Методическая статья

Лаборатория протокол для генетических кишки содержание анализа водных макробеспозвоночных использование конкретных групп рДНК грунтовки

DOI:

10.3791/56132

⸱

5 октября 2017 г.

 , 
1Institute for Environmental Sciences, University of Koblenz-Landau, 2Institute of Integrated Natural Sciences, University of Koblenz-Landau, 3IV 2.5 (Trace Analysis, Artificial Pond and stream system), Federal Environment Agency

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наиболее распространенными кишки контент анализ мелководьях визуальные. Требующей интенсивных знаний о морфологическое разнообразие хищных организмов, они пропустите мягкой здоровых добычу и, из-за сильного измельчение хищных, почти невозможным для некоторых организмов, в том числе амфиподы. Мы предоставляем подробные, Роман генетических подходов для macroinvertebrate добычу идентификации в рационе амфиподы.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализ пищевых сетей имеет важное значение для более глубокого понимания экосистем. Например пищевой сети взаимодействия могут пройти серьезные изменения, вызванные вторжения неместных видов. Однако во многих случаях трудно точной идентификации поля хищник жертва взаимодействий. Часто эти анализы основаны на визуальная оценка содержимого кишечника или анализ соотношения стабильных изотопов (δ15N и δ13C). Такие методы требуют всесторонних знаний о, соответственно, морфологическая разнообразия или изотопном подпись от отдельных хищных организмов, ведущих к препятствий в точной идентификации хищных организмов. Визуальные кишки содержание анализа особенно недооценивать мягкой здоровых хищных организмов, потому что мацерации, проглатывание и пищеварение хищных организмов затрудняют выявление конкретных видов. Следовательно, полимеразная цепная реакция (ПЦР) на основе стратегий, например использование группы специфического праймера устанавливает, обеспечивают мощный инструмент для исследования пищевой сети взаимодействия. Здесь мы описываем подробные протоколы для расследования содержимое кишки macroinvertebrate потребителей от поля, используя наборы группа специфического праймера для ядерных рибосомных дезоксирибонуклеиновой кислоты (рДНК). ДНК может быть извлечено из всей образцов (в случае малых таксонов) или из содержимого кишечника образцов, собранных в поле. Присутствие и функциональной эффективности ДНК шаблонов необходимо подтвердить непосредственно из протестированных личности с использованием универсальная грунтовка задает ориентации соответствующих субъединицы ДНК. Мы также продемонстрировать, что потребляемая добычей могут быть определены, далее до уровня видов через PCR с неизмененной группа специфические праймеры в сочетании с последующей одиночной стренги конформации полиморфизм (SSCP) анализа с использованием полиакриламидных гелей. Кроме того мы показываем, что использование различных флуоресцентных красителей как этикетки позволяет параллельный скрининг для фрагментов ДНК различных хищных групп из нескольких образцов контента кишки через анализ автоматизированной фрагмент.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хищник жертва взаимодействий, которые составляют большинство трофических взаимодействий и пищевой сети динамики, являются ключевыми для характеристики потоков материи и энергии в пищевых цепях внутри и между экосистемы, которая является одной из основных целей экологии 1. Определение источника и потоков углерода и питательных веществ углубление понимания экологических связи между экосистем2. Однако экосистем, таких как реки и их водосборных бассейнов, связаны не только потоков органического вещества и питательных веществ, но и движениями организмов3. Таким образом изменения среды обитания, прерывания потока ресурсов, которые связывают этих систем может сильно изменить пищевых цепях как экосистем, не только непосредственно, но также косвенно, изменяя состав соответствующих общин хищник жертва. Например изменения трофических было показано, быть связаны с движениями хищника одного вида (например, радужная форель)4. Такие изменения потенциально угрожает биоразнообразию и функционирование водных экосистем. Таким образом анализируя хищник жертва взаимодействия в области важно определить воздействие антропогенных изменений окружающей среды, например практики водопользования, на родной биоразнообразия водных экосистем.

Поскольку отслеживание трофических связей является сложным в сложных системах, несколько подходов были созданы, которые позволяют оценку кормления взаимодействий в поле5. Традиционно исследования взаимодействия в области кормления основаны на визуальной идентификации останков добычу в расчлененных кишки и требуют обширные знания о разнообразии морфологической добычу. Визуальные кишки содержание анализа оказали идеи использования ресурсов нескольких групп потребителей (например, сезонные изменения в диете омаров6 и рыбы7,8 или кормления предпочтений копепод). Однако физический процесс пищеварения затрудняет анализ содержания визуальные кишки и обычно пропускает мягкой здоровых хищных организмов9. Для видов кормления при попадании жидкости или некоторых беспозвоночных потребителей, которые интенсивно измельчения их пищи до приема пищи, как амфиподы визуальная идентификация хищников в кишечнике содержимое является невозможным10. Из-за этих ограничений молекулярный анализ обеспечивает перспективные альтернативы.

Молекулярный анализ теперь стали общий инструмент, позволяющий добычу быстрого и точного обнаружения в кишечнике содержимое. Спектр таких методов разнообразен: стратегии, основанные на полимеразной цепной реакции (ПЦР) или моноклональные антитела часто используются, из-за их высокой чувствительности и специфичности11. Развитие новых моноклональных антител требует больших затрат времени и стоимости, поэтому, применение других методов молекулярной более полезным, когда антитела уже не существуют11. Другой распространенный подход является усиление регионов дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), как в большинстве видов, используя универсальный грунт генов рибосомной рибонуклеиновой кислоты (РНК) устанавливает12,13. При использовании этого метода, это часто не позволяет выявить целый ряд хищных организмов в рамках смешанных источников ДНК14. Эффективный подход к избежать такой недостаток — использовать группы специфического праймера наборы для анализа генетических кишки содержание. Предназначен для усиления только ДНК регионах конкретных целевых групп и исключения всех других видов15,16, Группа специфические праймеры позволяют идентификацию хищных организмов на таксономический уровень указанных групп без вторичный анализ требует больших затрат времени и стоимости. Однако как все кишки контент-анализ, такой анализ предоставляют только снимок кормления поведение. Таким образом сочетая молекулярной кишки содержание анализа с анализом времени интеграция естественных Трейсеры (например, стабильные изотопы) считается полезным1,2.

Здесь мы описываем подробный метод для проведения расследований на основе ПЦР хищник жертва взаимодействий с использованием наборов группа специфического праймера для ядерных рибосомной ДНК (рДНК) регионов сочетаться с анализом стабильного изотопа же образца. Мы описываем обнаружение ДНК одного хищных групп через электрофорез геля агарозы. Кроме того мы представляем возможность для дальнейшего течению анализ продуктов ПЦР из таких групп специфические праймеры применимых всякий раз, когда требуется высокий таксономический разрешение чем специфика грунтовки. Потому что один мель ДНК (ssDNA) фрагменты формы третичного конформации, которые определяются их первичной последовательности17, небольшие вариации в фрагментах усиливаются такие группы специфические праймеры привести к конформационные изменения. Такие изменения могут быть обнаружены анализами полиморфизм (SSCP) конформации одиночной стренги полиакриламидных гелей17,18, что позволяет более точное определение хищных организмов (вплоть до уровня видов).

В то время как электрофорез геля агарозы является общим и недорогой инструмент для визуализации фрагментов ДНК и определить их Приблизительная длина19резолюции зависит количество ДНК и окрашивание красителем используется20. Обычно визуализация это прямо вперед, при работе с чистой образцов ДНК, но потенциально низкое количество хищных ДНК в кишечнике содержимое потребителей может осложнить скоринга результаты электрофореза геля агарозы. Тем не менее, этот метод обнаружения осуществима на экране низкое количество потребителей образцов из поля для одного или несколько охотятся группами, но осложнение в скоринга делает скрининг большое количество образцов для нескольких добычу таксонов чрезвычайно время интенсивных и таким образом неосуществимой. Более чувствительным методом обнаружения является автоматизированный анализ фрагментов через капиллярного электрофореза, который дополнительно позволяет определить точную длину фрагментов21. Несколько микроспутника на основе исследования показали, что с помощью различных флуоресцентных красителей как этикетки, это можно обнаружить и определить различные фрагменты сопоставимых длины путем автоматического фрагмента анализ22,23, 24. Таким образом мы также представить подробный протокол для параллельных обнаружение ДНК из нескольких добычей групп с помощью ПЦР с метками группа специфического праймера наборы и обнаружения через анализ автоматизированной фрагмент с автоматизированной программы sequencer. Кроме того мы представляем результаты тематического исследования, показывающие, что обнаружение ДНК добычу через анализ автоматизированной фрагмент является подход, который позволяет также относительное количественная оценка попадает хищных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. собирать мелководьях от области и подготовить образцы для анализа содержания генетических Gut.

Мелководьях
  1. собрать на каждом сайте, разобраться особей видов потребительского интереса в одной пробирки и заморозить их непосредственно в жидкого азота или сухого льда для предотвращения кишки и деградации ДНК.
    Примечание: Избегайте хранения образцов в спирте, потому что некоторые мелководьях склонны извергнуть перед алкоголь убивает их.
  2. Использовать только желудочно кишечного тракта, средних и больших (приблизительно > 3 мм) macroinvertebrate видов для анализа содержания генетических кишечник так оставшийся вопрос образца могут быть использованы для других процедур (например, стабильный изотоп анализ). Обратите внимание, что это не применимо при расследовании очень маленькие таксонов как водных клещей. Таким образом, можно пропустить шаги 1.2.1 и 1.2.2.
    1. Слегка размораживание индивидуума и тщательно анализировать его желудочно кишечного тракта под стереомикроскопом, используя пинцет тонкой из нержавеющей стали. Убедитесь, что не протыкайте желудочно кишечного тракта, чтобы избежать потери материи.
    2. Чистые пинцет с помощью решения очистки для удаления загрязнений ДНК и РНК после подготовки каждой желудочно кишечного тракта. Таким образом Инкубируйте щипцы для 10 минут в растворе обеззараживания. Затем промыть стерильной водой для удаления остаточных следов и протереть безворсовой салфеткой.
    3. Передачи расчлененных желудочно-кишечного тракта к реакции Сейф Блокировка 2,0 мл трубки содержащих 440 мкл (450 мкл возможности для использования повторяющихся пипеткой) добыча соли буфера [SEB; 0,4 М хлорид натрия (NaCl), 10 мм (гидроксиметил) трис-aminomethane гидрохлорид (Tris-HCl) pH 8.0 и 2 мм этилендиаминтетрауксусная динатриевая соль дигидрат (ЭДТА) рН 8,0]. Подготовлены образцы в магазине − 20 ° C сразу до экстракции ДНК. Убедитесь, что в течение нескольких дней будут извлечены ДНК.
  3. Использовать измененные высоким соли извлечения протокол 25 для извлечения ДНК.
    1. Взять образцы из морозильника. Использовать щипцы для добавления один шарик нержавеющей стали 5 мм в каждую пробирку образца и оставить на скамейке при комнатной температуре (RT) таять замороженных образцов. Используйте бисерная мельница для гомогенизации образцов за 1 мин 15 Гц.
    2. Спина вниз образцы с краткосрочной перспективе центрифуги. Использование пипетки микролитр для добавления 90 мкл (100 мкл для использования повторяющихся пипеткой) 10% натрия Додециловый сульфат раствор (СДП) и 5 мкл 10 мг/мл протеиназы K.
    3. Водоворот образцы тщательно и инкубировать смеси за 1 ч, при 60 ° C с постоянной тряски на 400 об/мин на thermomixer. Кроме того, тщательно вихревой образцов каждые 10 мин для дальнейшего содействия лизис.
    4. Спин вниз образцы с краткосрочной перспективе центрифуги, мкл 350 5 М NaCl с микролитр пипетки и вихревой тщательно для примерно 0,5 - 1 мин центрифуги образцов для 40 мин на 16200 x g на 5 ° C.
      Примечание: Если несколько наборов в строке должны быть сделаны, температуру центрифуги должен быть слегка приподняты (не выше 10 ° C), потому что SDS, как правило, flocculate если температура слишком низка.
    5. Использование микролитр пипетки для передачи примерно 600 мкл супернатант в новой трубки реакции 1,5 мл. Будьте осторожны, чтобы не удалить что-нибудь из гранул.
    6. Наконечник из нержавеющей стали бусы из трубы реакции в стрейнера чая нержавеющей стали, очистить их проточной водой и инкубировать их в чашке Петри с решением дезактивации для 10 минут тщательно смойте обеззараживания решение с стерильных вода и хранить очищенную бусины в этаноле (> 99%, п.а. класс) или сухой до повторного.
      Примечание: Очистка из бисера не нужно быть сделано непосредственно в этот шаг, но скорее может быть сделано, когда есть время ожидания в следующих шагах.
    7. Добавить 600 мкл ледяной изопропиловый спирт (п.а. класс) в надосадке с микролитр Пипетка и осторожно перевернуть трубку пару раз. Хранить образцы ночь в -20 ° с.
    8. Взять образцы из морозильника и центрифуги их за 20 минут, превышающего 16.200 × g и комнатной температуре. Тщательно удалить супернатант и сухой трубку осторожно с безворсовую салфетку. Обратите внимание, что если окружающий температура высокая (более 25 ° C), центрифуги на 5 ° C, чтобы избежать скольжения во время выброса супернатант гранулы.
    9. Мыть гранул содержащий ДНК с 70% этиловом спирте. Чтобы сделать это, добавьте 200 мкл ледяной этанола (70%, п.а. класс) с помощью пипетки микролитр и центрифуги образцы для 10 мин на 16 200 x g и комнатной температуры (или 5 ° C, если это необходимо). Тщательно удалить супернатант и сухой трубку осторожно с безворсовую салфетку. Использование пипетки 10 мкл скорректирована с приблизительно 8 мкл для тщательно Пипетка от оставшихся супернатант. Убедитесь в том, чтобы не мешать гранулы.
    10. Сухие гранулы примерно 5-20 мин при 60 ° C или при комнатной температуре на скамейке, до тех пор, пока все этанола выпаривается.
    11. Гранул растворяют в 50-100 мкл нуклеиназы бесплатно (паровой стерилизации и лечить DEPC) вода (ddH 2 O), ждать по крайней мере 1 h (хотя лучше результаты будут получены на ночь при 4 ° C).
    12. Измерить количество ДНК, содержащихся в каждой пробе с микро объем спектрофотометр, по словам производителя ' s инструкции. Сделать рабочий разбавления каждого образца, содержащий около 2-10 нг ДНК / мкл. Держите Стоковый раствор в холодильнике. Сохранить рабочий раствор в холодильнике и убедитесь, что дальнейшие примеры обработка выполняется вскоре.

2. Проверьте работоспособность ДНК-экстрактов для последующего обнаружения недавно попадает хищных.

  1. Для обеспечения присутствия и функциональной эффективности шаблонов, проверить каждый ДНК экстракт (шаги 1.1 для 1.3.11) используя универсальный грунт устанавливает подходящий для источника соответствующих пищи (например, беспозвоночных 16 , 26) который ориентируетесь же ядерного Субблок как группа специфического праймера, используется для последующего обнаружения добычу 25 , 27. Следующие действия ссылаются на использование универсальная грунтовка наборы NSF1419/20 и NSR1642/16 16 и ЛГУ D1, D2 fw1 и LSU D1, D2 rev2 или LSU D1, D2 rev4 26. Чтобы доказать, что реакция PCR был успешным и что загрязнения не произошло, используйте позитивный элемент управления, содержащий ДНК, которые уже были усилены в успешно и образец один элемент управления, содержащий ddH 2 O вместо ДНК внутри каждой ПЦР запустить.
    1. Подготовить грунт работающие решения, которые содержат конечная концентрация 10 мкм праймера, Пипетка соответствующее количество соответствующих грунтовка акций решения и ddH 2 O (в зависимости от концентрации Стоковый раствор) в свежий 1,5 мл трубки реакции с использованием micropipettes.
    2. Добавить грунты, deoxynucleotide смесь (дНТФ), реакция буфера, Taq ДНК полимеразы и ddH 2 O 1,5 или 2.0 мл (в зависимости от количества образцов, чтобы быть обработаны) реакции трубки, то вихря этой смеси. В таблице 1 приведены подробные тома для стандартного реакционной смеси для реакции PCR 10 мкл (более подробную информацию о химических веществ, используемых, см Таблицу материалы).
    3. Использование микролитр пипетки для передачи каждого 1 мкл ДНК распакуйте в 9 мкл the Стандартный реакционную смесь в ПЦР-пробирку (или хорошо ПЦР плиты). Закрыть трубу реакции или реакции скважин пластины (с полосами Кап).
    4. Программа Термоциклер: стандартный протокол для NSF1419/20 и NSR1642/16 16 грунтовка набора: 94 ° C 4 мин (денатурация), следуют 30 циклов 94 ° C за 30 s, 50 ° C (температура отжига) для 30 сек, 72 ° C 90 s, и окончательное расширение при 72 ° C для 10 мин. Для грунтовки LSU задает 26, используйте следующие: 94 ° C для 4 мин, после чего 45 циклов 94 ° C для 20 s, 52.5 ° C 20 s, 72 ° C для 90 s и окончательное расширение при 72 ° C для 8 мин
    5. Место ПЦР трубы или пластин в Термоциклер, закройте крышку велосипедист и запустить программу соответствующих.
    6. Подготовка 1,5% агарозном гель с помощью буферного раствора, содержащего Tris база, борная кислота и ЭДТА (КЭ буфера) и агарозы. Для приготовления геля агарозы 1,5%, с помощью литья каппу с габаритными размерами 10 × 7,5 см × 3 см весом 0,45 g агарозы в коническую колбу, используйте Измерительный цилиндр для измерения 30 mL 1 x TBE буфера (89 мм трис pH 7,6, борная кислота 89 мм и 2 мм ЭДТА, pH 8.0) и залить его в коническую колбу. Нагрейте смесь с помощью микроволновой печью. Остановить СВЧ, когда есть большие воздушные пузыри и тщательно вихрем колбу до тех пор, пока решение имеет только одну фазу.
    7. Для охлаждения решение для приблизительно 60 ° C, вихрем колбу на водяной бане. Быстро Залейте раствор в каппу литья, удалить пузырьки воздуха и вставьте Расчески. Подождите около 20 мин, пока гель ожесточилось.
    8. Заполнения электрофорез блок с 0,5 х кэ и вставить литья каппу содержащие геля агарозы. Убедитесь, что гель слоты бесплатно воздушных пузырьков.
    9. Спина вниз продукты PCR, с помощью параметра запуска короткие центрифуги мини (Латы). Использование пипетки микролитр смешать каждый 3 мкл продукта PCR с 1 мкл 6 x загрузки краситель (40% сахарозы и 0,25% бромфеноловый синий) и загрузить его в гель пазы геля агарозы. Пипетка 1.5 µL 100 лестница ДНК bp в один слот каждой строки с пипеткой микролитр как стандартный размер. Замените крышку блока электрофорез правильно и подключены к источнику питания. Побегите гель на 100 V/см для 35 мин
    10. Подготовить окрашивание баня, залить 1000 мл 1 x TBE в квадратной формы пластиковой коробке пропускающих свет. Добавьте 50 мкл бромид ethidium с пипеткой микролитр, закройте крышку пластиковой коробке и встряхните его для обеспечения равного распределения бромид ethidium.
    11. Снимите с блока электрофореза геля и поместите его в окрашивание ванну для примерно 10 мин. Затем, принимать гель из окрашивание ванны и поместить его на гель системы документации и визуализировать его в соответствии с руководством.
    12. Анализ только образцы, которые показали положительные результаты (фрагменты адекватного размера визуальные в агарозном геле) с точки зрения присутствия и функциональной эффективности шаблонов для последующего обнаружения недавно попадает хищных.
< t d > 0,25 мкл
ПЦР-миксконцентрация рабочего растворасмесь для 10 реакции PCR мклконечная концентрация в PCR
Грунтовка FW10 мкм0,5 мкл0,5 мкм
Грунтовка RW10 мкм0.5 & #956 ; l0,5 мкм
реакции буфера (20 мм трис-HCl, рН 8.55, 16 мм (NH4) 2SO4 и окончательный концентрацию MgCl2 2 мм)1 мкм1 мкл1 мкм
dNTP10 мм0,25 мм
полимеразы Taq5 U0.1 мкл0,05 U
ddH 2 06.65 мкл
< Стро нг > общий объем реакционной смеси9 мкл
ДНК1 мкл

Таблица 1: подробный протокол для подготовки стандартных реакционной смеси реакции PCR 10 мкл.

3. обнаружить недавно попадает добычу/продовольственные товары с группой специфического праймера наборов с помощью электрофореза геля.

  1. Проведения ПЦР с помощью рабочего раствора ДНК экстракты (подготовлен согласно шаги 1.1 для 1.3.11) и группа специфического праймера набор (без названия, т.е. без изменений) для группы добычу, ориентированные как описано в меры 2.1.1 для 2.1.3 (вариации в реакционной смеси для набора соответствующих грунт, см. таблицу 2). Запуск ПЦР, используя стандартный протокол в шаге 2.1.4 (для отжига температура для набора соответствующих грунт, см. таблицу 2).
    1. Использовать один элемент управления с чистой ДНК от образца, принадлежащих соответствующей целевой группы (положительный контроль) и один отрицательный контроль с чистой ДНК от потребительских видов в каждом ПЦР запустить.
  2. Проверить успеха с помощью геля агарозы описано в шагах 2.1.6 в 2.1.11 реакции PCR. Реакция PCR был успешным, если фрагмент соответствующей длины (см. таблицу 2) является видимым для позитивного управления, но не для отрицательного контроля. Если один или оба из этих критериев невыполненными, повторите ПЦР.
  3. Применения агарозы гель электрофореза, как описано в шагах 2.1.6 в 2.1.11, чтобы обнаружить ли целевые группы добычу была потребляется образцов различных потребителей, тестирование (через решение фрагмент соответствующей длины виден ли или нет). Убедитесь в том, чтобы не пропустить фрагменты с низким разрешением визуальных.
  4. Продукты PCR хранить при 4 ° C, если дальнейшие анализы будет осуществляться в течение последующих 24 часов, или в-20 ° C, если анализы должны быть выполнены позже.

4. Впоследствии определить потребляемых добычу, далее вниз по течению с помощью SSCP-анализа через гель полиакриламида.

  1. Подготовиться SSCP электрофореза геля акриламида 9%. Подготовить рабочие решения в лаборатории Худ.
    1. Подготовить рабочий раствор акриламида 200 мл, заполнить Измерительный цилиндр с 20 мл 10 x TBE (109 g Tris база, 55 г борной кислоты и 40 мл 0,50 М ЭДТА, рН 8,0 растворяют в 1000 мл ddH 2 O) и еще один с 45 мл 40% (29: 1) Акриламид микс. Вылить смесь КЭ и акриламида в градуированный колбу (градуированный стеклянный флакон с отметкой 200 мл подходит также здесь) и добавить ddH 2 O до отметки в 200 мл. Продолжать работе решение в холодильнике (4 ° C), пока он не понадобится. Не используйте рабочий раствор старше, чем одну неделю.
    2. Вес 0,1 г Персульфат аммония (APS; использование баланс с точностью по крайней мере 0,01 g) в 1 мл объемные колбу и растворяют его, добавив ddH 2 O до окончания Марк подготовить APS раствор 10%. Перевести аликвоты (примерно 350 мкл) в свежих реакции трубы.
      Примечание: Один Алиготе необходима для каждого геля полиакриламида. Храните остальные aliquOTS-20 ° c и только разморозить аликвоты, незадолго до того, как они необходимы.
    3. Сборка гель кассету скомпрометирована из двух стеклянных пластин, один пробел и один зубчатый стеклянной пластины (каждый 20 см х 20 см), с прокладками (толщина 1,5 мм) между ними подбегая стороны стекла. Использовать каждый три раза обратно клипы (32 мм) с правой и левой стороны для фиксировать гель кассеты ( рис. 1).
    4. Смесь 5 g агарозы и 250 мл 1 x TBE буфера в коническую колбу для подготовки решения к 2% агарозном гель. Тепло и потом охладить смесь, как описано в шагах 2.1.6 и 2.1.7. Быстро Залейте раствор в пластиковой коробке, квадратной формы (21 см х 6,5 см х 5 см) и поместите нижний конец гель кассеты (шаг 4.1.3) в раствор агарозы. Отрегулируйте клипы фолд обратно на нижнем конце геля кассеты на высоту таким образом, чтобы они сидят на ободе квадратной формы пластиковые окна ( рис. 1). Подождите примерно 20-30 мин до тех пор, пока вилка агарозы полностью затвердеет.
    5. Заполнить 100 мл Измерительный цилиндр с рабочий раствор акриламида (шаг 4.1.1) до отметки 60 мл и залейте раствор в стакан. Используйте микропипеткой 300 мкл одной Алиготе APS Стоковый раствор (шаг 4.1.2) и впоследствии 37,5 мкл tetramethylethylenediamine (TEMED). Быстро Залейте раствор между пластинами стекла кассеты геля. В качестве альтернативы внедрить решение между пластинами стекла с 100 мл одноразовые шприц с кончиком пипетки 1000 мкл скорректирована с головкой инъекционной шприца.
    6. Осторожно вставить 1,5 мм толщиной стандартного гребня на верхнем конце между пластинами стекла. Гребень должна быть окружена раствор полиакриламида. Подождите примерно 1 h, пока гель полиакриламида полимеризуется. Избегайте вентиляции во время полимеризации, насколько это возможно, потому что это увеличивает время, необходимое для геля для полимеризации.
      Примечание: Это возможно для хранения литые гели в запечатанных полиэтиленовых пакетах с мокрой ткани в холодильнике до 3 дней.

figure-protocol-1
Рисунок 1: рисунок иллюстрирует Строительство налить полиакриламидных гелей. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

  1. место кассеты гель, содержащий геля полиакриламида, подготовленный, в блок вертикального электрофореза. Заполнения блока электрофорез с соответствующей суммы (в зависимости от типа блока электрофорез) 0,5 х кэ и прохладный блок до 10 ° C, с помощью холодильных термостат.
  2. Для денатурации ДНК, разогреть тепловой блок /-cycler к 96 ° C. Prepare денатурации буфер с 95% формамида (класс 99,5% годовых) и 5% водный раствор, содержащий 0,25% бромфеноловый синий и 40% (w/v) сахарозы.
  3. Взять ПЦР продукты из холодильника или морозильника и размораживать их. Спин вниз продукты PCR, с помощью параметра запуска короткие центрифуги мини (Латы). Затем смешайте каждый 4 мкл продукта ПЦР с 4 мкл буфера денатурации. Тепло смеси для 5 мин на 96 ° C, сразу же после охлаждения шаг в ледяной воде 10 мин
    Примечание: Образцы должны быть загружены на геле полиакриламида (шаг 4.5) сразу же после этого.
  4. Удаления гребень из геля полиакриламида (шаг 4.1.6) и использовать микропипеткой полностью загрузки каждого образца в слот гель. Электрофорез на 8 W на гель во время выполнения постоянно охлаждения электрофорез до 10 ° C. работает время зависит от размера фрагмента должны быть разделены. Для размеров фрагмента приблизительно 210 bp, продолжительность около 3,5 ч считается уместным.
  5. Подготовить окрашивание баня, залить 1000 мл 1 x TBE в квадратной формы пластиковые коробки пропускающих свет и 30 мкл пятнать краситель (подходит пятно один мель ДНК) с микролитр пипетки. Закройте крышку пластиковой коробке и встряхните его для обеспечения равного распределения окрашивание красителем.
  6. Удалить гель кассеты из камеры для электрофореза и осторожно отделить зубчатый стеклянную пластину от геля. Слайд гель полиакриламида с пустую стеклянную пластину в окрашивание ванну. Место окрашивание ванна на тряску платформы и пятно гель для 20-30 мин при постоянном встряхивании.
  7. Принимать гель тщательно из окрашивание ванны и поместить его на таблице УФ системы документации.
    Примечание: Из-за нестабильности геля рекомендуется для обработки предварительного шага с двумя людьми. Один человек должен провести окрашивание ванна рядом с таблицей УФ и еще один должен достичь под гелем с обеими руками, взять его и вставьте таблицу УФ.
  8. Закройте крышку или двери системы документации и сфотографировать согласно данным производителя ' инструкция по эксплуатации s.

5. Обнаружение нескольких недавно проглотить добычу групп параллельно с использованием автоматизированных фрагмент анализа.

  1. Анализ, кишечнике содержание ДНК экстрактов с помощью 16 Группа специфического праймера задает приведенных в таблице 2, грунтом одного набора помечены благодаря модификации с окрашивание красителем (см. таблицу 2 колонку под названием модификации) и использовать методы параллельного обнаружения автоматизированный секвенсора.
    1. Использования рабочего раствора ДНК экстрактов (подготовлен согласно шаги 1.1 для 1.3.11) и поведения отдельных PCRs для каждого праймера, набор как описано в шагах 2.1.1 до 2.1.5 (вариации в смеси приведены в таблице 2). Используйте по крайней мере один элемент управления с чистой ДНК от образца, принадлежащих соответствующей целевой группы (положительный контроль) и один отрицательный контроль с чистой ДНК от потребительских видов в каждом ПЦР запустить.
    2. Запуска ГКДЗ в Термоциклер, используя стандартный протокол постановки ПЦР в шаге 2.1.4, скорректированы до соответствующей температуры отжига (и количество циклов) для каждого праймера, набор приведенных в таблице 2.
      Примечание: Используйте же выделение ДНК реакции скважин для ПЦР с каждым из 16 различных грунтовка наборов для упрощения последующего объединения продуктов ПЦР для пакетной автоматизированного анализа фрагмента.
    3. Магазин ПЦР продукты при-20 ° C до всех PCRs, принадлежащие к одной партии, для автоматического фрагмента анализов (см. таблицу 2) закончены. Храните продукты PCR в темноте и не хранить их больше, чем за 1 неделю до анализа фрагмента.

figure-protocol-2
Таблица 2: детали 2 партий 15 пар группа специфического праймера установленные костер и др. (2013 год) и недавно разработанных Jae28S грунт пара усилительных регионах 18S или 28S рДНК от 16 целевых групп водных макробеспозвоночных. f, вперед грунты; r, обратный грунты; 18s, грунтовка цели 18S рДНК Субблок; 28s, грунтовка цели 28S Субблок рДНК. " Hydrobiologia, является Dikerogammarus villosus (ракообразные, Gammaridae) ' убийца креветки ' в системе реки Рейн?, 768, 2016, таблица S1, дополнительный материал страница 2, Кестер майке, Бастиан Байер, Рене Gergs, (© Спрингер Международные публикации Швейцария 2015) " с разрешения Springer. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой таблицы.

  1. для обнаружения усиливается фрагменты всех 16 грунтовка наборов провести анализ автоматизированной фрагмент в 2 пакетах, приведены в таблице 2. Используйте стандарт внутреннего размера (ДНК размер стандартный набор - 400 [партии B] и - 600 [пакет A], соответственно) чтобы определить длину фрагмента. Подготовьте последовательности пластины и автоматические программы sequencer, как описано в следующих шагах. Обратите внимание, что эта процедура может должны быть скорректированы, если используете другую платформу, чем в таблице материалы.
    1. Для выполнения каждого пакета образца, подготовить смесь, содержащая образец загрузки решения (SLS) и соответствующие стандартные размер. Пипетка 21.6 мкл SLS и 0.4 мкл ДНК размер стандартного комплекта - 600 за образец пакета A и, соответственно, 21,7 мкл SLS и 0,3 мкл ДНК размер стандартного комплекта- 400 в образец пакетного б.
    2. Взять продукты PCR 8 ГКДЗ, принадлежащих соответствующей партии из морозильника и размораживать их. Убедитесь, что они по-прежнему находятся в темноте.
    3. Использовать микролитр пипетки для загрузки количество скважин последовательности плиты необходимо (количество образцов для анализа) с каждой 22 мкл соответствующие смеси, описано в пункте 5.2.1. Спин вниз продукты PCR каждого из 8 PCRs, с помощью параметра запуска короткие центрифуги мини (Латы). Перевести каждый 1 мкл каждого продукта PCR каждого из 8 ГКДЗ в соответствующих скважин последовательности пластины с пипеткой микролитр.
    4. Тщательно спин вниз эту смесь в пределах последовательности пластины с краткосрочной перспективе мини-плита центрифуги и наложения каждого из скважин, используется с одной капли минерального масла. Заполнить соответствующие реакции скважин буфера плиты с 250-300 мкл буфера разделение ДНК.
    5. Использовать программное обеспечение для капиллярной sequencer для создания установки образца, по словам производителя ' s инструкции. Назначьте методы для управления комплектов образцов и определить последовательность методов, которые будут использоваться для обработки данных (см. таблицу 3 для выполнения условий для использования с размер стандарт, приведены в Таблице материалов). Обратите внимание, что это важно, что распределение образцов в пределах установки образца соответствует распределения выборки в последовательности пластины (включая позитивные и негативные элементы, см. шаг 5.1.1) и что метод достаточное для фрагмента анализирует с соответствующими Стандартный размер выбирается.
    6. Заполнить лоток смачивание с дейонизированной водой и вставьте капиллярную sequencer последовательности пластины, буфер пластины и смачивания лоток. Вставьте картридж гель, содержащий достаточное количество свежей гель разделение ДНК, которая необходима для запуска образца. Запуск последовательности пластину, используя подготовленный установки образца.
денатурировать отдельные Капиллярный придать
Температурынапряжениявремявремянапряжениявремя
Размер стандартного 60090 ° C120 s4.8 кв60 мин50 ° C ждать Temp: Да2.0 кв30 s
Размер стандартного 40090 ° C120 s6 кв45 мин50 ° C ждать Temp: Да2.0 кв30 s

Таблица 3: особые условия для анализа фрагмента по автоматизированной секвенсор, с помощью стандартов размера, дано в таблице материалы.

  1. для анализа результатов экспорта необработанных данных и загрузить эти данные в программу анализа фрагмента. Выберите Стандартная краска цвета заказы соответствующих производителя краска цвета каналы.
    1. Создать группу изложением ожидаемый диапазон длин фрагмента, усиливается одной группы специфического праймера устанавливает в пакете согласно руководству пользователя программы.
    2. Для обработки данных, выберите соответствующие группы, соответствующий размер стандарт, Стандартный цвет и тип анализа и запустите процедуру. Выберите параметр electropherogram для отображения интенсивностью флуоресцентного сигнала от капиллярного электрофореза инструментов как одну строку трассировки для каждого цвета краски. Наборы маркеров/грунтовка будет отображаться указанием диапазона соответствующих фрагмент и точная длина обнаруженных фрагмент, связанный с центром каждого называется пик будет выделена (в большинстве программ по окраске или имя, назначенное) автоматически.
    3. Для каждого образца, рассчитать как близко образца ' s внутренний размер стандарт соответствует стандарту выбранный размер успокоить успех размер призвание. Большинство программ анализа фрагмента имеют возможность автоматически вычислить и визуализировать этот матч. Если размер призвание не удалось, повторите анализ фрагмента для этих образцов.
    4. Визуально проверьте electropherogram каждого образца и подтвердить/unconfirm каждый пик под названием для каждого маркера/грунтовки, установить отдельно. Вручную вставьте невызываемый пики, которые соответствуют критериям набора маркеров/грунтовка или удалять неправильно согласно руководству пользователя программы используется. Применить имя размер или bin базы пара в ' аллеля лейбл '. Вычисление и отображение пик спецификации в ' таблицы пик '.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы успешно использовать шаги, описанные в этом протоколе для диеты анализов в рамках различных исследований. В этом разделе мы представляем примеры, описывающие применимость различных разделов протокола.

Как пример чтобы продемонстрировать эффективность группы специфического праймера наборов, созданных авторами28 и потенциал дальнейшего течению анализ продуктов ПЦР по SSCP-анализа, кормления эксперимент б...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем легко и экономически эффективным методом для определения на основе ПЦР хищник жертва взаимодействий от образцов поле через группу специфические праймеры для рДНК регионов, которые могут быть объединены с другими не молекулярный анализ образцов же. Однако есть несколько важных шагов в рамках протокола. Во-первых обеспечивая специфики праймеры используются имеет важное значение. Во-вторых важно избежать загрязнения и потери кишки содержание материала в процессе подготовки желудочно кишечного тракта и ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Silke Классен из научно-исследовательского института для анализа экосистем и оценки (gaiac), RWTH Aachen за ее помощь в создании группы специфического праймера наборы, используемые в настоящем Протоколе. Мы также благодарим Питера Мартина и Лаура Schynawa из университета Kiel для сотрудничества в экспериментах водных клещей. Мы также благодарим технической лаборанты для поддержания лаборатории работает плавно и подготовка реестра компаний и каталожные номера. Эта работа была поддержана немецкого фонда научных исследований (DFG; проект GE 2219/3-1).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
жидкий азотAnyNAДля транспортировки полевых проб макробеспозвоночных в лабораторию.
Реакционные пробирки объемом 1,5 мл - SafelockAnyNAДля сбора потребительских образцов в полевых условиях и последующей консервации в жидком азоте реакционные пробирки не обязательно должны быть чистыми ПЦР. Чтобы избежать взрыва трубок, крышку трубок следует проколоть иглой.
СтереомикроскоплюбойНАУбедитесь, что увеличение подходит для приготовления желудочно-кишечного тракта размера интересующего потребителя.
ЧашкиПетри ЛюбойНАДля вскрытия желудочно-кишечного тракта потребительских образцов под стереомикроскопом.
Фоцепсы из нержавеющей стали: щипцы Dumont No. 7BioformB40dЭти изогнутые щипцы из нержавеющей стали иногда могут быть очень удобными, чтобы удерживать образец, зафиксированный между искривленной частью, не прокалывая желудочно-кишечный тракт.
Фоцепсы из нержавеющей стали: Щипцы Dumont Electronic No5BioformB40bЭти тонкие щипцы из нержавеющей стали идеально подходят для подготовки желудочно-кишечного тракта потребительских образцов.
DNA-ExitusPlusAppliChemA7409,1000RFРаствор для обеззараживания от загрязнений ДНК и РНК
бумажное полотенце без пушкаЛюбыеNA
LabЛюбаяNAдолжна быть не менее 0,01 г.
Микролитровые пипетки (0,5-10/10-100/50-200/100-1000; L)ЛюбыеNA
Safe-Lock 2,0 млVWR211-2165Крайне важно, чтобы эти пробирки не содержали ДНК, ДНКазы, РНКазы и ингибиторов ПЦР (ПЦР чистые)!
Пробирки с безопасным замком 1,5 млVWR211-2164Крайне важно, чтобы эти пробирки не содержали ДНК, ДНКазы, РНКазы и ингибиторов ПЦР (ПЦР чистые)!
Хлорид натрия ≥ 99,5%, p.a., ACS, ISOcarlroth3957.3Для экстракции соли требуется буфер (SEB) и 5М раствор NaCl, необходимый для экстракции ДНК.
Трис(гидроксиметил)-аминометан Triscarlroth4855.2Для буфера экстракции соли (SEB) и буфера TBE
Микролитровые пипетки (0,5-10/10-100/50-200/100-1000; L)carlroth8043.1Для буфера экстракции соли (SEB) и буфера TBE
Борная кислота ≥ 99,8 % в год, ACS, ISOcarlroth6943.2Для буфера TBE. Не нужен, если получен коммерчески доступный буфер TBE.
Додецилсульфат натрия (SDS)carlroth4360.1Для экстракции ДНК-протеиназы
К-лиофиль.carlroth7528.1Приготовьте рабочий раствор, содержащий 10 мг/мл.
TissueLyser IIQuiagen85300Бисерная мельница для гомогенизации образцов.
Бусины из нержавеющей стали, 5 ммQuiagen69989Для гомогенизации образцов.
Нагревательный термошейкерЛюбойвихревой
Любая
рефрижераторная центрифуга NA: himac CT 15 REHitachiNAОхлаждаемая центрифуга, используемая для центрифугирования во время экстракции ДНК (Протокол 1).
Изопропанолкарлрот6752,5
этанол 99,8 % в годЛюбаявода NA
Молекулярная биология класса (ddH2O)AppliChemA7398,1000нуклеазная вода (стерилизованная потоком и обработанная DEPC) используется для повторного суспензирования ДНК и всякий раз, когда упоминается ddH2O в рукописи
Немодифицированные олегонуклеотидыEurofins MWG OperonNA Праймеры немеченые
модифицированные олегонуклеотидыMetabion International AGNA Праймеры с маркировкой
peqGOLD Taq all inclusiveVWR Peqlab01-1000Taq all inclusive для реакционных смесей ПЦР (реакционный буфер Y и S, dNTPs и MgCl2)
Primus 96 усовершенствованный градиентный термоамплификатор или peqStar96x Universal GradientPeqlabNAНаборы грунтовок изначально были установлены на усовершенствованном градиентном амплификаторе Primus 96. Поскольку этот амплификатор был довольно старым, мы проверили, являются ли наши наборы грунтовок эффективными и специфичными в тех же условиях, используя peqSta96x (который также мог имитировать старую модель). Тем не менее, испытания показали, что наши праймеры работают хорошо и по-прежнему специфичны (см. Koester et al. 2013) без использования моделирования старой машины.
Стандартные 96-луночные ПЦР-планшетыVWR Peqlab732-2879используются для проведения ПЦР-реакций.
Низкопрофильные полоски пробирки 0,15 мл с плоскими колпачковыми полоскамиVWR Peqlab732-3223Колпачковые полоски используются для закрытия ПЦР-планшетов.
AgarosePeqlab35-1020Используется для гель-электрофореза.
Микроволновая печьЛюбаяконическая колба NA
ЛюбаяNA
Измерительный цилиндрЛюбойNA
Горизонтальный электрофорез и соответствующие гребни с зубьямиЛюбойNAДля электрофореза в агарозном геле.
Электрофорез Источник питания PS3002Life TechnologiesNA
Раствор бромида этидия 1 %carlroth2218.1Используется для приготовления окрашивающей ванны для агарозных гелей.
Formamidecarlroth6749.1Необходим для денатурационного буфера для анализов SSCP.
Бромфенол синийAppliChemA3640.0010Необходим для загрузки красителя для электрофореза в агарозном геле.
Сахарозакарлрот4621.1Необходим для загрузки красителя для электрофореза в агарозном геле.
100 bp-DNA-Ladder extendedcarlrothT835.1В качестве стандартного размера для электрофореза в агарозном геле.
Система УФ-документированияAnyNAДля визуализации результатов гель-электрофореза.
Ротифорес NF-акриламид/Бис-раствор 40 % (29:1)carlrothA121.1Для приготовления полиакриламидных гелей.
Пероксидисульфат аммонияcarlroth9592.2Для приготовления полиакриламидных гелей.
откидные зажимы (32 мм)AnyNAДля приготовления полиакриламидных гелей.
Коробка из пластика квадратной формы (21&Times 6,5&Times 5 см)AnyNAДля приготовления полиакриламидных гелей.
Тетраметилэтилендиамин (TEMED)carlroth23.67.1Для приготовления полиакриламидных гелей.
СтаканAnyNA
RC 10 Цифровой охладительVWR462-0138Для анализа SSCP с использованием электрофореза в полиакриламидном геле.
Установка вертикального электрофореза P10DS (OWL Separation Systems)VWR700-2361Для анализа SSCP с использованием электрофореза в полиакриламидном геле.
Пластина из стекла с надрезомVWR730-0261Для анализов SSCP с использованием электрофореза в полиакриламидном геле.
Пластина из пустого стеклаVWR730-0260Для анализов SSCP с использованием электрофореза в полиакриламидном геле.
СпейсерыVWR730-0262Для анализов SSCP с использованием электрофореза полиакриламидным гелем.
Расческа с 25 зубьямиVWR730-0294Для анализа SSCP с использованием электрофореза в полиакриламидном геле.
Встряхивающая платформаAnyNAДля постоянного встряхивания окрашивающей ванны.
Краситель нуклеиновых кислот GelStar (Lonza Rockland, Inc.)Biozym850535 (50535)Для окрашивания полиакриламидных гелей.
GenomeLab DNA Size Standard Kit 400bpAB Sciex608098Для автоматизированного анализа фрагментов. Размерный станард для партии В.
GenomeLab DNA Size Standard Kit 600bpAB Sciex608095Для автоматизированного анализа фрагментов. Размерный станард для партии А.
Решение для загрузки образцов (SLS)AB Sciex608082Для автоматизированного анализа фрагментов.
Секвенционная пластина - 96 лунок Полипропиленовая ПЦР микропластинаCostar6551Для автоматизированного анализа фрагментов.
Планшетная центрифуга, PerfectSpin PPeqlabNA,используемая для раскрутки продуктов ПЦР.
Буферная пластина - 96 лунок EIA/RIA Прозрачный полистирол с плоским дном Необработанный микропланшетCorning9017Для автоматизированного анализа фрагментов.
Буфер для разделения GenomeLabAB Sciex608012Для автоматизированного анализа фрагментов.
Разделительный гель - LPAIAB Sciex608010Для автоматизированного анализа фрагментов.
Sequenzer - CEQ8000 Система генетического анализаBeckman CoulterNAДля автоматизированного анализа фрагментов.
GeneMarker V1.95SoftgeneticsNAДля анализа результатов автоматизированного анализа фрагментов.
весы точность пробирки смеситель NA VWR Мини-центрифуга

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Carreon-Martinez, L., Heath, D. D. Revolution in food web analysis and trophic ecology: diet analysis by DNA and stable isotope analysis. Mol Ecol. 9 (1), 25-27 (2010).
  2. Hardy, C. M., Krull, E. S., Hartley, D. M., Oliver, R. L. Carbon source accounting for fish using combined DNA and stable isotope analyses in a regulated lowland river weir pool. Mol Ecol. 19 (1), 197-212 (2010).
  3. Baxter, C. V., Fausch, K. D., Saunders, W. C. Tangled webs: reciprocal flows of invertebrate prey link streams and riparian zones. Freshwater Biol. 50 (2), 201-220 (2005).
  4. Baxter, C. V., Fausch, K. D., Murakami, M., Chapman, P. L. Fish invasion restructures stream and forest food webs by interrupting reciprocal prey subsidies. Ecol. 85 (10), 2656-2663 (2004).
  5. Traugott, M., Kamenova, S., Ruess, L., Seeber, J., Plantegenest, M. Empirically Characterising Trophic Networks: What Emerging DNA-Based Methods, Stable Isotope and Fatty Acid Analyses Can Offer. Adv. Ecol. Res. Vol 49: Ecological Networks in an Agricultural World. 49, Elsevier Academic Press Inc. 177-224 (2013).
  6. Diaz Arredondo, M. A., Guzman del Proo, S. A. Feeding habits of the spiny lobster (Panulirus interruptus Randall, 1840) in Bahia Tortugas, Baja California Sur. Cienc Mar. 21 (4), 439-462 (1995).
  7. Letourneur, Y., Galzin, R., Harmelin-Vivien, M. Temporal variations in the diet of the damselfish Stegastes nigricans (Lacepède) on a Réunion fringing reef. J Exp Mar Biol Ecol. 217 (1), 1-18 (1997).
  8. Akin, S., Winemiller, K. O. Seasonal variation in food web composition and structure in a temperate tidal estuary. Estuar Coast. 29 (4), 552-567 (2006).
  9. Redd, K. S., Jarman, S. N., Frusher, S. D., Johnson, C. R. A molecular approach to identify prey of the southern rock lobster. Bull Entomol Res. 98 (3), 233-238 (2008).
  10. Gergs, R. Dreissena polymorpha in Lake Constance: An example of a keystone engineer? Universität Konstanz. , (2009).
  11. Sheppard, S. K., Harwood, J. D. Advances in molecular ecology: tracking trophic links through predator-prey food-webs. Funct Ecol. 19 (5), 751-762 (2005).
  12. Jarman, S. N., Ward, R. D., Elliott, N. G. Oligonucleotide primers for PCR amplification of coelomate introns. Mar Biotechnol (NY). 4 (4), 347-355 (2002).
  13. Verma, S. K., Singh, L. Novel universal primers establish identity of an enormous number of animal species for forensic application. Mol Ecol Notes. 3 (1), 28-31 (2003).
  14. Deagle, B. E., et al. Molecular scatology as a tool to study diet: analysis of prey DNA in scats from captive Steller sea lions. Mol Ecol. 14 (6), 1831-1842 (2005).
  15. Jarman, S. N., Deagle, B. E., Gales, N. J. Group-specific polymerase chain reaction for DNA-based analysis of species diversity and identity in dietary samples. Mol Ecol. 13 (5), 1313-1322 (2004).
  16. Jarman, S. N., Redd, K. S., Gales, N. J. Group-specific primers for amplifying DNA sequences that identify Amphipoda, Cephalopoda, Echinodermata, Gastropoda, Isopoda, Ostracoda and Thoracica. Mol Ecol Notes. 6 (1), 268-271 (2006).
  17. Hayashi, K., Yandell, D. W. How sensitive is PCR-SSCP? Hum Mutat. 2 (5), 338-346 (1993).
  18. Glavač, D., Dean, M. Optimization of the single-strand conformation polymorphism (SSCP) technique for detection of point mutations. Hum Mutat. 2 (5), 404-414 (1993).
  19. Mülhardt, C. Der Experimentator Molekularbiologie / Genomics. , 7th ed, Spektrum Akademischer Verlag. Heidelberg. (2013).
  20. Lee, S. V., Bahaman, A. R. Discriminatory Power of Agarose Gel Electrophoresis in DNA Fragments Analysis. Gel Electrophoresis - Principles and Basics. , InTech. (2012).
  21. Wang, X. W., et al. A new electrophoresis technique to separate microsatellite alleles. Afr J Biotechnol. 8 (11), 2432-2436 (2009).
  22. Gemmer, I., Gergs, R. Characterization of the first twelve microsatellite loci for the amphipod Gammarus roeselii (Crustacea: Amphipoda). Conserv Genet Resour. 5 (4), 955-957 (2013).
  23. Olafsson, K., Hjorleifsdottir, S., Pampoulie, C., Hreggvidsson, G. O., Gudjonsson, S. Novel set of multiplex assays (SalPrint15) for efficient analysis of 15 microsatellite loci of contemporary samples of the Atlantic salmon (Salmo salar). Mol Ecol Resour. 10 (3), 533-537 (2010).
  24. Baric, S., Hollrigl, A., Fureder, L., Petutschnig, J., Dalla Via, J. First analysis of genetic variability in Carinthian populations of the white-clawed crayfish Austropotamobius pallipes. Bull. Fr. Peche Piscicult. (380-381), 977-990 (2006).
  25. Koester, M., Gergs, R. No evidence for intraguild predation of Dikerogammarus villosus (Sowinsky, 1894) at an invasion front in the Untere Lorze, Switzerland. Aquat Invasions. 9 (4), 489-497 (2014).
  26. Sonnenberg, R., Nolte, A. W., Tautz, D. An evaluation of LSU rDNA D1-D2 sequences for their use in species identification. Front Zool. 4 (6), 6(2007).
  27. Koester, M., Bayer, B., Gergs, R. Is Dikerogammarus villosus (Crustacea, Gammaridae) a 'killer shrimp' in the River Rhine system? Hydrobiologia. 768 (1), 299-313 (2016).
  28. Koester, M., Claßen, S., Gergs, R. Establishment of group-specific PCR primers for the identification of freshwater macroinvertebrates. Conserv Genet Resour. 5 (4), 1091-1093 (2013).
  29. Martin, P., Koester, M., Schynawa, L., Gergs, R. First detection of prey DNA in Hygrobates fluviatilis (Hydrachnidia, Acari): a new approach for determining predator-prey relationships in water mites. Exp Appl Acarol. 67 (3), 373-380 (2015).
  30. Deagle, B. E., et al. Studying Seabird Diet through Genetic Analysis of Faeces: A Case Study on Macaroni Penguins (Eudyptes chrysolophus). PLoS One. 2 (9), e831(2007).
  31. Sint, D., Niederklapfer, B., Kaufmann, R., Traugott, M. Group-Specific Multiplex PCR Detection Systems for the Identification of Flying Insect Prey. PLoS One. 9 (12), e115501(2014).
  32. Zarzoso-Lacoste, D., Corse, E., Vidal, E. Improving PCR detection of prey in molecular diet studies: importance of group-specific primer set selection and extraction protocol performances. Mol Ecol Resour. 13 (1), 117-127 (2013).
  33. Vestheim, H., Jarman, S. Blocking primers to enhance PCR amplification of rare sequences in mixed samples - a case study on prey DNA in Antarctic krill stomachs. Front Zool. 5 (1), 12(2008).
  34. Harper, G. L., et al. Rapid screening of invertebrate predators for multiple prey DNA targets. Mol Ecol. 14 (3), 819-827 (2005).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

SSCP

Похожие статьи