишки и microarrays антитела печати
    1. Придаем самоклеющиеся силиконовые/акриловый изолятор coverslip функционализированных поддержать антитело microarray. Это называется чип.
      Примечание: Различные поверхности химия были протестированы на предмет их пригодности с адресно капельки. 5 поверхности химия может должны быть оптимизированы для альтернативных захвата агентов. ADM изоляторы коммерчески доступны или могут быть произведены Лазерная резка акрила (CAD файла для изоляторов, используемые в этой работе предоставляется для скачивания; Дополнительный файл кода).
    2. Перейдите на microarrayer и установить влажность 75%.
      Примечание: относительная влажность уменьшает испарение решение печати от microarray pin и уменьшает внутри и между spot различия.
    3. Очистите microarray контактный штырь, моющий раствор на 5 мин, ultrasonication. Промойте ПИН с ультра-чистой водой с использованием вымойте бутылку и высушите азота.
      Примечание: Приостановите pin как только погрузиться кончик PIN-код. Микроскопа с надлежащим образом просверленные набором отверстий поможет, если владелец PIN-код не может быть получен.
    4. Сделайте 5 мл буфера печати, состоящий из 3 × солевой раствор натрия цитрата (SSC) буфера, Бетаин 1,5 М, с 0,01% лаурилсульфат натрия (SDS). Хранить при 4 ° C на неопределенный срок.
    5. Чтобы подготовить решение печати, оттепель антитела анти p53 (p53/Mdm2 ELISA комплекта; см. таблицу материалы) аликвоты, хранятся при температуре-80 ° C. Смешайте 1:1 с буфера печати до конечной концентрации 0.5 мг/мл. Загрузка 5-10 мкл раствора печати в 384 хорошо пластину, используя микропипеткой и место в microarrayer.
    6. Загрузить фишки, смонтирован на шаге 1.1.1 в microarrayer. Программа microarrayer для печати пятна в точке с координатами определяется в центре каждой скважины изолятора.
      Примечание: Microarrayers используют широкий спектр, преимущественно, проприетарное программное обеспечение и поэтому читателю рекомендуется обратиться к соответствующей литературе. Необходимые для ADM изолятор, Рекомендуемые в сопутствующем файле CAD на шаге 1.1.1 microarray состоит из прямоугольных элементов; предусмотрены соответствующие расстояния.
    7. Хранить фишки в герметичных контейнерах и оберните фольгой. Хранить при 4 ° C до 6 недель.
      Примечание: Фольга-чтобы не повредить фото. Хранение при температуре 4 ° C ограничивает скорость деградации биомолекул и любых пагубных реакций, которые могут действовать, чтобы уменьшить активность microarray. Герметичном контейнере позволяет фишек, чтобы сбалансировать к комнатной температуре перед использованием без конденсации, образуя на поверхности чипа. Печать контакт microarray эксплуатирует поверхностное натяжение и адгезии между решением печати и печати подложки для производства пятна. Перед печатью или промокательной обычно требуется, чтобы удалить излишки раствора из microarray pin приносить равномерно размера пятна. Не выбрасывайте жертвенных допечатной coverslip, поскольку она может быть использована для оценки качества партии.
  2. Подготовьте шприцы, трубопроводы и концентрические сопло для дозирования адресно капельки
    1. Разберите 100 мкл (для водной капли) и 1 мл (для укупорки масла) стекла шприцы Гамильтон и промойте детали с дистиллированной H2O.
    2. Канал 100 мм длиной 150 мкм ID/360 мкм ОД сплавили кремния трубопровод через 40 мм длина 1,0 мм ID/1/16 "OD PFA труб до тех пор, пока она выступала на 2 мм. Это будет формируют концентрические сопла.
    3. Нанесите тонкий слой Цианакрилатный клей в конце кончика пипетки 10 мкл и вставьте в 40 мм кусок 1,0 мм ID/1/16 "OD PFA труб. Если требуется, переместите кварцевое труб для поддержания 2 мм выступ на насадку перед клей наборы.
    4. Вставьте другой конец кварцевое капилляров в конце длиной 200 мм 0.014" ID/0,062" OD трубопровод PTFE и подключить это к 100 мкл, Гамильтон шприц заполнены с 4% бычьим сывороточным белком (BSA) в фосфат амортизированное saline (PBS) (PBSA).
      Примечание: Белков и других биохимических видов могут неспецифически привязку к поверхности и могут быть потеряны или денатурированный. BSA используется для «блок» поверхностей к минимуму неспецифической привязки жертвенно привязки для этих поверхностей.
    5. 400 мм длина 1,0 мм ID/2.0 мм OD FEP труб можно Вставьте наконечник пипетки 200 мкл до тех пор, пока она образует уплотнение. Нанесите тонкий слой Цианакрилатный клей к другой 200 мкл наконечник пипетки и вставьте это в первый отзыв, чтобы исправить трубы в месте. Подключите открытый конец трубы OD FEP 1,0 мм ID/2.0 мм к 1 мл шприц Гамильтон заполнены с минеральным маслом.
    6. Вставьте 200 мкл пипеткой Совет Ассамблеи в кончик пипетки 10 мкл концентрические сопла. Место шприцы в отдельном шприц насосов, как им нужно будет эксплуатироваться независимо.
    7. Заполните шприц 100 мкл с 4% PBSA блокирования решения. Прикрепить и флеш «водный» трубки блокировки раствором. Повторите дважды для в общей сложности 3 флеши.
    8. Заполните шприц 100 мкл с 0,125 мкг мл-1 обнаружение антител (анти p53 антитела (ДУ-1) помечены с Alexa 488) 4% PBSA и заново подключите труб. Заменить блокирования решения в трубку подачи 25 мкл обнаружения раствор антител.
    9. Промойте трубы «нефть» с минеральным маслом, до тех пор, пока все трубы и насадки заполняет с маслом. Пополнить 1 мл шприц с минеральным маслом и заново подключите труб. Трубки и насадки в сборе крепится к XYZ манипулятора.
  3. Подготовка microinjector и микроманипулятор
    Примечание: Следующие шаги сделать конкретную ссылку на компоненты microinjector и микроманипулятор аппарата, указанные в таблице материалов, но в целом применимы к любой такой аппарат.
    1. Соберите microinjector, крепления труб давление и капиллярной держателя.
    2. Медленно поверните ручку поршень пока минеральное масло полностью заполняет линии.
    3. Смонтируйте держателя капилляров в головы горе перевода.
    4. Исправьте капилляра в держателе капилляра с главой сцепление.
    5. Пипетка раствор 4% PBSA в одной из скважин изолятора.
    6. Перевести с помощью микроманипулятор и погрузите кончик капилляра в решение.
    7. Медленно заполните капилляра с 4% PBSA и оставить для блокирования на 10 мин.
    8. Извлеките микрокапиллярной и поворотный модуль перевода, так что Ассамблея ясно чипа.

2. форма адресации капельки и нагрузки с одной клетки

  1. Адресно капельки виде
    1. Закрепите чип на микроскопа.
      Примечание: Микроскоп является Перевернутый флуоресценции, оснащен автоматизированной Микроскоп способен одной молекулы TIRF закодированные Ху этап и умножения зарядовой камеры (ЭМ-CCD) электрона.
    2. Запишите координаты Этап микроскопа каждого места в массиве с помощью программного обеспечения управления автоматизированных микроскопа.
    3. Установка манипулятора XYZ на микроскопа. Поместите насадку под углом 50-60°. Убедитесь, что сопло имеет достаточную длину и распродажа достичь чипа. Установить «водный» и «нефть» шприцевые насосы обойтись 10 nL в 100 мкл/мин и 5 мкл, 100 мкл/мин, соответственно.
      Примечание: Во время подготовки может сухой водный раствор на голову сопла.
    4. Отказаться от водный раствор, пока шарик жидкости виден на голову сопла. Промокните салфеткой пыль бесплатно для его удаления.
      Примечание: В зависимости от условий в рамках расследования, зарезервировать ряд скважин в качестве резервуаров для клеток. Для одной ячейки строки/типа будет достаточно одного водохранилища.
    5. С помощью программного обеспечения управления автоматизированных микроскопа, задайте координаты Этап микроскопа антитела место в массив и сосредоточиться на поверхности coverslip.
    6. Осторожны, чтобы не нарушить месте, с помощью манипулятора XYZ, совместите кончик стекла капиллярного концентрические сопла в сторону антител пятна и обойтись 10 nL водный раствор. Без перехода на этапах, лунки 5 мкл нефти колпачок водный раствор. Медленно поднять насадку подальше от капли и перейти к следующему хорошо.
    7. Повторите шаг 2.1.6 для всех пятна антитела в массиве.
    8. После 30 минут изображение все места в массиве с помощью программного обеспечения управления автоматизированных микроскопом для определения фона одной молекулы, обязан каждое антитело пятно перед загрузкой клетки.
  2. Загрузить адресуемый капельки с ячейками
    1. Удаление колбы культуры клеток из инкубатора и отсоединение клетки, используя раствор трипсина/ЭДТА.
      Примечание: В этом исследовании, линия клетки карциномы BE человека Толстой был использован и культивировали, используя Дульбекко изменение орлы среднего (DMEM) с 10% (v/v) плода бычьим сывороточным (ФБС) в инкубатор CO2 .
    2. При необходимости, дневно запятнать клетки.
      1. Ресуспензируйте клетки в растворе 0,125 мкг/мл обнаружения антител (анти p53 антитела (ДУ-1) помечены с Alexa 488) в 10% FBS в L-15 массовой информации. Чтобы обеспечить одну ячейку подвеска, фильтр ячейки решения через стрейнер ячейку поле 40 мкм.
    3. Подсчитать ячейки с помощью Горяева и разбавлять или концентрации клеток решение к концентрации 25-400 × 103 клеток/мл. Это гарантирует, что клетки отложений с достаточным промежутком комфортно управлять микрокапиллярной.
    4. Загрузите отдельные ячейки в адресный капельки от водохранилища ячейки, используя микроманипулятор и микрокапиллярной.
      Примечание: Non Сторонник клетки могут быть загружены навалом в микропипеткой и обойтись один за другим в адресуемой капельки. Несмотря на блокирование обработки поверхности адэрентных клеток линии будут склонны неспецифически придерживаться стекла микрокапиллярной внутренней стены и быть потеряны.
    5. Используя объектив 10 × наблюдать, используйте microinjector для аспирационная одну ячейку в микрокапиллярной из клеток водохранилища.
    6. Хранить координаты стадии микроманипулятор, если с помощью электронных манипулятор стадии или вручную отметить положение по оси z.
    7. Убрать микропипеткой, переведя его вверх, чтобы снять 1 мм высота чипа. Выполните это вручную с помощью джойстика или автоматически с помощью функции «Извлечь» электронных манипулятор этапа.
    8. Набор, который стадии координирует на что из адресных капелька с помощью автоматизированных Микроскоп программное обеспечение управления. «Вставить» микропипеткой, возвращая его позиции z хранимой (или отметил). Выполнять это вручную с помощью джойстика или автоматически при использовании электронных манипулятор стадии.
      Примечание: Микрокапиллярной проколоть укупорки масла и находиться в водной части адресно капли.
    9. Обойтись в ячейку в адресуемой капелька, используя microinjector. Объем адресуемой капельку 10 nL возрастет менее чем на 1%.
    10. Повторите 2.2.5-2.2.9 для оставшихся адресно капельки, оставляя некоторые свободные для экспериментальной управления где адресно капельки не содержат ячейки.
      Примечание: Более простой альтернативой загрузки одной клетки в адресный капельки, с помощью микрокапиллярной и микроманипулятор состоит в замене решения шаге 1.2.8 решения обнаружения антител в 4% PBSA содержащих клеток в концентрации порядка 10 5 клеток/мл, что эквивалентно 1 клеток/10 nL. Размещение одной ячейки будет реализуется и концентрации клеток будет необходимо оптимизировать.
  3. Лизировать клетки и массива изображения
    1. Изображение клетки в капельки, с помощью brightfield микроскопии, включая любые изображения флуоресценции.
      Примечание: Изображения занимает примерно 3 мин для изображения ~ 100 капель с помощью автоматизированных микроскопа. Выполнение визуализации с 60 NA = 1,49 нефти погружение цели. Фильтры не требуются для brightfield изображений, тогда как для флуоресценции изображений используются наборы стандартных фильтров.
    2. Изображение все места в массиве с помощью одной молекулы TIRF микроскопии.
      Примечание: Параметры используются как в шаге 2.3.1 с специализированными TIRF фильтрации набора. Эти изображения будут впоследствии проанализированы в разделе 3 для определения фона одной молекулы, обязан каждое пятно антитела до lysis. Одной молекулы изображений, с помощью микроскопии флуоресцирования (TIRF) полное внутреннее отражение занимает около 5 минут для изображения ~ 100 мест.
    3. Фокус на ячейку в адресуемой капли. Достичь полной оптических лизиса, сосредоточив внимание на один 6 ns лазерного импульса (длина волны 1064 нм, импульсов энергии 14.1 ± 0,3 µJ в импульсе) недалеко от расположение ячейки.
      Примечание: Лазерного импульса устанавливает расширение пузырь кавитации, ножницы ячейку и освобождает клеточных компонентов в объем капли. 4 , 31 механических процессов за счет лазерно индуцированным лизис не беспокоить нефть вода интерфейс в низкой импульсов энергии. Оптических лизис обычно занимает около 20-30 мин до лизируют 100 клеток. Как обсуждалось в разделе обсуждения, существует ряд альтернативных методов для лизируют отдельные клетки, если оптические лизис установки невозможно.
    4. Повторите для всех клеток содержащих адресно капельки, оставив 5 бесплатно для экспериментальной управления где адресно капель содержат ООН лизированных ячейки.
    5. Обратите внимание на время, в котором каждой клетки лизированы.
      Примечание: Эти времена будет использоваться для исправления кривых отдельные привязки для каждого пятна на шаге 3.1.9. Часто бывает достаточно отметить времена, когда первой и последней ячеек анализироваться и оценить себя адекватно согласуется время между событиями лизис остальные.
    6. Приобретение одной молекулы изображения, с помощью микроскопии TIRF всех пятен каждые 10 мин для первые 30 мин затем каждые 20 мин еще 60 мин. Если только заинтересованные размере белка связаны в равновесии, изображение все пятна после инкубации чип для 90 минут при комнатной температуре.
      Примечание: Время, чтобы достичь равновесия будет зависеть объем капли и сродства антитела, которые используются в assay. TIRF микроскопии осуществляется с помощью лазерного источника возбуждения = 488 нм и 1,5 МВт мощности измеренные на спине диафрагмы, используя Измеритель оптической мощности. Одной молекулы изображения приобретаются, установив параметры приобретения на EM-CCD камеры на время приобретения 900 МС, оцифровка 16-разрядной скоростью считывания 1 МГц и EM получить коэффициент 10. Изолятор может использоваться повторно, тщательно удалив coverslip.

3. анализ данных

  1. Одной молекулы подсчета (не перегружена/цифровой режим)
    1. С помощью Фиджи (или Matlab), для любого не перегружена антител пятна Загрузите изображения, приобретенные до лизис (фон, БКД).
      Примечание: В следующих шагах прямолинейно операции с помощью программного обеспечения для анализа изображений Фиджи. Руководство пользователя можно найти по следующей ссылке https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html.
    2. В Фиджи выберите изображение БКД. В разделе меню «Изображение» выберите «Дублировать» для повторяющихся БКД. Выберите дубликат изображения и в разделе «Процесс > фильтры», выберите «Гауссово размывание» и укажите радиусом 50 пикселей.
    3. Сгладить изображение BKD так что есть распределение эффективной единой интенсивность источника света возбуждения, разделив на BKD изображение размытое изображение BKD, производство BKD_FLAT.
      1. Под «Процесса» выберите «изображение калькулятор...», указав операции «Пропасть», изображения требуется и флажки «Создать новое окно» и «32-разрядный (float) результат.»
    4. Вычесть каждый пиксел в изображении на 1 («процесс > математика», выберите «Вычесть...» и укажите значение 1). Интенсивность средняя пикселей должно быть 0.
      Примечание: Поле уплощение и уплощенная фоновых изображений может легко проверить, поскольку сумма всех пикселей должно быть 0 и любые оставшиеся смещение может компенсироваться более прямолинейно для.
    5. Выберите область пикселов × 50 50 пикселей в любой из 4 углов изображения BKD_FLAT. Измерьте интенсивность пикселя стандартное отклонение (σ), выбрав «Анализировать» и «Измерения».
      Примечание: Сводные статистические данные выделения будет представлен в окне результатов. Это определяет фон место где есть вряд ли может быть высокой плотности одного молекул. Области, чтобы быть измерены могут быть выбраны вручную, с помощью инструментов выделения меню по умолчанию или путем запуска макроса код «makeRectangle (x, y, ширина, высота)»; Это создает прямоугольное выделение, где x и y аргументы являются координатами верхнего левого угла (в пикселях).
    6. Установите порог изображения 3σ и создайте двоичный образ SM_MASK.
      1. Под «Изображение > Настройка» выберите «порог» и установите нижнего порогового уровня 3σ.
        Примечание: Пикселы, значение которых находятся ниже порога равным нулю и пикселей, превышающих пороговые значения устанавливаются в 1. Порог будет определять доверие, с которым показатели пикселей принадлежат к одной молекулы.
    7. В изображении сегментированный SM_MASK, значения интенсивности набор пикселей к нулю любые объекты, которые не имеют размер 4-9 пикселей2 и округлости 0,5 - 1, выбрав «Анализировать» следуют «Анализ частиц» и указав размер и округлость.
      Примечание: Размер пикселя может потребоваться быть оптимизированы для других флуорофоров и Микроскоп набора ИБП. Из-за типа шума камеры одного пикселей может быть выше этого порога и не должен отбрасываться несмотря на не одной молекулы. Критерий размер пикселя будет правильно отменить такие пикселов. Одной молекулы, как правило круглую форму. Цикличность значение 1 указывает идеальный круг, а приближается к 0 значение все более продолговатой формы. Оставшиеся объекты являются одной молекулы и может быть отнесен. Маски могут быть установлены для демаркации области место дискриминацию на месте и - пятно рассчитывает на кадр. Это проще для кадров, полученные в более поздние времена когда есть достаточно сигнал на месте, которые затем могут быть применены к ранее кадры.
    8. На том же месте не перегружена антитела нагрузки и повторите шаги 3.1.1 - 3.1.7 для всех кадров изображения захвачен как раз решить серии приобрела пост lysis. Используйте лизис раз отмечается в шаге 2.3.5. чтобы исправить любые привязки кривых.
  2. Одной молекулы подсчета (перегруженных/аналоговый режим)
    1. Для расчета средней интенсивности одной молекулы, прежде чем продолжить, повторите шаги 3.1.1 - 3.1.8.
    2. Умножьте изображений BKD_FLAT и SM_MASK производить изображение, whereby значения пикселов нуля связаны с одной молекулы.
      1. Для выполнения этого, под меню «Процесс», выберите «Изображение калькулятор...», укажите операцию «Умножение» и необходимые изображения и выберите коробки «Создать новое окно» и «32-разрядный (float) результат.»
    3. Сумма всех значений интенсивности пикселей, выбрав «Анализировать» и затем «Мера»; Сводная статистика отбора будет представлен в окне результатов. Разделите на количество подсчитанных одной молекулы согласно шаг 3.1.8 для вычисления средней интенсивности в одну молекулу.
    4. Для любых загруженных антитела пятно загрузить изображение приобрел после лизиса и придавить с размытым фоном изображения согласно шаги 3.1.2 и 3.1.3.
    5. Вычесть каждый пиксель в сведенное изображение 1 («процесс > математика», выберите «Вычесть...» и укажите значение 1)
    6. Выберите область пикселов × 50 50 пикселей в любой из 4 углов изображения и измерить интенсивности пикселей стандартное отклонение (σ). Смотрите Шаг 3.1.5 для деталей.
    7. Создайте двоичный образ маски, установив порог изображения 3σ и установите значения интенсивности пикселей равным нулю любых объектов с размером менее 4 пикселя2. Чтобы выполнить это, под меню «Анализ», выберите «Анализировать частиц» и укажите размер и округлость.
    8. Умножьте "СПОТ имаж" плоский перегруженных антитела двоичное изображение-маску.
      1. Для выполнения этого, под меню «Процесс», выберите «Изображение калькулятор...», укажите операцию «Умножение» и необходимые изображения и выберите коробки «Создать новое окно» и «32-разрядный (float) результат.»
    9. Сумма оставшихся интенсивности пикселей, выбрав «Анализировать» следуют «Мера»; Сводная статистика отбора будет представлен в окне результатов.
    10. Разделите сумму пиксель света, интенсивность средняя одной молекулы для вычисления числа молекул одного обязан перегруженных пятно.
  3. Калибровочная кривая для количественного определения абсолютной
    1. Повторите разделы 1 и 2 к форме 10 nL адресно капельки с обнаружения антител в 4% раствор PBSA с известной концентрации рекомбинантных белков шипами.
    2. Выполнить серию концентрации 102- 107 рекомбинантных белков в капли, меняя известной концентрации рекомбинантных белков, добавлены в решение. Рекомендуется для работы с точки зрения количества белков на капли, чтобы сделать простой калибровки одну ячейку данных.
    3. Используйте серии концентрацию данных на шаге 3.3.2 для калибровки любой одной молекулы рассчитывает на месте к изобилию белка на капли и расширение белка изобилия в одну ячейку.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Номер копии абсолютной базальной белка p53 был определен с резолюцией одну ячейку в человека толстой кишки рак клеток линии, BE клетки. Мы демонстрируем, как выражение p53 может различаться на несколько порядков и показать слабо положительная корреляция между размер и белка копии номер ячейки в пределах покоя популяции клеток BE.

Адресный капелька Microarrays образуются, когда водные капельки обойтись в месте расположения антите...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Адресный капелька Microarrays являются чувствительными и расширяемый метод количественного определения абсолютной копией количество белка в одной ячейке.

Ограничение уровня неспецифической привязки (NSB) имеет решающее значение в рамках протокола для достижения как низкий предел обнаружения как можно скорее. Белков и других биохимических видов могут неспецифически связывать количество интерфейсов в капли — поверхности coverslip, пятно антитела и масло/вода интерфейс. Белки могут быть потеряны ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

ASR разработан эксперименты, разработали протоколы и анализировали данные. СК и СП выполненных экспериментов размер ячейки. ASR и OC написал рукопись. Авторы хотели бы с благодарностью отметить поддержку профессор Дэвид р. Klug за предоставление доступа к оборудованию. Авторы хотели бы поблагодарить Императорского расширенный Hackspace колледж для доступа к изготовлению и прототипов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>Клеточная культура
фосфатно-солевой буфер (PBS)Life Technologies10010015
DMEM с высоким содержанием глюкозыSigmaD6429
Фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS)КолбыBiochrom S0115
CorningSIAL0639
трипсин/ЭДТАBiochromL2153
НазваниеCompany>Номер в каталогеКомментарии
>Microarray
ArrayerDigiLab, UKOmniGrid Micro
Microcontact pinArrayIt, США946MP2
Покровные стекла (Nexterion)Schott, Европа1098523Размер (мм): 65,0 x 25,0; Толщина (мм) 0,17
p53 захват антителаEnzoADI-960-070
p53 обнаружение антитела, Alexa Fluor 488 меченыйSanta Cruzsc-126стоковая концентрация 200&мкм; г/мл
Соляно-натриевый цитратный буферGibco15557-044
БетаинSigma61962
Додецилсульфат натрияSigmaL3771
384 луночная пластина (малый объем)SigmaCLS4511
Баллон с газообразным азотомBOCПромышленный сорт, бескислородный
<сильный>НазваниеCompanyНомер в каталоге<strong>Комментарии
Капли
МикроманипуляторEppendorfPatchman NP2
Ручной микроинъекторEppendorfCellTram Vario
MicropipetteOrigio, ДанияMBB-FP-L-0
Шприцевые насосыKD ScientificKDS-210
100 μ L шприцHamilton81020Газонепроницаемый, PTFE Luer lock
1 мл шприцHamilton81327Газонепроницаемый, PTFE Luer lock
Силиконовый изоляторGrace Bio-LabsJTR24R-A-0.56x4 луночный силиконовый изолятор с клеем
Лазерный резакVersaLASEVLS2.30 CO2 Laser 3Wдля лазерной резки нестандартных изоляторов
толщиной 1мм акриловый листWeatherall-UKClarex Precision Sheet 001для лазерной резки изоляторов на заказ
Клейкий лист3Mиспользуется для приклеивания изоляторов на микромассивные покровные стекла
СуперклейLoctiteLOCPFG3T
150 μ m ID/360 μ m наружный диаметр трубки из плавленого кремнеземаIDEXFS-115
1,0 мм ID/1/16" Наружный диаметр трубки PFAIDEX1503
0.014" Идентификационный номер/0.062" Наружный диаметр трубки из ПТФЭKinesis008T16-100
1,0 мм ID/2,0 мм Наружный диаметр трубки FEPIDEX1673
Бычья сыворотка Альбумин (BSA)Научное
минеральное маслоFisherSigma M5904
Ультрачистая водаMillipore, ГерманияMilliQ
Name CompanyНомер в каталогеКомментарии
>Микроскопия и Оптика
TIRF микроскоп с кодированным XY-столикомNikon, ЯпонияNikon Ti-E
EM-CCDAndor Technologies,Ирландия IXON DU-897E
Источник лазерного возбужденияVortran, СШАStradus 488-50
Оптический лизис лазерного источникаContinuum, СШАSurelite SLI-10
Микроскоп фильтрующий куб для TIRFChroma, СШАz488bp
Микроскоп фильтрующий куб для лазера оптического лизиса2000, ВеликобританияLPD01-532R-25
Name<strong>Company>Номер в каталоге>Comments
Software
обеспечение для анализа изображенийоткрытым исходным кодомФиджи
MatlabMathworksверсии 7.14 или вышеПрограммное обеспечение для анализа изображений
для клеточных культур Microcontact BP9700100 Программное с на

Ссылки

  1. Willison, K. R., Klug, D. R. Quantitative single cell and single molecule proteomics for clinical studies. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (4), 745-751 (2013).
  2. Heath, J. R., Ribas, A., Mischel, P. S. Single-cell analysis tools for drug discovery and development. Nat. Rev. Drug Discov. 15 (3), 204-216 (2016).
  3. Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells. Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 (2013).
  4. Salehi-Reyhani, A., et al. A first step towards practical single cell proteomics: a microfluidic antibody capture chip with TIRF detection. Lab. Chip. 11 (7), 1256-1261 (2011).
  5. Salehi-Reyhani, A., Burgin, E., Ces, O., Willison, K. R., Klug, D. R. Addressable droplet microarrays for single cell protein analysis. Analyst. 139 (21), 5367-5374 (2014).
  6. Cristofanilli, M., Budd, G., Terstappen, L. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 351 (8), 781-792 (2004).
  7. Lan, F., Haliburton, J. R., Yuan, A., Abate, A. R. Droplet barcoding for massively parallel single-molecule deep sequencing. Nat. Commun. 7, 1-10 (2016).
  8. Ramji, R., et al. Single cell kinase signaling assay using pinched flow coupled droplet microfluidics. Biomicrofluidics. 8 (3), 34104(2014).
  9. He, M., Edgar, J. S., Jeffries, G. D. M., Lorenz, R. M., Shelby, J. P., Chiu, D. T. Selective encapsulation of single cells and subcellular organelles into picoliter- and femtoliter-volume droplets. Anal. Chem. 77 (6), 1539-1544 (2005).
  10. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  11. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  12. Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). Cold Spring Harb. Protoc. 5 (3), (2010).
  13. Chen, D., Du, W., Ismagilov, R. F. Using TIRF microscopy to quantify and confirm efficient mass transfer at the substrate surface of the chemistrode. New J. Phys. 11 (31), 75017(2009).
  14. Shi, Q., et al. Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (2), 419-424 (2012).
  15. Sun, Y., et al. A novel picoliter droplet array for parallel real-time polymerase chain reaction based on double-inkjet printing. Lab Chip. 14 (18), 3603(2014).
  16. Jogia, G., Tronser, T., Popova, A., Levkin, P. Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis. Microarrays. 5 (4), 28(2016).
  17. Yen, T. M., et al. Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification. ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).
  18. Labanieh, L., Nguyen, T. N., Zhao, W., Kang, D. K. Floating droplet array: An ultrahigh-throughput device for droplet trapping, real-time analysis and recovery. Micromachines. 6 (10), 1469-1482 (2015).
  19. Lee, Y. Y., Narayanan, K., Gao, S. J., Ying, J. Y. Elucidating drug resistance properties in scarce cancer stem cells using droplet microarray. Nano Today. 7 (1), 29-34 (2012).
  20. Popova, A. A., Demir, K., Hartanto, T. G., Schmitt, E., Levkin, P. A. Droplet-microarray on superhydrophobic-superhydrophilic patterns for high-throughput live cell screenings. RSC Adv. 6 (44), 38263-38276 (2016).
  21. Chen, F., et al. Inkjet nanoinjection for high-thoughput chemiluminescence immunoassay on multicapillary glass plate. Anal. Chem. 85 (15), 7413-7418 (2013).
  22. Zhu, Y., Zhu, L. -N., Guo, R., Cui, H. -J., Ye, S., Fang, Q. Nanoliter-scale protein crystallization and screening with a microfluidic droplet robot. Sci. Rep. 4, 5046(2014).
  23. Sun, Y., Chen, X., Zhou, X., Zhu, J., Yu, Y. Droplet-in-oil array for picoliter-scale analysis based on sequential inkjet printing. Lab Chip. 15 (11), 2429-2436 (2015).
  24. Liberski, A. R., Delaney, J. T., Schubert, U. S. "One cell-one well": A new approach to inkjet printing single cell microarrays. ACS Comb. Sci. 13 (2), 190-195 (2011).
  25. Yusof, A., et al. Inkjet-like printing of single-cells. Lab a Chip - Miniaturisation Chem. Biol. 11 (14), 2447-2454 (2011).
  26. Zhu, Y., Zhang, Y. -X., Liu, W. -W., Ma, Y., Fang, Q., Yao, B. Printing 2-dimentional droplet array for single-cell reverse transcription quantitative PCR assay with a microfluidic robot. Sci. Rep. 5, 9551(2015).
  27. Ueda, E., Geyer, F. L., Nedashkivska, V., Levkin, P. A. Droplet Microarray: facile formation of arrays of microdroplets and hydrogel micropads for cell screening applications. Lab Chip. 12 (24), 5218-5224 (2012).
  28. Kozak, K. R., et al. Micro-volume wall-less immunoassays using patterned planar plates. Lab Chip. 13 (7), 1342-1350 (2013).
  29. Yen, T. M., et al. Self-Assembled Pico-Liter Droplet Microarray for Ultrasensitive Nucleic Acid Quantification. ACS Nano. 9 (11), 10655-10663 (2015).
  30. Au, A. K., Lai, H., Utela, B. R., Folch, A. Microvalves and Micropumps for BioMEMS. Micromachines. 2 (4), 179-220 (2011).
  31. Lai, H. -H., et al. Characterization and use of laser-based lysis for cell analysis on-chip. J. R. Soc. Interface. 5, Suppl 2. S113-S121 (2008).
  32. Salehi-Reyhani, A., et al. Scaling advantages and constraints in miniaturized capture assays for single cell protein analysis. Lab Chip. 13 (11), 2066-2074 (2013).
  33. Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. J. R. Soc. Interface. 5, Suppl 2. S131-S138 (2008).
  34. Womack, M. D., Kendall, D. A., MacDonald, R. C. Detergent effects on enzyme activity and solubilization of lipid bilayer membranes. BBA - Biomembr. 733 (2), 210-215 (1983).
  35. Ramji, R., Xiang, A. C., Ying, N. J., Teck, L. C., Hung, C. C. Microfluidic Single Mammalian Cell Lysis in Picolitre Droplets. J. Biosens. Bioelectron. S12 (1), 10-13 (2013).
  36. Burgin, E., et al. Absolute quantification of protein copy number using a single-molecule-sensitive microarray. Analyst. 139 (13), 3235(2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

p53TIRF
Подсчет белков в одиночных клетках с адресно капелька Microarrays
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.