Корреляционные суперразрешением и электронной микроскопии решить локализация белка в Zebrafish сетчатки

Методы определения субцеллюлярные Локализация белков и их связь с различных отсеков ячейки являются важнейшими инструментами для понимания их функции и возможности взаимодействия. Супер-резолюции микроскопии в сочетании с электронной микроскопии предоставляет такие сведения¹. Микроскопия истощение земли государства следуют отдельные молекулы возвращение (GSDIM) представляет собой технологию микроскопии суперразрешением, совместим с широким спектром органических и генетически закодированный флуорофоров² и достигает латеральное разрешение до 20 Нм ³. Включение методов с высоким разрешением, чем стандартные дифракционный микроскопии улучшает точность корреляции^4,5,6. Рекомендуется для достижения наилучшего соотношения белков с конкретным субцеллюлярные отсека и уменьшить объем неопределенности⁷ использование того же раздела ультратонких для света и электронной микроскопии. Среди различных методов, резания Tokuyasu крио раздел протокол не требует обезвоживания или встраивание смолы и, Кроме того, сохраняет антигенностью многих эпитопов и обеспечивает хорошие ткани Ультраструктура⁸. Несколько методов продемонстрировали применимость этих разделов в коррелятивном света и электронной микроскопии (Клем)^4,5,9,10.

Данио рерио сетчатки является полезной моделью для изучения визуальной разработки и механизмов болезней человека, учитывая его высоко сохраняется структура и функции различных позвоночных. В частности, сетчатки фоторецепторов отображения той же архитектуры как млекопитающих фоторецепторов, с базальной синапса, apico-basally удлиненные ядра, кластеризация митохондрий в сегменте более апикальной внутренний и наружный сегмент состоит из мембраны диски в наиболее апикальной позиция¹¹. Локализация белков различных сотовых отделений, сохраняемой между данио рерио и человека, позволяя исследование биологической функции человека болезни соответствующих белков^12,13.

Здесь мы представляем протокол подготовить личиночной данио рерио сетчатки образцы для устранения Локализация белков митохондриальных внешней мембраны Tom20 коррелятивных суперразрешением света и электронной микроскопии. Метод основан на сборе крио разделы на кремниевых пластин и получение контраст по топографической информации производится после нанесения тонкого слоя платины. Эти шаги являются четкие технические усовершенствования с точки зрения удобства использования, воспроизводимость и время выполнения экспериментов. Недавно мы продемонстрировали применимость метода для обнаружения ядерной поры и митохондриальных протеинов в мыши ткани¹⁴.

все эксперименты были проведены в соответствии с заявлением Арво для использования животных в глазной и видение исследования и были утверждены местными властями.

1. Подготовка ультратонких разделы на кремниевых пластин

1. 1. подготовить фиксирующие раствор, содержащий 0.1% глютаральдегид, 4% формальдегида в буфер cacodylate 0,1 М.
      Примечание: осторожно! Соблюдайте осторожность при работе с буфером глютаральдегид, формальдегид и cacodylate, носить надлежащие средства личной защиты и работают в зонта.
   2. Усыпить 5 дней после оплодотворения личинки данио рерио (5 dpf) с tricaine (этиловый метансульфонат 3-аминобензоат, 0,4% w/v в PBS (фосфат буфер солевой, рН 7)) как описано ¹⁵.
   3. Исправить личинки, погружение в предварительно охлажденные фиксирующие решения на льду. Удалите головы и инкубировать на ночь при 4 ° C с плавное покачивание.
   4. Вскрыть глаз путем обрезки ткани вокруг глаз с помощью тонкой щипцы и microdissection скальпель (под бинокль) охлажденные фиксирующие решения на пластине местная агарозы 1%. Передать трубку с свежими предварительно охлажденные фиксатором глаза.
   5. Мыть дважды в PBS (фосфат буфер солевой, рН 7,4) за 5 мин каждый мыть при комнатной температуре (RT).
2. Желатин инфильтрации и монтажа
   1. теплой до 15 мл местные продукты бренда желатина 12% w/v в PB (фосфатного буфера, 0,1 М рН 7,4) на 40 ° C. Удалите PBS и добавить желатин решение в пробирки, содержащие глаз. Нажмите трубка мягко для обеспечения желатин инфильтраты образца и проинкубируйте 10-30 мин при 40 ° C в thermoblock с нежным встряхивания или на водяной бане.
   2. Заполнить 12 мм x 5 мм x 3 мм кремния или полиэтилена плоский встраивание формы с теплой желатин в водяной бане 40 ° C. Добавьте два глаза за плесень с помощью пипетки, выровнять их должным образом под бинокль с помощью иглы рассечение и пусть желатин остыть при комнатной температуре в течение 1 мин и затвердевают при 4 ° C на 20 мин
   3. Повторно отделка блок желатина под бинокль, чтобы соответствовать один глаз на блок с помощью лезвия бритвы.
   4. Передавать 2,3 М сахарозы в PB желатин встроенных глаза на льду. Инкубируйте на 4 ° C на ночь.
   5. Обмен новым 2,3 М раствора сахарозы и хранить при 4 ° С или 20 ° C; после этого шага, образцы готовы для разрезания или могут храниться при температуре-20 ° C в течение нескольких недель до месяцев.
   6. Повторно отделка блок желатина почти размер глаза перед передачей крио контактный. Замораживание в жидком азоте и передачи криоультрамикротом.
3. Cryosectioning
   1. Вырезать 110 Нм толщиной секций при-120 ° C с алмазным ножом в криоультрамикротом.
   2. Выбрать разделы с проводной цикл, содержащий капельку метилцеллюлоза 2% (в воде) и 2,3 М раствора сахарозы (1:1). Перенести разделы кремниевой пластины 7 x 7 мм. Хранить разделы на 4 ° C до дальнейшей обработки.

2. Immunolabelling

1. мыть пластин с PBS при 0 ° С 20 мин на четыре капли, поместив пластин вниз на капли. Мыть в PBS 2 x 2 мин при комнатной температуре.
Глицин
2. Инкубировать 3 раза в 0,15% в PBS, за 1 мин. Вымойте 3 x 1 мин/мыть с PBS. Предварительно incubate с PBG (PBS с BSA бычий сывороточный альбумин 0,5% и 0,2% желатина типа B) для 5 минут
3. Инкубировать с кролик анти Tom20 (см. Таблицу материалов) в PBG (4 мкг/мл) за 30 мин при комнатной температуре.
4. Мыть 6 x за 1 мин/мыть в PBG. Предварительно incubate с PBG на 5 мин на RT. инкубировать с анти кролик Alexa 647 F(ab') ₂ (см. Таблицу материалов) в PBG (7.5 мкг/мл) за 30 мин
5. Мыть 6 x за 1 мин/мыть в PBG. Вымойте 3 x 2 мин в PBS. Проинкубируйте с DAPI (4 мкг/мл) в PBS для 10 s. мыть 2 x 2 мин в PBS.

3. Супер-резолюции микроскопии

1. инкубировать вафельные кратко (10 s), поместив ее на капли раствора 1:1 глицерина (80%) и визуализации буфера, содержащий кислорода, очистки системы (200 мм фосфатного буфера, содержащий 10% глюкозы, 0.5 мг/мл glucoseoxidase, 40 мкг/мл каталазы, 15 мм бета mercaptoethylamine гидрохлорид (MEA HCL), рН 8,0).
2. Передача пластин (раздел вниз) Петри стекла (толщиной 170 ± 5 μm) снизу на свежие капли 1:1 смесь глицерина (80%) и визуализации буфера (как шаг 3.1).
3. Удалить со всех сторон, с пипеткой, большая часть жидкости под пластины. Использование полосы силиконовые исправить пластины на нижней части Петри.
   Примечание: Силиконовые полосы сделаны из двухкомпонентный клей силиконовый (3 x 12 мм).
Разделы
4. изображения на инвертированного микроскопа с помощью высокая числовая апертура (например 160 X / NA 1,43; см. Таблицу материалов) масло погружения супер резолюции выделенный цели. До обработки изображений, позволяют сбалансировать Микроскоп температуры для того, чтобы свести к минимуму и уменьшить боковые и осевого смещения выборки.
5. Центр области интересов и приобрести первые widefield эпифлуоресцентного ссылкой изображения. Изменить режим работы супер резолюции. Отрегулируйте время экспозиции камеры до 15 мс и установите электрон умножения (EM) получить максимум 300.
6. Освещения образца с 642 Нм непрерывная волна лазера на мощность максимальная лазера (соответствующий ~2.8 кВт/см ²) в режиме эпифлуоресцентного. Как только одной молекулы мигает хорошо отделены в каждом кадре, так что вероятность низка, что отдельные сигналы пересекаются, установите мощность лазера до ~0.7 кВт/см ². Запись изображений в формате raw в режиме эпифлуоресцентного путем приобретения минимум 30 000 кадров.
   Примечание: Все эти параметра может изменяться в зависимости от различных образцов и маркировки плотностями.
7. От исходных данных, создать список событий реконструкции (локализации каждого одной молекулы скачок в raw изображений) с помощью обнаружения порога 30 фотонов (должен корректироваться по образцу), нажав " вычислить " в ' t серии анализ ' под ' инструменты '.
8. Визуализировать изображения супер резолюции Гаусса фитинга ¹⁶ применения рендеринга пикселей размером 4 Нм, нажав " создать образ " в ' Группа обработки списка событий ' под ' инструменты. '
   Примечание: Для создания супер решена изображения интегрированные программные инструменты системы, используемые в данном исследовании были заняты. Однако, описанные супер резолюции изображений может быть выполнена на любой другой системе локализации на основе одной молекулы, и данные могут обрабатываться с открытым исходным кодом программного обеспечения инструменты как гроза ¹⁷.

4. Платиновый затенение

1. удаления кремния полосы и добавить каплю PBS недалеко от края пластины поднять его вверх от Петри. Промойте пластины 2 x 2 мин в PBS, то пост исправить ее с 0.1% глютаральдегид в PBS для 5 минут промыть 2 x 2 мин/мыть в PBS.
2. Инкубировать вафельные дважды за 5 мин/инкубации в 1 капле метилцеллюлоза 2% в воде на льду. Вставьте вафля в пластиковых пробирок и центрифуги на 14 100 x g для 90 s. горе его на заготовка SEM алюминия с проведением углерода цемента.
3. Добавить слой от 2 до 10 Нм платины/углерода на образце, роторный затенение на 8° с помощью электрона луча параметры устройства испарения: 1.55 кв, 55 мА, 0,3 Нм/s и угол 8°, вращение уровень 4.

5. Сканирующая электронная микроскопия

1. изображения секций с сканирование электрона мicroscope на 1,5 кв, 2 мм рабочих расстояние и с в объектив детектор средних электронов.

6. Выравнивание света и электронной микроскопии изображений

1. Открыть обоих типов изображений с ¹⁸ Фиджи, нажав " файл | Открытые ". Отрегулируйте размер холста, нажав " изображение | Отрегулируйте | Размер холста " и принести оба изображения в стек, нажав " изображение | Стеки | Изображения в стек ". Сохранить как тип файла tiff стек.
2. В Фиджи, откройте новый интерфейс TrackEM2 ¹⁹, нажав " файл | новый | TrackEM2 (новый) ". Импорт стек с оба изображения, щелкнув правой кнопкой мыши на окне черный и выбрав " импорта стека ".
3. Выравнивание свет микроскопия image для электронной микроскопии изображений вручную с ориентиров, с помощью щелчка правой кнопкой мыши на изображении и выбрав " выровнять | Выровнять слой вручную с достопримечательностями ".
   1. Выбрать выберите инструмент (черная стрелка) для добавления достопримечательностей. Используйте форму ядер как ссылку для выбора же края в обоих изображений (дополнительный рис. 1). Добавьте несколько пунктов (минимум три точки должны быть выбраны). Применить выравнивание с Аффинная модель правой мышью, нажав кнопку и выбрав " применить преобразование | Аффинная модель ".
4. Изменить прозрачность слоя (см. дополнительный рис. 1), для оценки качества выравнивания.

Выражение протеина Tom20, субъединицы ацилкарнитин митохондриальных внешней мембраны комплекс20, определяется, в шлифов личиночной данио рерио сетчатки, супер резолюции световой микроскопии (рис. 1) и эта информация была дополнена топографических сигнала, полученные путем сканирования электронной микроскопии после Платиновый затенение те же разделы. Эти корреляционные данные подтверждают локализация протеина в ассоциации с конкретного отсека, внешней митохондриальной мембраны и, также представить информацию о соотношении белка с другие органеллы клетки.

Рисунок 1: Клем на сетчатке данио рерио. А. малое увеличение widefield образ раздела 5 dpf данио рерио сетчатки, ядер, окрашенных с DAPI (голубой). Б. сканирующая электронная микроскопия того же района. C. выше увеличение widefield изображение кадра в ядрах б. витражи с DAPI (голубой) и Tom20 митохондриальных пятнать отображается красным цветом. D. Widefield изображение же секции на увеличение. Шаблон Tom20 выражение находится в кластеры митохондрий. E. выражение из Tom20 (красные точки) определяется GSDIM микроскопии. Ядер окрашенных DAPI (голубой). F. же раздел как E объединение коррелятивных суперразрешением и растровая электронная микроскопия. Tom20 окрашивание (красные точки) появляется в митохондриальной кластера (M) в наружной мембраны митохондрий. Флуоресценции DAPI сигнала в ядрах (N) соответствует топографии SEM изображения. Г. высокое увеличение изображения кадра в F. Сканирования электронная микроскопия image предоставляет контекст для GSDIM изображения (красные точки). Митохондриальной макул ясно видны и Tom20 окрашивание локализован для наружной мембраны митохондрий. Мембраны внешнего сегмента фоторецепторов (OS) ясно разрешаются. Размер 5 пикселей изображения Нм. Масштаб бары: A, B и C: 10 мкм; D: 2 мкм; E и F: 1 мкм и G: 0,2 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Дополнительный рисунок 1: выравнивание изображения света и электронной микроскопии. A. скриншот из интерфейса TrackEM2 с изображением SEM и пронумерованных достопримечательности (желтый) вдоль различных ядер. Б. скриншот из интерфейса TrackEM2 с изображением флуоресценции и пронумерованных достопримечательности (желтый) вдоль различных DAPI окрашенных ядер. Чтобы изменить прозрачность слоя может использоваться ползунков на левой верхней части меню. Линейки: 1 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Авторы не имеют ничего сообщать.