Стандартизованный метод измерения внутренней площади поверхности легких с помощью мышечной пневмоэнцетомии и имплантации протезов

Краткое содержание

Внутренняя площадь поверхности легких (ISA) является критическим критерием для оценки морфологии и физиологии легких при заболеваниях легких и вызванной травмой альвеолярной регенерации. Мы описываем здесь стандартизованный метод, который может минимизировать смещение измерения для ISA в моделях мышиной пневмоэктомии и имплантации протезов.

Аннотация

Морфология, физиология и дыхательные функции легких изменяются как при физиологических, так и при патологических состояниях. Площадь внутренней поверхности легких (ИСА), представляющая газообменную способность легких, является важнейшим критерием для оценки дыхательной функции. Тем не менее, систематическая ошибка наблюдателя может существенно влиять на измеренные значения морфологических параметров легких. Протокол, который мы описываем здесь, сводит к минимуму вариации при измерении двух морфологических параметров, используемых для расчета ISA: внутреннего объема легких (ILV) и среднего линейного перехвата (MLI). Используя ISA в качестве морфометрического и функционального параметра для определения исхода альвеолярной регенерации как в моделях мышей с пневмонэктомией (PNX), так и с имплантацией протезов, мы обнаружили, что увеличение ISA после лечения PNX было значительно заблокировано имплантацией протеза в грудную полость¹. Ожидается, что возможность точного количественного определения ISA не только повысит надежность и воспроизводимость исследований функции легких в моделях альвеолярной регенерации, вызванной травмой, но и будет способствовать механистическим открытиям в области множественных легочных заболеваний.

Введение

Фундаментальной функцией легкого является обмен кислорода и углекислого газа между кровеносными сосудами и атмосферой. Болезни легких, такие как бронхолегочная дисплазия (БЛД), хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) и острые респираторные инфекции, приводят к снижению ИСА ² . Исследователи, изучающие болезнь легких, разработали несколько количественных методов для оценки морфологических изменений в легких, включая MLI, ILV, количество единиц газообмена, ISA и соответствие ткани легких ^{2 , 3} . Пионерские исследования Weibel et al. ⁴ и Duguid et al. ⁵ вместе установили, что ISA может использоваться как прямая мера способности газообмена легких в легких человека и может использоваться в качестве критерия для определения тяжести эмфиземы. В ряде исследований, опубликованных за последние пять лет, были использованы морфологические параметры легких ( например, 6 и во время восстановления после травмы PNX ^{1 , 7} . ISA рассчитывается с использованием уравнения 1 ^{8 , 9} :

, Где ILV представляет собой внутренний объем легких, а MLI является промежуточным параметром, который представляет собой размер ¹⁰ периферического воздушного пространства легких.

Известно, что PNX, хирургическое удаление одной или нескольких легочных долей, индуцирует альвеолярную регенерацию у многих видов, включая людей ¹¹ , мышей ¹ , собак ¹² , крыс ¹³ и кроликов ^{14 , 15} . Шпилькау мышей легких в течение четырнадцати дней после PNX показали , что как расширение уже существующих альвеол и формирование De Novo альвеол способствуют восстановлению ISA, РКН, а число альвеол в остальных тканях легкого ^1. Мы и другие показали, что введение таких материалов, как губка, воск или протез произвольной формы в пустую грудную полость после PNX ( т. Е. Имплантацию протеза) ухудшает альвеолярную регенерацию. В настоящее время твердо установлено, что механическая сила функционирует как один из наиболее важных факторов для инициирования альвеолярной регенерации ^{1 , 16 , 17} . В таких исследованиях была подчеркнута эффективность использования значений ИСА из обработанных PNX и имплантированных протезами легких в качестве критерия количественной оценки альвеолярной регенерации.

Известно, что смещение наблюдателя оказывает значительное влияние на измеренные значения vaСифилиса для морфологических параметров легких ( например , MIL и ILV). Стандартизированные протоколы могут использоваться для устранения этого смещения при определении как ILV, так и MLI, которые являются двумя параметрами, используемыми при расчете ISA. Здесь мы предоставляем очень подробные, стандартизированные протоколы для измерения этих параметров легких. Важно отметить, что способность точно оценивать ISA обещает повысить надежность и воспроизводимость исследований функции легких в моделях альвеолярной регенерации, вызванных травмами, и должна способствовать механистическим открытиям при множественных легочных заболеваниях.

Протокол

Все процедуры, используемые в этом протоколе, проводились в соответствии с рекомендациями Руководства по уходу и использованию лабораторных животных Национального института биологических наук в Пекине. 8-недельные мыши-самки CD-1 помещались в специальную патогенную среду (SPF) до проведения экспериментов. Хирургии проводили с использованием полностью обезболивающих мышей ( т. Е. Без каких-либо пинч-ответов). После операции мышей содержали в теплой, влажной комнате с достаточным количеством пищи и пресной воды. Мышей умерщвляли с использованием передозировки анестетика, получаемого внутрибрюшинной инъекцией.

1. Мышиная хирургия PNX

1. Полностью обезболивают мышей с фенобарбиталом натрия (120 мг / кг массы тела) и бупренорфином (0,1 мг / кг массы тела) с помощью внутрибрюшинной (IP) инъекции. Выполните операцию, когда мыши больше не реагируют на защемление пальцев.
2. Удалите волосы на левой грудной клетке мышей химическим оттиском(Площадь 3 х 3 см ² ).
3. Закрепите каждую мышь на интубационной платформе с ее вентральной стороной, обращенной к оператору ( рис. 1A ).
4. Вытяните язычок мыши и осветите голосовые связки небольшим животным ларингоскопом, содержащим выемку для направляющих катетеров ¹⁸ ( рис. 1А ).
5. Различают голосовые связки, наблюдая движения голосовых связок во время дыхания. Аккуратно вставьте внутривенную интубационную канюлю 20 G в трахею с передним углом ¹⁹ .
6. Поместите мышей в правое боковое лежачее положение и соедините канюлю с механическим вентилятором ( например, с контролем давления, см. Таблицу материалов ). Проверьте вставку канюли в трахею, наблюдая за дыхательными движениями сундука для мыши ( рис. 1B ).
7. Установите давление вдоха oF вентилятор до 12 см H ₂ O и установите скорость дыхания до 120 вдохов в минуту ( рис. 1B ).
8. Дезактивируйте кожу в хирургической области бетадином и 70% этанолом.
9. Сделайте 2-3-сантиметровый разрез грудной торакотомии в пространстве на 5- ^м межреберном пространстве, прорезь через кожу и мышцы с помощью Ножницы Весенние ножницы (режущая кромка: 14 мм, диаметр наконечника: 0,275 мм) ( рисунок 2В , С ). Хирургические инструменты, используемые для процедуры торакотомии, стерилизуются перед использованием.
10. Сделайте разрез 1,5 см на 5- ^м межреберье, чтобы выставить левое легкое ( рис. 2D , E ). Во время работы используйте высокотемпературный прижигатель, чтобы остановить кровотечение.
11. Поднимите одну треть левой легочной доли от сундука с помощью тупых щипцов ( рис. 2F ), а затем используйте ватный тампон, чтобы вытащить весь левыйЛегких ( фиг. 2G ).
12. Определите легочную артерию и бронхи левой легочной доли ( рис. 2G ).
13. Плотно лигируйте бронхи и сосуды в hilum с помощью шелкового хирургического шва и вырежьте левый левый лепесток на 3 - 4 мм от лигирования ( рис. 2H , I ).
    ПРИМЕЧАНИЕ. Будьте осторожны, чтобы не обрезать узлы швов на левом холме, что может вызвать пневмоторакс ( т. Е. Воздух или газ в полости грудной клетки) .
14. Закройте грудную стенку 1 швом, а затем последовательно выровняйте мышечный слой и слой кожи, используя 5-6 прерывистых швов. Оставьте промежуток 3 - 4 мм между каждым швом ( рисунок 2M , 2N ).
    ПРИМЕЧАНИЕ. Держите хирургическую иглу шва от сердца; Непреднамеренная сердечная пункция приведет к немедленной смерти.
15. Дезинфицируйте хирургическую зону повидон-йодом.
16. AfteВ хирургической операции поместите мышь на термопластическую панель на 38 ° C и подключите мышь к вентилятору, пока не начнутся самопроизвольные дыхательные движения ( рисунок 2O ).

2. Имплантация протеза

1. Выполните шаги 1.1-1.13 процедуры PNX (то есть до момента, когда левая левая доля мыши удалена).
2. Закрепите центр силиконового протеза (заказчика, 12 мм в длину, 3 мм в толщину, 7 мм в ширину, 0,2 г, эллипсоидальной формы) с использованием тупых щипцов ( рис. 2J ). Перед вставкой стерилизовать силиконовый протез.
3. Держите ребро с помощью щипцов одной рукой, чтобы выставить грудную полость, а затем вставьте протез в левую пустую грудную полость другой рукой.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Угол введения составляет приблизительно 45 градусов между фронтальной плоскостью протеза и грудной поверхностью ( рисунок 2K ,L). Будьте очень осторожны при вставке протеза. Чрезмерная сила приведет к разрыву плевры.
4. Отрегулируйте ориентацию протеза тупыми щипцами, чтобы протез занимал левую пустую грудную полость.
5. Выполните шаги 1.14 - 1.16 процедуры PNX мыши.

3. Измерение ILV

1. Подготовьте специальное устройство («инфляционную трубку»), состоящее из плунжера, удаляемого из одноразовой серологической пипетки (10 мл), гибкой трубки длиной 40 см с адаптером для иглы, регулирующего клапана расхода и иглы 18 G. После сборки закрепите пипетку на доске лентой ( рис. 3A ). Расстояние между вершиной пипетки и экспериментальной скамье должно составлять не менее 30 см.
2. Подготовьте свежий раствор для фиксации 4% параформальдегида (PFA) путем растворения 20 г PFA в 500 мл предварительно нагретого 1x забуференного фосфатом физиологическом растворе (PBS) на водяной бане с температурой 55 ° C, встряхивая вручнуюКаждые 10 мин, пока раствор не станет прозрачным. После охлаждения до комнатной температуры фильтруйте раствор с помощью фильтра 0,45 мкм.
   ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: При обращении с PFA используйте соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ).
3. Жертвенные мыши с передозировкой инъекции анестетика (0,8% фенобарбитала натрия, 1000 ед. / Мл гепарина).
4. Закрепите каждую мышь на пластине для вскрытия полистирола и распылите ее на 70% спирта.
5. Осторожно откройте мышь и вырежьте грудную клетку, используя ножницы, чтобы полностью обнажить легочные дольки.
6. Удалите чрезмерную ткань, используя ножницы, чтобы выставить трахею. Обязательно отделите трахею от пищевода.
7. Обрежьте брюшную аорту и вставьте иглу 25 калибра в правый желудочек сердца; Перед иглой присоедините иглу к 20 мл шприцу. Медленно подталкивайте 1x PBS в сердце, чтобы удалить клетки крови, пока легкие не станут белыми. Обычно для очистки легочных кровеносных сосудов требуется 5-10 мл PBS.
8. ЗаполнитеИзготовленную по индивидуальному заказу инфузионную трубку с 4% свежего PFA и удалить все пузырьки из трубки для накачивания.
9. Вставьте иглу 18-миллиметровой инфузионной трубки в трахею и закрепите трахею с помощью зажимов для сосудов, чтобы избежать утечки жидкости.
10. Вздуйте легкие с 4% PFA при постоянном транспульмональном давлении 25 см / H ₂ O ^{2 , 20} . Инкубируйте легкие при комнатной температуре в течение 2 ч для достижения полностью расширенных легких. Этот шаг «предварительной фиксации» имеет решающее значение для сохранения морфологии легких.
    1. Контролируя тюбик инфляции, запишите значение начального 4% объема PFA и запишите окончательный объем. Внутренний объем легких равен начальному объему PFA 4% минус окончательный объем PFA 4%.
11. Лигируйте трахею и используя ножницы, аккуратно рассекайте легкие (сохраняя легкие в неповрежденном состоянии) из окружающих соединительных тканей. Будьте очень осторожны, чтобы не повредить легкие.
12. INCUBate легкие в 50-миллилитровой конической трубке, заполненной 4% PFA в течение 12 ч при 4 ° C, с осторожным встряхиванием на шейкере (50 об / мин). Продолжайте обрабатывать и окрашивать ткани (см. Раздел 4).

4. Вложение тканей, секционирование и окрашивание гематоксилином и эозином (H & E)

1. После фиксации используйте ножницы Noyes Spring Scissors для обрезания сердца и чрезмерных соединительных тканей с легких. Аккуратно отделите отдельные легочные лепестки, отрезав бронх, который соединяет легочные доли с трахеей.
2. Экстенсивно мыть легочные доли 3 - 4 раза в 50 мл 1x PBS (30 мин / промывка) на орбитальном шейкере (50 об / мин).
3. После окончательной промывки криопротектор легочных долей, погружая их в 30% -ный раствор сахарозы (в 1х PBS) при 4 ° C, пока ткань не опустится до нижней части 50-миллилитровых конических пробирок (приблизительно 12 часов).
4. Перед встраиванием и криоселекцией тканей удалите образцы легких из труб с помощью щипцов, сохраните ихДолей для гистологического анализа, удалите оставшийся раствор сахарозы с поверхности образцов вспомогательных лепестков, а затем тщательно погрузите образец в чашку Петри, содержащую оптимальное значение температуры резания (OCT) в течение примерно 30 мин.
5. Заморозьте образцы вспомогательных лепестков OCT в жидком азоте, используя криомодели. Расположите наибольшую площадь поверхности лопасти параллельно дну формы.
6. Подготовьте в общей сложности три участка толщиной 10 мкм для каждого образца во время криосекции для гистологического анализа. Отбросьте первые 1 мм ткани, соберите один участок толщиной 10 мкм, выбросьте 0,5 мм ткани, соберите еще одну секцию, выбросьте 0,5 мм ткани и соберите третью (конечную) секцию.
7. Воздух высушите секции в течение 1 часа перед нанесением окрашивания H & E.
8. Выполнение окрашивания H & E
   1. Промойте секции в 3 - 4 изменениях водопроводной воды, а затем окрасьте участки в свежий гематоксилин в течение 2 мин; Промыть участок под проточной водопроводной водой; Погрузите секцию два раза в 1% раствор HCl-70% этанола для удаления избытка гематоксилина.
   2. Окрасить участок свежим эозином в течение 3 мин; Обезвоживают секции с помощью двух последовательных 30-секундных промывок в 95% этаноле и двух 30-секундных промывках со 100% этанолом; Очистить секции в ксилоле в течение 30 с, повторить этап очистки один раз в свежем ксилоле; Монтируйте слайды с монтажной средой, используя покровные стекла.

5. Количественная оценка MLI

1. Приобретайте цифровые изображения разделенных на H & E секций вспомогательных лепестков (увеличение 20X) с помощью микроскопа с ярким полем.
2. Чтобы количественно определить MLI, выберите в общей сложности 15 неперекрывающихся представлений (1000 мкм х 1000 мкм) из подходящих областей (без артерий и вен, основных дыхательных путей и альвеолярных каналов) из трех секций.
3. Поместите сетку с 10 равномерно распределенными вертикальными линиями и 10 равномерно распределенными горизонтальными линиями определенной длиныGth (1000 мкм) на выбранных областях с помощью инструмента линейки; Каждая линия, таким образом, расположена на расстоянии 100 мкм ( рис. 4B ).
4. Определите значение одного перехвата как линейную длину между двумя соседними альвеолярными эпителиями. Измерьте значения всех перехватов вдоль каждой линии длины 1000 мкм.
5. Для каждой сетки количественно оценивайте значения всех перехватов между 10 горизонтальными линиями длины 1000 мкм и 10 вертикальными линиями длины 1000 мкм.
   ПРИМЕЧАНИЕ. MLI представляет собой среднее значение длины перехвата из 15 сеток, проанализированных из трех разделов, подготовленных для каждой из вспомогательных долей.

6. Расчет ISA

1. Вычислить ISA, используя уравнение 1 (см. Введение ). См. Раздел 3 для измерения ILV и обратитесь к разделу 5 для количественной оценки MLI.

Результаты

Мы провели здесь эксперимент с группой, обработанной PNX, и имплантацией протеза (имплантированной протезом). Эти группировки такие же, как и группы, использованные в ранее опубликованном исследовании нашей исследовательской группы ¹⁴ .

Процедуры имплантации мыши PNX и протеза показаны на рисунке 2 . 8-недельные мыши-самки CD-1 используются для операций и для количественной...

Обсуждение

В этом протоколе мы приводим подробные описания измерения легочных параметров после введения легкого PNX и имплантации протеза. МСА теперь считается ключевым показателем для оценки функции дыхания при многих заболеваниях легких и вызванной травмой альвеолярной регенерации. Однако, хотя исследовательское сообщество легочной артерии соглашается с полезностью ИСА как полезной метрикой, на сегодняшний день мало внимания было уделено стандартизации измерения ILV и MLI, двух параметров, используемых для расчета ISA. Очевидно,...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Недорогой набор для прижигания	Fine Science Tools	18010-00
ножницы Noyes	Fine Science Tools	15012-12
Щипцы стандартного рисунка	Fine Science Tools	11000-12
Микроиглодержатели Castroviejo Fine	Science Tools	12060-01
Зажимы для сосудов	Fine Science Tools	18374-44
Канюля-20 калибр I. V.	Jinhuan Medical Product Co., LTD.	29P0601
Хирургический шовный материал	Jinhuan Medical Product Co., LTD.	F602
Платформа для интубации мышей	Penn-Century, Inc	Модель MIP
Ларингоскоп для мелких животных	Penn-Century, Inc	Модель LS-2-M
TOPO Вентилятор для мелких животных	Kent Scientific	RSP1006-05L
Термопрокладка	Stuart оборудование	SBH130D
пентобарбитала натриевая соль	Sigma	P3761
Гепарин натриевая соль	Sigma	H3393
Раствор гематоксилина	Sigma	GHS132
Эозин Y раствор, спиртовой	Sigma	HT110116
10 мл Пипетка	Thermo Scientific	170356
параформальдегид	Sigma	P6148
O.C.T Соединение	Ткань-Tek	4583
Аппарат для криосекции	Leica	CM1950
Одноразовая база форм	Fisher HealthCare	22-363-553
Игла 18 калибра	Becton Dickinson	305199
Повидон	йод Fisher Scientific	19-027132
70% этанол	Fisher Scientific	BP82011
Наборы для инфузии для одного использовать	Weigao	SFDA 2012 3661704
Фосфатный буферный физиологический раствор	Gibco	10010023
Ленты	3M Скотч	8915
Ватный диск	Vinda	Dr.P
Силиконовый протез Изготовленный	на заказ
Светлопольный микроскоп	Olympus	VS120
Инструмент для линейки	Adobe Фотошоп