Надежный вывод клеток, индуцированных человеком, с плюрипотентными стволовыми клетками (hiPS), был достигнут за счет использования неинтегрирующего вектора передачи вируса Сендай (SeV), опосредованного перепрограммированием дермальных фибробластов. Поддержание клеток hiPS и расширение клона было выполнено с использованием безсеносных и химически определенных условий культивирования с рекомбинантной матрицей ламинана человека 521 (LN-521) и средой Essential E8 (E8).
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Интеграция свободной деривации индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток с использованием матрицы Laminin 521
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Ксено-свободные и полностью определенные условия являются ключевыми параметрами для надежной и воспроизводимой генерации однородных человеческих клеток с плюрипотентными стволовыми клетками (hiPS). Обслуживание клеток hiPS на фидерных клетках или неопределенных матрицах восприимчиво к периодическим отклонениям, патогенному загрязнению и риску иммуногенности. Использование определенной рекомбинантной матрицы человеческого laminin 521 (LN-521) в сочетании с безсеноновыми и определенными рецептурами среды снижает вариабельность и позволяет обеспечить последовательную генерацию клеток hiPS. Вектор вируса Сендай (SeV) представляет собой неинтегрирующую систему на основе РНК, поэтому можно обойти проблемы, связанные с потенциальным разрушительным эффектом на интеграционные векторы целостности генома. Кроме того, эти векторы продемонстрировали относительно высокую эффективность в перепрограммировании дермальных фибробластов. Кроме того, ферментативный односегментный пассаж клеток облегчает гомогенное поддержание клеток hiPS без существенного предшествующего опыта стволовых клетокКультуру. Здесь мы описываем протокол, который был широко протестирован и разработан с акцентом на воспроизводимость и простоту использования, обеспечивая надежный и практичный способ создания определенных и безсеносных человеческих hiPS-клеток из фибробластов.
Введение
Поскольку первый вывод клеточных линий hiPS по Takahashi et al. 1 , 2 , hiPS-клетки предоставили полезный инструмент для моделирования болезней, обнаружения лекарств и в качестве исходного материала для создания клеточной терапии в регенеративной медицине. 3 . Культура клеток hiPS уже давно зависит от совместной культивирования с фибробластовыми фидерными клетками 4 , 5 или Matrigel 6 и со средними препаратами, содержащими фетальную бычью сыворотку (FBS). Отклонения от партии к партии являются о....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Сбор материала пациента и вывод клеток hiPS утверждается Советом по обзору этики, Стокгольм, 28 марта 2012 года, Регистрационный номер: 2012 / 208-31 / 3. Этапы клеточной культуры должны выполняться в шкафах биобезопасности, если не указано иное. При работе с клетками всегда применяйте методы стерильной обработки. Перед запуском дайте медикаментам, планшетам и реагентам достичь комнатной температуры. Инкубируйте клетки при 37 ° С, 5% СО 2 при высокой влажности.
1. Выделение фибробластов человека из дермальной биопсии
- Препараты культуральной среды, пищеварительные ферменты, покрытие посуды и инструменты для ра....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
От биопсии до клеток hiPS
Весь процесс от биопсии к установленным клеткам hiPS, свободный от вектора перепрограммирования и готовый к характеристике, занимает приблизительно 16 недель ( рис. 1 ). Более подробная временная шкала указана на рисунке 2A . Приблизительно 4 недели необходимо для создания и расширения культур фибробластов. Первые колонии клеток hiPS начали появ.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Ожидаемым результатом этого протокола является успешное создание нескольких клонированных клеточных линий hiPS. Важно отметить, что способ поддержания и расширения установленных hiPS-клеток, описанный здесь, является надежным и может быть осуществлен с небольшим предварительным опытом культивирования стволовых клеток. Известно, что ферментативный односегментный пассаж с ROCKi вместе с матрицей LN-521 поддерживает клетки как кариотипически нормальные, плюрипотентные и легко способные дифференцироваться, избегая индуциров.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов для сообщения.
Благодарности
Эта работа была поддержана финансирующими агентами SSF (B13-0074) и VINNOVA (2016-04134).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Dispase | Life Technologies | 171105-041 | Биопсия расщепления |
| Коллагеназа | Sigma | C0130 | Биопсия расщепления |
| Желатин | Sigma | G1393 | Матрица фибробластов |
| IMDM | Life Technologies | 21980002-032 | Фибробластная среда |
| FBS | Invitrogen | 10270106 | Фибробластная среда |
| Пенициллин/стрептомицин | Life Technologies | 15070-063 | Антибиотик |
| Эссенциал 8 сред | ThermFisher Scientific | A1517001 | iPS среды для клеточных культур |
| LN-521 | Biolamina | LN521-03 | iPS матрица для клеточной культуры |
| TrypLE select 1X | ThermoFisher Scientific | 12563011 | Диссоциация реагент |
| ингибитор рокиназы Y27632 | Millipore | SCM075 | Ингибитор ро-киназы (ROCKi) |
| CytoTune – iPS 2.0 набор для перепрограммирования | Life Technologies | A1377801 | Sendai вирус |
| перепрограммирования 35 мм чашка для культуры тканей | Sarstedt | 83.3900.300 | Культура клеток |
| 60 мм чашки для культуры тканей | Sarstedt | 83.3901.300 | Культура клеток |
| 24 лунки планшеты для культуры тканей | Sarstedt | 83.3922.300 | Колбы |
| культуры клеток T25 для тканевых культур | VWR | 734-2311 | Пробирки для клеточных культур |
| 15 мл Пробирки | центрифуг | Corning | 430791 |
| 1,5 мл Eppendorf | 0030123.301 | 1,5 мл пробирки | |
| CoolCell cell LX | Biocision | BCS-405 | Контейнер для заморозки |
| DMSO | Sigma | D2650-100ml | Фибробласты заморозка |
| Cryovials 1,8 мл | VWR | 479-6847 | Cryovials |
| PSC Cryopreservation Kit | Gibco | A2644601 | PSC CryomediumRevitaCell добавка |
| Trypsin-EDTA (0,05%) | ThermoFisherScientific | 25300054 | Фермент диссоциации фибробластов |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 31331-028 | Разбавитель |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | PBS |
| HBSS | ThermoFIsher Scientific | 14025-050 | Препарат для биопсии |
| Гемоцитометр | Sigma | BRAND, 718920 | Парапленка для подсчета клеток |
| VWR | 291-1213 | Уплотнительные пластины для хранения |
Ссылки
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Jin, Z. B., Okamoto, S., Xiang, P., Takahashi, M. Integration-free induced p....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
