Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Методология простой нейронной механической травмы для изучения

5.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56128

⸱

19 июля 2017 г.

 , 
1Department of Biological Sciences, Quinnipiac University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы описываем простой и широко доступный метод травмирования сегментных нервов у личинок дрозофилы для визуализации и количественной оценки нейродегенерации моторных нейронов в нервно-мышечном соединении (NMJ) личинок третьего возраста.

Аннотация

Дегенерация нейронов происходит при нормальном развитии и в ответ на травмы, стресс и болезнь. Клеточные признаки нейрональной дегенерации удивительно похожи у людей и беспозвоночных, а также молекулярные механизмы, которые приводят к этим процессам. Фруктовая мушка Drosophila melanogaster предоставляет мощный, но простой генетический модель организма для изучения клеточных проблем нейродегенеративных заболеваний. Фактически, около 70% связанных с болезнью генов человека имеют гомологи Drosophila, а множество инструментов и анализов описано с использованием мух для изучения нейродегенеративных заболеваний человека. Более конкретно, нейромышечный переход (NMJ) у Drosophila оказался эффективной системой для изучения нейромышечных заболеваний из-за способности анализировать структурные связи между нейроном и мышцей. Здесь мы сообщаем об анализе травматического повреждения нейронов in vivo у Drosophila , которыйВоспроизводимо индуцирует нейродегенерацию в NMJ через 24 часа. Используя эту методологию, мы описали временную последовательность клеточных событий, приводящих к дегенерации моторных нейронов. Метод травматизма имеет разнообразные применения и также используется для идентификации конкретных генов, необходимых для нейродегенерации, и для анализа транскрипционных ответов на повреждение нейронов.

Введение

Дегенерация нейронов происходит при нормальном развитии и может быть вызвана естественным процессом старения, травмой, стрессом или болезненными состояниями. Drosophila melanogaster , общая плодовая муха, обеспечивает простой и мощный модельный организм для изучения нейродегенерации из-за замечательных сходств в молекулярных механизмах, которые приводят к дегенерации нейронов. Эти сходства подчеркиваются тем фактом, что около 70% связанных с заболеванием человеческих генов имеют гомологи Drosophila . 1 Кроме того, были разработаны и использованы в Drosophila многочисленные анализы и технологические инструменты для изучения нейродегенеративных заболеваний человека. 2 , 3 Внутри дрозофилы нейромышечный переход (NMJ) позволяет анализировать как клеточные, так и электрофизиологические свойства и оказался важной системой для изучения нервно-мышечного заболевания из-за видимого nЭврон-мышечные связи. 2 В этом исследовании мы описываем анализ травм in vivo нейронов у личинок дрозофилы, который позволяет воспроизводить повреждение сегментных нервов. Эта травма мотонейронов приводит к временной последовательности клеточных событий, приводящей к нейродегенерации при 38-часовой травме NMJ. Способность воспроизводственно травмировать мотонейроны, приводящие к нейродегенерации, имеет разнообразные применения, такие как идентификация специфических генов, необходимых для дегенеративного процесса, раскрытие транскрипционных ответов на повреждение нейронов и анализ защитных сигнальных каскадов. 4 , 5 , 6 Этот метод также использовался в сочетании с микрофлюидикой для изучения дегенерации нейронов и регенерации у живых животных. 7

Мы используем установленный количественный анализ для изучения дегенерации моторных нейроновИон на Drosophila NMJ после механического повреждения. Этот анализ основан на том факте, что потеря пресинаптической мембраны и белков предшествует разборке сусинаптического ретикулума (SSR), характеризующегося складками постсинаптической мышечной мембраны. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 Этот анализ позволяет количественно определить «синаптические следы», где пресинаптический нейрон потерял связь с соседней постсинаптической мышцей. Показано, что дегенеративный процесс является прогрессирующим в течение развития личинок 12 и не может быть объяснен измененным развитием синапса или прорастанием. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 ОбъявлениеПреимущество использования механического повреждения перед существующими мутациями заключается в том, что он позволяет рассекать временную последовательность клеточных событий, ведущих к нейродегенерации в NMJ. 13

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка реагентов и оборудования

  1. Приготовить 1x Диссекторный буфер (70 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 0,02 мМ CaCl 2 , 20 мМ MgCl 2 , 10 мМ NaHCO 3 , 115 мМ сахарозы, 5 мМ трегалозы, 5 мМ HEPES, pH 7,2).
  2. Подготовьте 1 х фосфат-буферный солевой раствор (PBS).
  3. Подготовьте 1x PBT, используя 1x PBS с 0,01% Triton X-100.
  4. Приготовьте чашки с агаром из фруктового сока. 14 Вкратце, смешать 30 г агара в 700 мл H 2 O и автоклаве. Растворить 0,5 г метилпарабена в 10 мл этанола и добавить раствор в 300 мл концентрата фруктового сока (виноград или яблоко). Смешайте концентрат в автоклавированном растворе агара и вылейте в крышки чашки Петри размером 10 мм х 35 мм.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Премикс мощности виноградного агара также можно приобрести у различных компаний (см. Таблицы материалов ).
  5. Получите щипцы размером 5, которые позволяют механически ранить личинок.
  6. Использовать стандартный Drosophila CO 2 на основе анестезии.

2. Выбор личинок дрозофилы

  1. Возьмите флакон или бутылку дрозофилы с блуждающими личинками третьего возраста, которые были культивированы при 25 ° C.
  2. Выберите десять индивидуальных личинок 2- го или 3- го возраста на основе внешнего вида. Личинки третьего возраста могут быть идентифицированы по появлению передних разветвленных дыхальцев, тогда как личинки второго возраста меньше и имеют больше клубничных передних дыхальцев.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Стадии личинок также можно определить по времени. При 25 ° C личинки второго возраста появляются примерно через 48 часов после вылупления, а личинки третьего возраста линяют примерно через 24 часа. Если вы заинтересованы в изучении нейродегенерации в NMJ, личинки второго возраста должны быть ранены.

3. Подготовка личинок дрозофилы к механическим повреждениям

  1. Тщательно подбирайте отдельных личинок щипцами или кистью, осторожноНе сжимать его в любом случае.
  2. Непосредственно поместите десять личинок в стеклянную посуду, содержащую холодный 1X PBS или буфер для вскрытия, чтобы удалить остатки пищи и замедлить подвижность личинок.

4. Механическая травма и лечение личинок дрозофилы

  1. Поместите каждую личинку на аппарат для обезболивания CO 2 .
  2. Под рассекающим микроскопом осторожно сверните каждую личинку на их спинную сторону, чтобы визуализировать сегментные нервы через кутикулу.
  3. Размер положения 5 зажимает примерно от 1/2 до 2/3 пути по длине личинки, начиная с крючков для рта. После размещения зажмите приблизительно 1/3 вентральной кутикулы, содержащей сегментные нервы с щипцами размера 5.
    1. Чтобы обеспечить повреждение личиночных сегментных нервов, нанесите достаточную силу, чтобы раздавить сегментные нервы, но оставите кутикулу неповрежденной. Чтобы определить правильное количество силы, раздавить 10 личинок и обеспечитьСмертность через 5 ч составляет менее 50%.
  4. После травмы тщательно переносите личинки на пластинку с агаром из фруктового сока, содержащую приблизительно 0,5 г дрожжевой пасты. Поместите каждую личинку, чтобы ее передний конец находился на дрожжевой пасте, для продолжения кормления, несмотря на разрушенную подвижность.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Чтобы гарантировать, что личиночные сегментные нервы были повреждены, нарушенная подвижность личинок может наблюдаться после переноса на пластину агара. Поврежденная личинка эффективно парализована позади места повреждения, но все еще может перемещать крючки для рта и кормить. Высокая смертность животных после травмы распространена, поэтому лучше всего нанести на 20-50% больше животных, чем это необходимо для эксперимента.
  5. Поместите агаровые пластины, содержащие дрожжевую пасту, и 10 раненых личинок на дно пустой чашки Петри размером 100 х 15 мм. Накройте эту чашку Петри, теперь содержащую раненых личинок на агаровой тарелке с влажным бумажным полотенцем, гарантируя, что бумажное полотенце не касается личинок или пластин агара. Поместите этоПетри в большой воздушный контейнер, при комнатной температуре.
  6. Извлекайте личинок для вскрытия после определенных периодов (6, 12 или 24 ч) после травмы.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Для изучения непосредственного воздействия травмы на аксоновский цитоскелет личинки могут быть разрезаны непосредственно после травмы. Чтобы исследовать дефекты переноса аксонов, личинки могут быть расчленены примерно через 6 часов после травмы. Примерно через 12 ч после травмы можно наблюдать нарастание убиквитиновых белков и через 24 часа после травмы можно наблюдать дегенерацию моторных нейронов в NMJ.

5. Анализ нейродегенерации в NMJ

  1. Расчтите личиночный лишай Drosophila NMJ, как описано ранее. 15 , 16 Вкратце, личинки личинок на плите Сильгара, разрезанные по дорзальной поверхности, и филе с булавками в капле буфера для рассечения, чтобы обнажить мускулатуру стенки тела. Зафиксируйте личинки либо в 4% параформальдегиде (PFA), либо в растворе Буина в зависимости от анти-Тела, используемые для визуализации нейронов и мышц.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Фиксацию PFA следует использовать, если флуоресцентные белковые метки, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP), должны быть визуализированы, поскольку фиксация Буина может быть слишком резкой.
  2. Выполните иммунофлюоресценцию, которая была описана ранее 11 , 13 , 16 , чтобы одновременно отметить пресинаптические двигательные нейроны и смежные постсинаптические (SSR) мышечные складки. Визуализируйте пресинаптические мембраны и аксоны с флуоресцентно конъюгированной пероксидазой хрена (HRP) (1: 300) 17, а активные зоны можно окрашивать с использованием антитела против Брухпилота (Brp) (nc82, 1: 100, Hybridoma Bank Developmental Studies). Одновременно маркируют постсинаптические мышцы с анти-Dics Large (Dlg) антителом (1: 10000). 18
  3. Выполните установленный анализ для количественной оценки нейродегенерации в NMJ, как описано ранее. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 Вкратце, одновременно визуализируйте отдельные NMJ как для пред-, так и для постсинаптических компартментов. Любые бутоны, помеченные постсинаптическими маркерами, но не пресинаптические маркеры, указывают на сайты нейродегенерации ( рисунок 1 ). Среднее количество бутонов на NMJ, а также среднее количество NMJ на животное можно количественно определить.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Используя представленную здесь процедуру, мы продемонстрировали, что механическое повреждение нейронов позволяет временно рассекать нейродегенеративные события. 14 , 18 Последовательность событий была ранее охарактеризована и начинается с немедленного нарушения цитоскелета, с последующими дефектами торможения аксоном, накоплением убиквитированных белков и последующей нейродегенерацией через 24 часа после травмы. До травмы WT NMJ ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Обнаруженная здесь нейронная механическая травма может быть использована для индуцирования травмы / стресса в сегментных нервах личинок дрозофилы . 4 , 5 , 6 , 14 Этот экспериментальный метод был использован ранее для анализа временной последовательности событий, приводящих к нейродегенерации, а также для изучения транскрипционных изменений в телах клеток нейронов после повреждения. <...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить всех членов Лаборатории Келлера и Маги в Университете Куиннипак за полезные предложения. В частности, мы хотели бы поблагодарить Barron L. Lincoln II за разработку этого теста на рану в лаборатории Keller. Мы также хотели бы поблагодарить Куиннипакский университетский колледж искусств и науки «Грант-ин-Эйд», присужденный LC Keller.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Ножницы для микрорассеченияFine Science Tools15000-08
Dumont #3 ЩипцыFine Science Tools11231-30Некоторые люди предпочитают размер 3, в то время как другие предпочитают размер 5
Dumont #5 ЩипцыFine Science Tools11251-30Некоторые люди предпочитают размер 3, в то время как другие предпочитают размер 5
CO2 Air TankTech AirUN 1013Различные размеры баков можно приобрести
CO2 Аппарат для анестезииGenesee Scientific59-114
Штифты из нержавеющей стали, размер 0,1Fine Science Tools26002-10
SylGard 184 Силиконовый эластомер, основа и отвердительDow Corning3097358-1004Для заливки рассекающих пластин
Bouin's SolutionSigmaHT 10132-1LАнтитела должны быть проверены на их эффективность в Буэне и PFA
4% параформальдегида (PFA) в фосфатно-солевом буфере (PBS)AffymetrixFLY-8030-20Антитела должны быть проверены на их эффективность в
препарирующем стереомикроскопеAmScopeSM-1BZ
Источник светаAmScopeHL150-AY-220V
анти- nc82 антителаИсследования развития Hybridoma Banknc82-s
анти-диски большие антителаИсследования развития Hybridoma BankAF3
Alexa Fluor анти-хрен-пероксидазаJackson Immunoresearch123-545-021; 123-585-021; 123-605-021One can you Alexa Fluor® 488, 594 или 647
Flystuff Grape Juice Agar PremixGenesee Scientific47-102
Предметные стекла для микроскопаGenesee Scientific29-101
Стеклянные покровные стеклаFisher Scientific12-545-87
Thermo Scientific Nalgene Utility BoxFisher Scientific03-484CИспользуется для создания влажной камеры для восстановления личинок
Буина и PFA

Ссылки

  1. Bier, E. Drosophilia, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat. Rev. Genet. 6 (1), 9-23 (2005).
  2. Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).
  3. McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease. Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).
  4. Shin, J. E., Cho, Y., Beirowski, B., Milbrandt, J., Cavalli, V., DiAntonio, A. Dual leucine zipper kinase is required for retrograde injury signaling and axonal regeneration. Neuron. 74 (6), 1015-1022 (2012).
  5. Xiong, X., Wang, X., Ewanek, R., Bhat, P., Diantonio, A., Collins, C. A. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J Cell Biol. 191 (1), 211-223 (2010).
  6. Xiong, X., Collins, C. A. A conditioning lesion protects axons from degeneration via the Wallenda/DLK MAP kinase signaling cascade. J Neurosci. 32 (2), 610-615 (2012).
  7. Mishra, B., Ghannad-Rezaie, M., Li, J., Wang, X., Hao, Y., Ye, B., Chronis, N., Collins, C. A. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. J Vis Exp. (84), e50998(2014).
  8. Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. Dynactic is necessary for synapse stabilization. Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).
  9. Eaton, B. A., Davis, G. W. LIM Kinase1 controls synaptic stability downstream of the type II BMP receptor. Neuron. 47 (5), 695-708 (2005).
  10. Pielage, J., Fetter, R. D., Davis, G. W. Presynaptic spectrin is essential for synapse stabilization. Curr Biol. 15 (10), 918-928 (2005).
  11. Pielage, J., Cheng, L., Fetter, R. D., Carlton, P. M., Sedat, J. W., Davis, G. W. A presynaptic giant Ankyrin stabilizes the NMJ through regulation or presynaptic microtubules and transsynaptic cell adhesion. Neuron. 58 (2), 195-209 (2008).
  12. Massaro, C. M., Pielage, J., Davis, G. W. Molecular mechanisms that enhance synapse stability despite persistent disruption of the spectrin/ankryin/microtubule cytoskeleton. J Cell Biol. 187 (1), 101-117 (2009).
  13. Lincoln, B. L. 2nd, Alabsi, S. H., Frendo, N., Freund, R., Keller, L. C. Drosophila neuronal injury follows a temporal sequence of cellular events leading to degeneration at the neuromuscular junction. J Exp Neurosci. 9, Suppl 2. 1-9 (2015).
  14. Drosophila apple juice-agar plates. Cold Spring Harb Protoc. , (2011).
  15. Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ immunohistochemistry. J Vis Exp. (25), (2009).
  16. Smith, R., Taylor, J. P. Dissection and imaging of active zones in the Drosophila neuromuscular junction. J Vis Exp. (50), (2011).
  17. Jan, L., Jan, Y. Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. 79 (8), 2700-2704 (1982).
  18. Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X., Budnik, V. The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure. Neuron. 13 (4), 823-835 (1994).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

BrpDlgCO2
Методология простой нейронной механической травмы для изучения
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.