Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Криоконсервация данио рерио сперматогонии всего яички иглой погружен ультра-быстрое охлаждение

7.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56118

⸱

4 марта 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Aquaculture, Szent István University

В этой статье

Краткое содержание

Основной целью данного исследования было адаптировать иглы погруженным стеклования (NIV) процедура криоконсервации весь данио рерио яичек. Кроме того был испытан воспроизводимости метода в пяти различных данио рерио штаммов.

Аннотация

Нынешние тенденции в науке и биотехнологии привести к созданию тысяч новых линий в модельных организмов, тем самым приводит к необходимости для новых методов для безопасного хранения генетических ресурсов за пределами общей практики ведения селекции колоний. Основной целью данного исследования было адаптировать иглы погруженным стеклования (NIV) процедура криоконсервации весь данио рерио яичек. Криоконсервация ранней стадии зародышевых клеток всего яички Нив предлагает возможности для хранения данио рерио генетических ресурсов, тем более, что после пересадки они могут перерастет как мужчин, так и женские гаметы. Яички были подакцизным, возлагали на акупунктурные иглы, достижение равновесного уровня в двух криозащитных сред (уравновешивания раствор, содержащий метанола 1,5 М и 1,5 М пропиленгликоля; и витрификации раствор, содержащий 3 M диметилсульфоксида и пропиленгликоля 3 M) и окунувшись в жидкий азот. Образцы были нагревают в серии трех последующее потепление решения. Основные преимущества этого метода являются (1) отсутствие сперматозоидов после переваривания утепленные яичек, способствуя тем самым течению манипуляций; (2) ультра-быстрое охлаждение позволяет оптимальной экспозиции тканей для жидкого азота, поэтому максимального охлаждения и снижения требуемой концентрации криопротектора, тем самым снижая их токсичности; (3) синхронное воздействие несколькими яичек криопротекторов и жидкого азота; и (4) повторяемость подтверждается получение жизнеспособности выше 50% в пяти различных данио рерио штаммов.

Введение

Новые тенденции в науке и биотехнологии привели к созданию тысяч новых мутантов линий мыши, дрозофилы, данио рерио и других видов используется как модельные организмы в биомедицинских и других наук1. Кроме того как новые технологии разрабатываются и становятся доступными, число мутантных линий неуклонно расти2. Это приводит к необходимости для безопасного хранения генетических ресурсов за пределами общей практики ведения селекции колоний. Как метод, который позволяет безопасного хранения генетических ресурсов для неопределенного периода времени, криоконсервация предлагает множество преимуществ, таких, как расширение репродуктивных сезона, обходит необходимость непрерывного поддержания broodstock, и это больше стоимости - и энергосберегающий труда2.

Протоколы для криоконсервации спермы, разработанных в последние несколько лет2,,34 предлагают возможность для успешного хранения, мужчины данио рерио генетического материала. Однако криоконсервация яйцеклетки или эмбрионы в рыбе пока невозможно из-за их сложную структуру и большое количество материала желток. Недавно практика трансплантации первичных зародышевых клеток (PGCs) или сперматогониальные стволовые клетки (SSCs) предлагает обойти этот барьер путем разработки функциональных спермы и яйца после пересадки5. Таким образом криоконсервация SSCs предлагает новые рубежи в сохранении редких и ценных генетических ресурсов.

Хотя криоконсервирования предлагает множество преимуществ, замедлить скорость замораживания процесс генерирует несколько условий, которые могут привести к повреждение клетки2. К ним относятся формирование внутриклеточного и внеклеточного льда, обезвоживание, криопротектора токсичности и другие. Внутриклеточного льда повреждает клетки, внеклеточного льда может привести к механического дробления клеток, в то время как диффузия воды из клеток во время замедлить скорость замораживания может привести к обезвоживанию6. Недавно витрификации как технику, которая предотвращает негативные последствия формирования льда были применены в криоконсервирования рыбы гамет7,8,9. Он представляет сверхбыстрого охлаждения технику через который внутренних и внешних СМИ превращаются в аморфных/стеклообразном состоянии без crystalizing в лед7,10. В птиц и млекопитающих видов10,11,12, тем самым открывая возможности для его применения в рыб, а также свидетельствует успешное витрификации ткани яичек и яичников.

В этом исследовании мы представляем иглы погруженным стеклования (NIV) процедура криоконсервации всего данио рерио яичек. Мы демонстрируем надежный метод для изоляции данио рерио ранней стадии зародыша клетки без загрязнения и криоконсервацию процесс, который дает сравнительно высокое количество ранней стадии зародыша клетки с низким присутствием других клеток, особенно сперматозоидов. В меру наших знаний это первое исследование продемонстрировать подробный визуализированных протокол для ультра-быстрого охлаждения рыбы гонадной материи и данио рерио микрофлорой клеток. Кроме того, воспроизводимости метода демонстрируется в пяти различных данио рерио штаммов: AB дикого типа, Каспер (Рой- / -; перламутр- / -), леопард (Леоt1/t1), Васа [тг (vas::eGFP)] и трансгенные линии Вильмс опухоли [тг (wt1b::eGFP 1)].

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все методы, описанные здесь были одобрены венгерский закон благосостояния животных.

1. Реагент подготовка

  1. Акций решения
    1. Подготовка 1 M Трегалоза, добавив 0,378 g Трегалоза дигидрат в 1 мл dH2O. Mix хорошо до тех пор, пока он растворяется полностью.
    2. Подготовка 1 М сахарозы, добавив 0,342 г сахарозы в 1 мл dH2O. Mix хорошо до тех пор, пока он растворяется полностью.
    3. Подготовка 1 М HEPES путем добавления 0,238 g HEPES 1 мл dH2O. Mix хорошо до тех пор, пока он растворяется полностью.
    4. Подготовьте коллагеназы 20 мг/мл (290 U/мг), добавив 100 мг в 5 мл ФСБ. Тщательно перемешивайте до тех пор, пока она растворяется. Стерильные фильтр через фильтры 0,2 мкм. Аликвота 50 мкл в 0.2 мл ПЦР пробирок и замерзает при - 20 ° C.
    5. Подготовка 15 мг/мл трипсина (~ 10000 U/мг), добавив 75 мг в 5 мл ФСБ. Тщательно перемешивайте до тех пор, пока она растворяется. Стерильные фильтр через фильтры 0,2 мкм. Аликвота 50 мкл в 0.2 мл ПЦР пробирок и замерзает при - 20 ° C.
    6. Подготовка 1 мг/мл DNase I (~ 3000 U/мг), добавив 5 мг в 5 мл ФСБ. Тщательно перемешивайте до тех пор, пока она растворяется. Стерильные фильтр через фильтры 0,2 мкм. Аликвота 50 мкл в 0.2 мл ПЦР пробирок и замерзает при - 20 ° C.
    7. Подготовьте 0,4% Трипановый синий, добавив 40 мг Трипановый синий 10 мл ФСБ. Стерильные фильтр через фильтры 0,2 мкм. Аликвота 1 мл в 1,5 мл пробирок.
    8. Подготовка 200 мг/Л MS-222 (Tricaine метан сульфонат), добавив MS-222 200 мг в 1 Л dH2O. Mix хорошо до тех пор, пока он растворяется полностью. Кроме того буферного раствора MS-222 с бикарбонатом натрия с нейтральным pH 7.0.
  2. Решения для витрификации
    1. Приготовляют раствор уравновешивания (ES): подготовка 2 мл ES путем смешивания 121,5 мкл метанола (метанола; 1,5 М), 220 мкл пропиленгликоля (PG; 1,5 М), 200 мкл FBS (10%), 200 мкл раствора Трегалоза штока (0,1 М), 50 мкл HEPES раствор (25 мм) и 1208.5 мкл L-15 в 2 мл.
    2. Приготовляют раствор стеклования (VS): подготовка 2 мл VS путем смешивания 439 мкл PG (3 M), 426 мкл диметилсульфоксида (мне2так; 3 M), 200 мкл FBS (10%), 200 мкл раствора Трегалоза штока (0,1 М), 50 мкл HEPES складе решение (25 мм) и 685 мкл L-15 в 2-мл пробирку.
  3. Решения для утепления
    1. Подготовить потепления решение 1 (WS1): подготовить 1,5 мл WS1 в 2-мл пробирку, смешивая 150 мкл FBS (10%), 450 мкл раствора сахарозы штока (3 М) и 900 мкл L-15.
    2. Подготовить потепление решения 2 (WS2): подготовить 1,5 мл WS2 в 2-мл пробирку, смешивая 150 мкл FBS (10%), 150 мкл раствора сахарозы штока (1 М) и 1200 мкл L-15.
    3. Приготовляют раствор потепления 3 (WS3): подготовка 1,5 мл WS2 в 2-мл пробирку путем смешивания 150 мкл FBS (10%) и 1350 мкл L-15.
  4. Приготовляют раствор пищеварения: для каждого образца подготовить 500 мкл раствора пищеварение, смешивая 50 мкл коллагеназы Стоковый раствор (2 мг/мл), 50 мкл Стоковый раствор трипсина (1,5 мг/мл), 10 мкл DNase I (20 мкг/мл) и 390 мкл L-15 в 2 мл трубки.
  5. Получение рассечение инструменты: ножницы, microscissors, пинцеты, изогнутый пинцет и иглы для акупунктуры.

2. яички коллекция

  1. Усыпить рыбы, поместив его в блюдо содержит 200 мг/Л MS-222 (рН = 7). Прежде чем продолжить рассечение, убедитесь, что жабры перестали двигаться, и что по крайней мере 10 минут прошло с того момента для обеспечения смерти гипоксии.
  2. Высушите рыбы, погладив на бумажное полотенце и положите его на спинной стороне на рассечения мат.
    1. Во-первых, отрежьте таза и грудные плавники для легче рассечение.
    2. По горизонтали резать кожу на животе рыб между грудными плавниками и вырезать кожу и основные мышцы вдоль живота до анального плавника.
    3. Откройте полости тела рыб и ПИН-код левой и правой стенки тела на вскрытие ковер с иглы.
      Примечание: Яичек расположены выше желудочно-кишечных органов по обе стороны плавательный пузырь (рис. 1).
  3. Для предотвращения загрязнения, не вынимают органы желудочно-кишечного тракта, но мягко подтолкнуть их в одну сторону и удалять яички от противоположной стороны. Яички подключены к стене тело так тщательно удалить их и сократить смежные брюшины microscissors.
  4. Кроме того, во избежание загрязнения, во-первых, стерилизовать семенников, поместив их в этанол 70% для 2 s, а затем место их в L-15 на 96-луночных тарелку на льду.
    Примечание: Если это необходимо, чистые яички из жировой ткани и крупные кровеносные сосуды точно под стереомикроскопом

3. Ультра-быстрое охлаждение яичек ткани

  1. Марк иглы с соответствующие этикетки в зависимости от образца типа и подготовить уравновешивания (ES) и витрификации решения (VS).
  2. Передать яички крупных хорошо тарелку или блюдо и pin два-три яичек (или больше в зависимости от размера иглы) на стерильные акупунктурные иглы.
    1. Во-первых позиции яички поверх изогнутые пинцетом. Поместите точку иглу в середине яички и осторожно потяните яички вверх с помощью пинцета.
    2. После прокола яички, осторожно потяните его вверх к верхней части иглы. Убедитесь, что яички отделены друг от друга и что они не падают или скольжения вниз.
    3. Место иглы с закрепленного яичек в 2-мл пробирку заполнены с L-15 до стеклования (при 25 ° c; время хранения не должен превышать 1 ч).
      Примечание: Закрепление яички на иглы должно быть сделано быстро, чтобы предотвратить яички от высыхания.
  3. Передача иглой с яичек в раствор уравновешивания и инкубировать в течение 5 мин в 25˚C.
  4. Передача иглы в раствор стеклования и Инкубируйте 30 s на 25˚C.
  5. Удалите иглу из решения витрификации, быстро и аккуратно поглощают оставшийся раствор из ткани, стерильной салфеткой. Используйте осторожно, чтобы избежать яички прилипания к бумажным полотенцем или падать.
  6. Быстро место иглы в жидкий азот, помещены в коробки из пенопласта.
    Примечание: Сделайте этот шаг быстро, чтобы избежать воздействия ткани пара жидкого азота. Использование низких объемов жидкого азота для предотвращения перекрестного загрязнения образцов.
  7. Храните иглу в жидком азоте в закрытой пенополистирола коробки для 5-10 мин.
  8. Precool открыл 4,5 мл cryotube и его крышка в том же окне.
  9. После 5-10 мин передачи каждой иглы в отдельном cryotube под поверхностью жидкого азота и закрыть cryotube.
    Предупреждение: Всегда используйте защитную одежду (например, изолированные перчатки) при работе с жидким азотом, как воздействие может привести к серьезным обморожения.
  10. Место cryotube на метал тростник и поместите его в криобанке канистру как можно быстрее. Хранить образцы в канистры для хранения Дьюар до дальнейшего использования.

4. потепление процедуры

  1. Тепло в каждой иглы отдельно. Все потепления решения должны быть при 25 ° C.
  2. Отсоедините cryotube от металла тростника и окунуться в жидкий азот, хранящиеся в ящик из пенопласта.
  3. Открыть cryotube в жидком азоте пара (с помощью щипцов) и отпустите иглы в жидкий азот.
  4. Передача игла очень быстро в первый раствор потепления и инкубировать в течение 1 мин (при 25 ° C). Убедитесь, что для передачи иглы быстро, чтобы предотвратить его потепления в воздухе во время передачи.
  5. Передача иглы в втором потепления раствор и Инкубируйте 3 мин (при 25 ° C).
  6. Передача иглы в третьем потепления раствор и инкубировать в течение 5 мин (при 25 ° C).
  7. Отпустите яички от иглы, сдвинув их вниз с Изогнутый пинцет. Место каждого утепленные яички индивидуально в отдельную скважину (96-луночных Латы) заполнены с 250 мкл L-15 дополнена 10% FBS. Убедитесь, что колодцы обозначены по образцу. Храните хорошо пластины на льду до тех пор, пока все образцы утепляются и до дальнейшей работы.

5. ткани пищеварение

  1. Подготовка 500 мкл раствора диссоциации для каждого образца в отдельный 2 мл пробирок. Метки трубы согласно код образца. Инкубируйте подготовленные диссоциации решение для 5 мин при комнатной температуре.
  2. Добавить утепленные ткани в раствор пищеварение и нарезать на мелкие кусочки, по крайней мере 30 движений малых ножницами.
  3. Инкубируйте отрезока ткани на тряску тарелку 90 мин в 25 градусов.
  4. Остановить процесс пищеварения, добавив 400 мкл L-15 и 100 мкл FBS (FBS 10% v/v). Коротко встряхнуть решение и инкубировать в течение 1 мин при комнатной температуре.
  5. Отфильтровать полученный раствор через 50 мкм фильтры в 1,5 мл трубку. Этикетке трубки соответственно.
  6. Центрифуга для отфильтрованных решение на 200 г × 10 мин на 25 градусов.
  7. Тщательно удалить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 20 мкл L15 дополнена 10% FBS. Вручную встряхните трубки до полного растворения гранул. Держите суспензию клеток на льду или на 4 ° c до дальнейшего использования.

6. жизнеспособность оценки и подсчета клеток

  1. Смешайте 5 мкл суспензии клеток и 5 мкл раствора Трипановый синий 0,4% в соответствующей маркировкой 0.2 мл ПЦР-пробирку. Если используются разные тома, убедитесь, что коэффициент разрежения останков 1:1.
  2. Инкубируйте этого подвеска для 1-3 мин при комнатной температуре (25 ° C).
  3. Проверьте жизнеспособность каждого образца в Горяева под микроскопом.
  4. Подсчитать количество живых клеток (незапятнанное Трипановый синий) в 15 областях. Рассчитайте общее количество клеток в 20 мкм суспензию клеток. Подвеска теперь готов для любого приложения, ниже по течению.
    Примечание: При оптимизации процедуры для других видов с размером тела, используйте яички фрагменты равный вес. Использование яички от одного лица для всех экспериментальных групп для того, чтобы избежать Индивидуальная изменчивость в результатах. В случае данио рерио, мы воспользовались тот факт, что левый и правый яички должны содержать равных (или очень похожие) количество клетки семенозачатка13 (см. Результаты представитель). Левого яичка был сохранен как элемент управления, хотя право яички стеклообразное/утепленные. Жизнеспособность процент было рассчитано количество клеток, изолированных от стеклообразное/утепленные яички, по сравнению с количество клеток, изолированных от свежих яички.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В среднем количество ранней стадии зародышевые клетки изолированы от одного свежие данио рерио яичка колебался от 40 000 до 200 000 ячеек в зависимости от размера рыбы. Когда переваривания свежие данио рерио яичек в все 5 штаммов, ранние половые клетки были не только клетки присутствуют в клеточных суспензий (рис. 2). Рядом с ранней стадии зародышевых клеток а также были найдены многочисленные сперматозоидов. С другой стороны там были гораздо меньше сперматоз...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Основной целью данного исследования было адаптировать иглы погруженным сверхбыстрого охлаждения процедуры, разработанные для птиц и млекопитающих видов10,11,12 – замораживание рыбы яички (у рыбок данио как модель организм). Большинство предыдущих исследований относительно криоконсервирования данио рерио генетических ресурсов были главным образом сосредоточены на криоконсервации у рыбок данио спермы2,...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Это исследование было поддержано национальных исследований, разработок и инноваций управление Венгрии (Грант 116912 в ÁH), стоимость управления (продовольствие и сельское хозяйство стоимость действий FA1205: AQUAGAMETE), обладательница Хунгарикум стипендий (Грант для ZM) и новый Венгерский национальный Excellence лектор стипендий (Грант EK).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Leibovitz media (L-15)Sigma-AldrichL1518с добавлением L-глутамина
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Sigma-AldrichF9665
Трикаин метансульфонат (MS-222)Sigma-AldrichE10521
HEPESSigma-AldrichH3375
СахарозаAcros Organics57-50-1
ТрегалозаAcros Organics99-20-7Дигидрат
метанолаReanal20740-0-08-65
ПропиленгликольReanal08860-1-08-65
ДиметилсульфоксидReanal00190-1-01-65
КоллагеназаGibco9001-12-1
ТрипсинSigma-AldrichT8003
DNase IPanreac AppliChemA3778
Trypan blueSigma-AldrichT6146
Фоспат буферизованный физиологический раствор (PBS)Sigma-AldrichP4417Таблетки для приготовления 200 мл раствора PBS

Ссылки

  1. Mazur, P., Leibo, S. P., Seidel, G. R. J. Cryopreservation of the germplasm of animals used in biological and medical research: Importance, impact, status, and future directions. Biol. Reprod. 78 (1), 2-12 (2008).
  2. Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. Cryopreservation and In Vitro Fertilization at the Zebrafish International Resource Center. Methods Mol. Biol. 546, 45-65 (2009).
  3. Yang, H., Carmichael, C., Varga, Z. M., Tiersch, T. R. Development of a simplified and standardized protocol with potential for high-throughput for sperm cryopreservation in zebrafish Danio rerio. Theriogenology. 68 (2), 128-136 (2007).
  4. Morris, J. P. IV, Berghmans, S., Zahrieh, D., Neuberg, D. S., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish sperm cryopreservation with N,N-dimethylacetamide. Biotechniques. 35 (5), 956-968 (2003).
  5. Yoshizaki, G., et al. Spermatogonial transplantation in fish: A novel method for the preservation of genetic resources. Comp. Biochem. Physiol. Part D: Genomics Proteomics. 6 (1), 55-61 (2011).
  6. Gao, D., Critser, J. K. Mechanisms of cryoinjury in living cells. ILAR J. 41 (4), 187-196 (2000).
  7. Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horváth, Á Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review. Gen. Comp. Endocrinol. 245, 69-76 (2017).
  8. Kása, E., et al. Development of sperm vitrification protocols for freshwater fish (Eurasian perch, Perca fluviatilis) and marine fish (European eel, Anguilla anguilla). Gen. Comp. Endocrinol. 245, 102-107 (2017).
  9. Cuevas-Uribe, R., Leibo, S. P., Daly, J., Tiersch, T. R. Production of channel catfish with sperm cryopreserved by rapid non-equilibrium cooling. Cryobiology. 63 (3), 186-197 (2011).
  10. Wang, Y., Xiao, Z., Li, L., Fan, W., Li, S. W. Novel needle immersed vitrification: A practical and convenient method with potential advantages in mouse and human ovarian tissue cryopreservation. Hum. Reprod. 23 (10), 2256-2265 (2008).
  11. Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. Production of Live Offspring from Testicular Tissue Cryopreserved by Vitrification Procedures in Japanese Quail (Coturnix japonica). Biol. Reprod. 88 (5), 124(2013).
  12. Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. Novel needle-in-straw vitrification can effectively preserve the follicle morphology, viability, and vascularization of ovarian tissue in Japanese quail (Coturnix japonica). Anim. Reprod. Sci. 134 (3-4), 197-202 (2012).
  13. Lee, S., Yoshizaki, G. Successful cryopreservation of spermatogonia in critically endangered Manchurian trout (Brachymystax lenok). Cryobiology. 72 (2), 165-168 (2016).
  14. Marques, L. S., et al. Viability of zebrafish (Danio rerio) ovarian follicles after vitrification in a metal container. Cryobiology. 71 (3), 367-373 (2015).
  15. Lujić, J., et al. First successful vitrification of salmonid ovarian tissue. Cryobiology. 76, 154-157 (2017).
  16. Bono-Mestre, C., Cardona-Costa, J., García-Ximénez, F. Effects on cell viability of three zebrafish testicular cell or tissue cryopreservation methods. CryoLetters. 30 (2), 148-152 (2009).
  17. Marinović, Z., et al. Cryosurvival of isolated testicular cells and testicular tissue of tench Tinca tinca and goldfish Carassius auratus following slow-rate freezing. Gen. Comp. Endocrinol. 245, 77-83 (2017).
  18. Pšenička, M., Saito, T., Rodina, M., Dzyuba, B. Cryopreservation of early stage Siberian sturgeon Acipenser baerii germ cells, comparison of whole tissue and dissociated cells. Cryobiology. 72, 119-122 (2016).
  19. Lee, S., Iwasaki, Y., Shikina, S., Yoshizaki, G. Generation of functional eggs and sperm from cryopreserved whole testes. Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 110 (5), 1640-1645 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Криоконсервация данио рерио сперматогонии всего яички иглой погружен ультра-быстрое охлаждение
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.